CN111795957A - 一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用，同时提供近红外荧光蛋白iRFP713在近红外二区的表征；近红外荧光蛋白的发射波长在比传统的GFP类荧光蛋白发射光谱(～400‑600nm)更长的近红外区域，因此更适用于活体内生物成像。与目前GFP类荧光蛋白的生物成像以及近红外荧光蛋白在近红外一区(～700‑900nm)的成像应用相比，本发明的应用具有显著的穿透深度和空间分辨率的优势，将大大提高活体成像的穿透深度和信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及生物荧光成像技术领域，尤其涉及一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物 进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用。
背景技术
生物荧光成像技术是指利用生物组织或结构发出的荧光进行成像，用于研究生物学过程 的方法。通过使用各种荧光标记物，荧光成像可以实现细胞水平、组织水平以及活体水平的 成像研究，具有分辨率高、损伤小、成像快等优势，拥有广阔的应用前景。
荧光探针的使用是荧光成像技术中的关键一环。目前常见的荧光探针包括小分子荧光染 料、荧光纳米颗粒以及各种荧光蛋白。这几种探针中，化学修饰合成的纳米颗粒和荧光染料 的荧光亮度虽然强，但其劣势也非常明显。一方面，它们不可再生，也不能随着细胞的复制 而复制，因此并不适合用于研究一些需要长时间观察的生物学过程，比如肿瘤的发生发展以 及转移等。另一方面，纳米颗粒和荧光染料在体内的运输过程中，经常会发生积聚沉淀，不 易被排出体外，从而影响机体代谢。而荧光蛋白由于其本质是生物蛋白质，因此具备很好的 生物兼容性，具有较低的细胞毒性。同时荧光蛋白能够特异性表达，使得荧光成像具备提供 特异性的位置信息的能力，因此荧光蛋白成像已经广泛应用于生命科学的研究。
目前，荧光蛋白成像在分子水平、细胞水平的研究应用已经极其成熟了。然而，在深层 组织成像以及活体成像上还面临着很大的挑战，主要原因是成像时信号光的散射，组织对信 号光吸收和自发荧光的干扰。比如，基于绿色荧光蛋白等传统荧光蛋白(GFP类荧光蛋白) 的成像系统早已被开发改进，但由于其发射光谱的局限(仅仅400-600nm)，在组织细胞成像 时背景信号较强，效果很不理想。而解决体内成像问题的方法就是使用发射波长在更长的近 红外区域的荧光蛋白探针，即近红外荧光蛋白。
目前，近红外荧光蛋白成像是生物荧光成像的研究热点之一。近红外荧光蛋白利用胆绿 素作为发色团克服了GFP类荧光蛋白发色团基本原理上的限制。通过定向的进化，近红外荧 光蛋白的激发和发射波长均在近红外“光学窗口”。在该波段内，信号光的散射较小、组织的 自发荧光通常较低，因此具有更好的光穿透性，成像时的穿透深度更大，信噪比更高。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进 行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物 进行近红外二区荧光成像的方法，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物比GFP类荧光蛋白在 近红外二区具有更长的荧光拖尾，近红外荧光蛋白衍生物或类似物在900nm以上具有可观的 荧光信号，实现近红外荧光蛋白衍生物或类似物在近红外二区荧光成像。
进一步地，所述的近红外二区是波长在900-1700nm区间。
进一步地，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720，以及单体近红外荧光蛋白miRFP670、miRFP703、miRFP709。
一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的装置，该装置包括 近红外二区宏观成像系统及近红外二区显微成像系统。
所述近红外二区宏观成像系统包括透镜、光源、35mm定焦镜头、探测器和长通滤光片， 所述光源为激光或LED；在宏观成像系统中，透镜设置在光源后，对激光器或LED的出射光 进行扩束，使样品被均匀激发。借助35mm定焦镜头收集样品发出的荧光信号。根据需要选 择不同截止波长的长通滤光片，并将其设置在定焦镜头与探测器之间以滤除背景信号。
所述近红外二区显微成像系统包括透镜、光源、正置显微镜落射式照明器、二向色镜、 物镜、长通滤光片和探测器；在显微成像系统中，准直透镜设置在正置显微镜落射式照明器 及激光器或LED出射光之间。在落射式照明器中、物镜的正上方，设置长通短反二向色镜对 激发光反射。在物镜前焦面的荧光信号经过设置在样品上方的物镜收集，并通过物镜上方的 二向色镜。在管透镜及二向色镜之间设置不同截止波长的长通滤光片滤除背景，探测器靶面 设置在管透镜上方。
一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的应用，包括细胞成 像应用、肠道菌群成像应用以及肿瘤标记成像应用。
本发明的有益效果：现有技术中，近红外荧光蛋白在近红外一区活体成像信噪比、穿透深 度及分辨率均较低，无法达到很好的成像效果。本发明首次发现并证实了近红外荧光蛋白 iRFP在近红外二区(900-1700nm)的荧光发射足够用于荧光成像并取得很好的成像效果。基于 这种成像特质，本发明提出了近红外荧光蛋白iRFP在近红外二区的全新应用，由此克服了近 红外荧光蛋白在近红外一区活体成像信噪比低和穿透深度低及分辨率低的应用局限，突破了 传统近红外二区荧光探针在长时间生命活动观察中的局限性；然后利用其在近红外二区的荧 光性能，实现了高灵敏度和高穿透性的荧光成像技术。本发明通过分子生物学的方法纯化了 8种近红外荧光蛋白，进而详细对比了它们在近红外一区和近红外二区的成像效果，并根据 测试结果选择了近红外荧光蛋白iRFP713继续后续的活体内成像，证明了近红外荧光蛋白在 近红外二区具有显著提高的成像效果。
附图说明
图1是实施例2、3、4、5的检测系统图，其中图1(a)为宏观成像系统图，1(b)为 显微成像系统图。图中，1为电脑，2为InGaAs二维探测器，3为光源(激光器或LED)，4 为物平面，5为长通滤光片，6为35mm定焦镜头，7为扩束透镜，8为管透镜，9为长通短 反二向色镜，10为物镜，11为正置荧光显微镜落射式照明器；
图2为实施例1中的8种材料的吸收光谱；
图3为实施例1中的8种材料的荧光光谱，其中图3(a)为900-1600nm光谱，图3(c)为1000-1600nm光谱；
图4为实施例1中的0.3mg mL-1明场和使用623nm LED、光照强度～60mW cm-2激光照 射，经过1000LP滤光片后成像的荧光强度对比图；
图5是实施例2中的模拟iRFP713在生物组织中穿透深度的近红外一/二区的对比图；
图6是实施例3的细菌表达iRFP的近红外二区荧光成像结果图；
图7是实施例3的细菌表达GFP和iRFP713的近红外二区荧光对比图；
图8是实施例3的表达iRFP713的细菌在BALB/c小鼠体内的近红外二区成像效果图； 图中左边一组为未开腹腔的成像效果，右组为打开腹腔后的成像效果，每组从左往右，从上 往下为按时间顺序的成像结果；
图9是实施例3的表达iRFP713的细菌在BALB/c小鼠体内近红外二区成像视频的截取 的单帧图像；
图10是实施例4的稳定表达几种iRFP的细胞近红外二区荧光成像结果图；
图11是实施例4中稳定表达iRFP713和luciferase的LM3细胞近红外二区成像结果图；
图12是实施例5中肿瘤小鼠的近红外二区和luciferase化学发光成像结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。
具有较大近红外二区荧光分量的近红外荧光蛋白iRFP及其衍生物或类似物都可以实现 在近红外二区(900-1700nm)的荧光成像应用。由于iRFP荧光蛋白的峰值荧光波长全部落 在600-800nm内，目前对于该类蛋白的开发完全局限于700-900nm的近红外一区成像。经 过验证，iRFP荧光蛋白在900nm以上仍然具有可观的荧光信号，尤以iRFP713为甚，这是 由于iRFP713较大的荧光发射总量(全波段)及在近红外二区较长的荧光拖尾造成的。
本实例涉及到两套实验室自建光学系统：近红外二区宏观成像系统及近红外二区显微成 像系统。如图1(a)，宏观成像系统中，利用透镜7对激光或LED光进行扩束，使物平面4 上的样品被均匀激发。借助35mm定焦镜头6收集样品发出的荧光信号，并通过探测器2前不同截止波长的长通滤光片5滤除背景，探测器2上连接有电脑1。图1(b)，显微成像系统中，经透镜准直后的激光或LED光在正置显微镜落射式照明器11中传输、聚焦，经过二向 色镜9反射，最终聚焦于物镜10后焦面，并通过物镜10均匀的照射在物平面4上的样品上。 样品发出的荧光信号经过物镜10收集，再由不同截止波长的长通滤光片5滤除背景、管透镜 8聚焦最终成像在探测器2靶面，探测器2上连接有电脑1。
实施例1主要对几种iRFP(iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、miRFP670、 miRFP703和miRFP709)的吸收光谱，发射光谱以及荧光亮度进行测试和对比，说明iRFP713 具有最高的荧光强度。实施例2主要说明近红外二区下iRFP的组织穿透深度优于近红外一区， 可以证明近红外荧光蛋白iRFP可用于近红外二区荧光成像(结果如图2所示)；实施例3-5 主要说明近红外荧光蛋白iRFP在细胞、组织以及活体水平上的近红外二区荧光成像。
实施例1
利用紫外-可见光分光光度计(Shimadzu 2550UV-vis scanningspectrophotometer)测试了 iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、miRFP670、miRFP703和miRFP709的吸 收光谱(300-900nm)。如图2所示，吸收峰波长最长的是iRFP720。由此可见，虽然1000nm 以上的荧光占比在8种蛋白不属最优，但iRFP713在1000nm以上的总体荧光强度明显优于 其他近红外荧光蛋白。
利用荧光光谱仪(FLS980，Edinburgh Instruments Ltd.)测试了iRFP670、iRFP682、iRFP702、 iRFP713、iRFP720、miRFP670、miRFP703和miRFP709的近红外波段的发射光谱。如图3 (a)所示，荧光峰值波长最长的是iRFP720。图3(b)和图3(c)为900-1600nm及1000-1600 nm波段的光谱图，由此可见，几种蛋白都有一定分量的近红外荧光。
利用InGaAs相机及宏观成像系统(图1(a))直接记录了iRFP670、iRFP682、iRFP702、 iRFP713、iRFP720、miRFP670、miRFP703和miRFP709的荧光图像。蛋白浓度为0.3mg mL-1， 明场图像为卤素灯照明下拍摄，荧光图像为623nm LED照射(功率密度：～60mWcm-2)下， 经过1000nm长通滤光片5滤除背景后拍摄。如图4所示，iRFP713显示出最优的荧光强度。
实施例2
将iRFP纯蛋白稀释成1mg mL-1。使用玻璃毛细管试管吸取纯蛋白溶液，使之充满，并 用胶带粘在圆柱皿的底部。圆柱皿中充满了不同体积的1％脂质体(lntralipid)，用于模拟生 物组织中光散射的波长依赖性。毛细血管的深度根据圆柱皿的底面积以及脂质体的体积计算 得到。检测时使用激光经过扩束后均匀照射在圆柱皿上。本例中分别用800nm、900nm、1100 nm长通滤光片(Thorlabs)、对深度0mm、2mm、4mm、6mm的毛细管成像，图像经过统 一地增强处理后，结果如图5所示，可见深度增加后，使用不同波长的图像清晰程度差异明 显，波长越长，散射越小。
实施例3
将iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、miRFP670、miRFP703和miRFP709的质粒分别导入到大肠杆菌中，在LB培养基中培养使之表达这些荧光蛋白。将细菌连同培养基置入联排管中，使用623nm LED为激发光源3照射样品，功率密度为～60mW cm-2，使 用35mm定焦镜头6收集、并以1000nm长通滤光片5滤得NIR-II荧光信号，探测器2为 SW640短波红外相机(Tekwin，China)。如图6和图7所示，其中BF为明场拍摄成图像。
将成功导入并表达iRFP713近红外荧光蛋白的大肠杆菌扩增培养。抓取BALB/c小鼠， 用灌胃针吸取大肠杆菌进行灌胃处理，并记录时间。实验使用695nm激光为激发光源3照 射样品，功率密度为～60mW cm-2，使用35mm定焦镜头6收集、并以1000nm长通滤光片5 滤得NIR-II荧光信号，探测器2为SW640短波红外相机(Tekwin，China)进行胃肠道造影。 分别在0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h时拍摄照片。如图8所示，iRFP713-大肠杆菌 在小鼠体内的成像清晰，随着时间的推移，菌在胃肠道内的定位不断发生改变。而且，尽管 有皮肤遮挡，NIR-II成像依然可以在一定程度上对肠道轮廓细节清晰成像。
为证明NIR-II荧光成像的良好实时性，在肠胃道造影过程中，对灌菌的小鼠拍摄一段肠 胃蠕动视频，按960毫秒间隔提取帧，结果如图9所示，短时间内随着肠道的蠕动，大肠杆 菌在肠道内的运动轨迹清晰可见。
实施例4
将8个质粒分别转染HEK293细胞，使之表达相应的近红外荧光蛋白。根据实验组别设 置，于成像前2小时加入胆绿素BV(25μM)。成像时利用落射式照明宽场荧光显微系统，以623nm LED为激发光源3均匀照明，以25X红外增透物镜(XLPLN25XWMP2，NA＝1.05，Olympus)收集荧光信号，成像相机为SW640短波红外相机(Tekwin，China)，相机前经1100nm长通滤光片5滤光。结果如图10所示。
实施例5
进一步，构建稳定表达iRFP713的LM3肿瘤细胞系，并且建立小鼠原位肝癌模型。结果 如图11所示。利用iRFP713蛋白的优势，可以对小鼠肿瘤持续观察。使用695nm激光为激发光源3照射样品，功率密度为～60mW cm-2，使用35mm定焦镜头6收集、并以1000nm 长通滤光片5滤得NIR-II荧光信号，探测器2为SW640短波红外相机(Tekwin，China)， 分别对小鼠背部、右边、正面进行拍摄。经过进一步与luciferase化学发光成像结果对比，可 以证实，iRFP713蛋白的NIR-II成像具有更高的空间分辨能力。结果如图12所示。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要 求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物比GFP类荧光蛋白在近红外二区具有更长的荧光拖尾，近红外荧光蛋白衍生物或类似物在900nm以上具有可观的荧光信号，实现近红外荧光蛋白衍生物或类似物在近红外二区荧光成像。
2.根据权利要求1所述的利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述的近红外二区是波长在900-1700nm区间。
3.根据权利要求1所述的利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720，以及单体近红外荧光蛋白miRFP670、miRFP703、miRFP709。
4.一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的装置，其特征在于，该装置包括近红外二区宏观成像系统及近红外二区显微成像系统。
所述近红外二区宏观成像系统包括透镜、光源、35mm定焦镜头、探测器和长通滤光片，所述光源为激光或LED；在宏观成像系统中，透镜设置在光源后，对激光器或LED的出射光进行扩束，使样品被均匀激发。借助35mm定焦镜头收集样品发出的荧光信号。根据需要选择不同截止波长的长通滤光片，并将其设置在定焦镜头与探测器之间以滤除背景信号。
所述近红外二区显微成像系统包括透镜、光源、正置显微镜落射式照明器、二向色镜、物镜、长通滤光片和探测器；在显微成像系统中，准直透镜设置在正置显微镜落射式照明器及激光器或LED出射光之间。在落射式照明器中、物镜的正上方，设置长通短反二向色镜对激发光反射。在物镜前焦面的荧光信号经过设置在样品上方的物镜收集，并通过物镜上方的二向色镜。在管透镜及二向色镜之间设置不同截止波长的长通滤光片滤除背景，探测器靶面设置在管透镜上方。
5.一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的应用，其特征在于，包括细胞成像应用、肠道菌群成像应用以及肿瘤标记成像应用。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105624192A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-06-01 | 北京市结核病胸部肿瘤研究所 | 稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备 |
| CN107907514A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-04-13 | 上海凯创生物技术有限公司 | 心肌钙蛋白i/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶近红外荧光检测试剂卡、试剂盒及其用途 |
| CN108474789A (zh) * | 2015-10-26 | 2018-08-31 | 巴克曼实验室国际公司 | 聚合物探针和方法 |
| CN110386977A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-10-29 | 广州天宝颂原生物科技开发有限公司 | 一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2535981C1 (ru) * | 2013-08-13 | 2014-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Нуклеиновая кислота, кодирующая основанный на fret дальне-красный биосенсор для измерения активности каспазы 3 внутри клеток |
| CN111040037A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-04-21 | 天津大学 | 一种近红外荧光蛋白与rgd多肽的融合蛋白、基因、载体和应用 |
| CN111269941B (zh) * | 2020-02-27 | 2022-02-11 | 南京鼓楼医院 | 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法 |
| CN111795957B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-07-08 | 浙江大学 | 一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108474789A (zh) * | 2015-10-26 | 2018-08-31 | 巴克曼实验室国际公司 | 聚合物探针和方法 |
| CN105624192A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-06-01 | 北京市结核病胸部肿瘤研究所 | 稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备 |
| CN107907514A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-04-13 | 上海凯创生物技术有限公司 | 心肌钙蛋白i/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶近红外荧光检测试剂卡、试剂盒及其用途 |
| CN110386977A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-10-29 | 广州天宝颂原生物科技开发有限公司 | 一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 蒲源 等: "荧光纳米材料及其生物成像应用", 《中国材料进展》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022001520A1 (zh) * | 2020-06-30 | 2022-01-06 | 浙江大学 | 一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用 |
| CN113049554A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-06-29 | 吉林大学第一医院 | 一种近红外二区生物样本成像装置、生物样本成像的方法 |
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