CN111778318B

CN111778318B - 一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法及系统

Info

Publication number: CN111778318B
Application number: CN202010660827.0A
Authority: CN
Inventors: 马岚; 王东风; 石铭; 吴峰
Original assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-07-10
Also published as: CN111778318A

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法及系统，首先将待测样本和检测试剂形成多个相互独立的微反应单元。微反应单元中含有或不含一个至数个由待测核酸样本提供的核酸分子，每个微反应单元中均含有适量借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的各个组分。将微反应单元置于适当的温度下进行反应。当微反应单元中含有具有目标序列的核酸分子时可以检测到光信号变化。最后，通过对发生光信号变化的微反应单元计数或者根据分布原理及阳性微滴的比例，计算出具有目标序列的核酸分子的浓度或拷贝数。本发明不仅可以实现待测核酸的分子检测，而且提高了检测的灵敏度。

Description

一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法及系统

技术领域

本发明涉及一种核酸检测方法及系统，具体是关于一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法及系统。

背景技术

当前核酸分子的定量有两种方法：①光度法基于核酸分子的吸光度来定量；②实时荧光定量PCR(即Real-time Quantitative PCR，qPCR)基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数。

CRISPR/Cas是大多数细菌及古细菌基于RNA的后天免疫系统。由CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas技术已成为一种强大的基因编辑工具，广泛应用于基因功能研究和基因修饰与治疗。除了作为基因编辑工具，一些Cas蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成一种快速、低成本的核酸检测工具，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。现有的基于CRISPR/Cas系统Cas蛋白附属切割活性的核酸检测方法多是对整体样本的反应及测试，需要依靠标准曲线或参照信号来测定核酸，因此对待测核酸含量较低的样本无法进行有效检测。

发明内容

针对上述问题，本发明的其中一个目的是提供一种基于CRISPR/Cas系统Cas蛋白附属切割活性的核酸分子检测方法，该方法无需采用标准曲线或参照信号就可以进行检测，实现了待测核酸的分子检测，提高了检测的灵敏度；本发明的另一个目的是提供一种用于实现上述方法的核酸分子检测系统。

第一方面，本发明提供的基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法，为方法Ⅰ或方法Ⅱ。

所述方法Ⅰ包括如下步骤：在微反应单元中进行反应；部分微反应单元不含有由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有1个由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有2个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；借助CRISPR/Cas系统检测微反应单元中是否含有目标序列；所述目标序列为目标生物的特异性序列。

所述方法Ⅱ包括如下步骤：在微反应单元中进行反应；每个微反应单元含有1个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；借助CRISPR/Cas系统检测微反应单元中是否含有目标序列；所述目标序列为目标生物的特异性序列。

所述方法Ⅰ包括如下步骤：

(1)生成微反应单元，然后在微反应单元中进行反应；部分微反应单元不含有由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有1个由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有2个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；每个微反应单元中，均含有借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的各个组分；

(2)通过检测微反应单元的报告光信号变化获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

所述方法Ⅱ包括如下步骤：

(1)生成微反应单元，然后在微反应单元中进行反应；每个微反应单元含有1个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；每个微反应单元中，均含有借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的各个组分；

所述方法Ⅰ还包括如下步骤：检测微反应单元的报告光信号变化后，通过特定方法，分析获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

所述方法Ⅱ还包括如下步骤：检测微反应单元的报告光信号变化后，通过特定方法，分析获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

所述特定方法为对产生报告光信号的所述微反应单元计数或者所述特定方法为通过特定分布原理及阳性微滴的比例；所述特定分布原理包括泊松分布原理和/或二项分布原理。示例性的，所述特定分布原理为泊松分布原理或二项分布原理。所述特定分布原理也可为其他常见数学分布原理。

借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分包括gRNA、Cas蛋白和探针分子；gRNA为单链RNA，具有靶序列结合区和Cas蛋白结合区；gRNA和Cas蛋白形成复合体；复合体识别并结合gRNA的靶序列后，Cas蛋白的附属切割活性被激活，从而切割探针分子引起光信号变化；所述靶序列是基于所述目标序列设计的。

所述目标序列可为一种目标生物的一种特异性序列。

所述目标序列为一种目标生物的一种特异性序列时,微反应单元中具有1种gRNA。

所述目标序列为一种目标生物的一种特异性序列时,微反应单元中具有m种Cas蛋白和k种探针。m、k为1以上的自然数。

所述目标序列也可为一种目标生物的n种特异性序列。n为2以上的自然数。

所述目标序列为一种目标生物的n种特异性序列时,微反应单元中具有n种gRNA。n为2以上的自然数。

所述目标序列为一种目标生物的n种特异性序列时,微反应单元中具有m种Cas蛋白和k种探针。m、k为1以上的自然数。

所述目标序列可为多种目标生物的一种特异性序列。例如，对于多种流感病毒毒株具有普适性但对于流感病毒具有特异性的序列。

所述目标序列为多种目标生物的一种特异性序列时,微反应单元中具有1种gRNA。

所述目标序列为多种目标生物的一种特异性序列时,微反应单元中具有m种Cas蛋白和k种探针。m、k为1以上的自然数。

所述目标序列也可为n种目标生物的n种特异性序列。n为2以上的自然数。

所述目标序列为n种目标生物的n种特异性序列时,微反应单元中具有n种gRNA。n为2以上的自然数。

所述目标序列为n种目标生物的n种特异性序列时,微反应单元中具有m种Cas蛋白和k种探针。m、k为1以上的自然数。

所述微反应单元中还含有核酸扩增所需的各个组分。

所述微反应单元是通过微孔板的微孔形成的微滴，或者，所述微反应单元是通过微滴化形成的微滴。

所述微滴化是通过油相切割水相形成的。

所述微滴化，水相为分散相，油相为连续相，形成油包水的液滴。

示例性的，油相可为矿物油(石蜡油)、植物油、其它油性分子材料等。

所述微反应单元是将A溶液和B溶液进行微滴化得到的微滴；

所述A溶液中含有待测核酸样本；

所述B溶液中含有gRNA和Cas蛋白。

所述A溶液和/或所述B溶液中含有探针分子。

所述A溶液中还含有扩增靶序列所需的引物对、dNTPs和NTPs；

所述B溶液中还含有扩增靶序列所需的酶。

微反应单元可为：将待测核酸样本和借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分混合，然后进行微滴化，得到微液滴。

微反应单元可为：将待测核酸样本和借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分和核酸扩增所需的组分混合，然后进行微滴化，得到微液滴。

微反应单元也可为：将两种以上溶液分别注入微反应单元生成装置，然后进行微滴化，得到的该两种以上溶液混合的微液滴。待测核酸样本存在于一种溶液。其余溶液提供借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分。其余溶液提供借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分和核酸扩增所需的组分。

微反应单元也可为：将两种以上溶液同时进行混合和微滴化，得到该两种以上溶液混合的微液滴。待测核酸样本存在于一种溶液。其余溶液提供借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分。其余溶液提供借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分和核酸扩增所需的组分。

Cas蛋白的附属切割：Cas蛋白不仅具有对靶标核酸分子具有切割活性，而且还具有切割非靶标核酸分子的活性，这种切割被称为附属切割。

Cas蛋白的附属切割：Cas蛋白不仅具有对靶标核酸分子具有切割活性，而且还具有切割非靶标核酸分子的活性，这种非特异性切割被称为附属切割。

光信号变化可为由不发光至发光的变化，也可为由发光至不发光的变化，也可为光颜色的变化等等。

所述探针分子可以为单链核酸分子，一端具有报告光基团，另一端具有淬灭基团。探针被切割后释放报告光基团。所述报告光基团可为被激发后产生光信号的报告光基团，也可为无需激发即可产生光信号的报告光基团。示例性的，所述报告光基团可为荧光基团。示例性的，所述探针分子的5’末端具有6-羧基荧光素(荧光基团)，3’末端具有4-[4-(二甲基氨基)苯基偶氮]苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(荧光淬灭基团)。

所述探针分子为单链核酸分子，一端具有感光物质，另一端具有报告光基团。所述感光物质在被激发光激发后能够释放出活性物质，所述活性物质在其作用距离范围内能够使报告光基团产生光信号。探针被切割后感光物质和报告光基团被分离，使得感光物质和报告光基团的距离大于活性物质的作用距离，感光物质被激发光激发后释放出的活性物质不能使报告光基团产生光信号。示例性的，所述感光物质可为光敏剂。示例性的，所述探针分子的5’端末端具有酞菁(受光照后释放出单线态氧)，3’端末端具有二甲基噻吩衍生物(报告光基团，接收单线态氧能够发出紫外光)。

所述探针分子可为核酸分子。

核酸分子可为短链核酸分子，也可为长链核酸分子(通过空间构型使两个末端靠近)

核酸分子为单链核酸分子或双链核酸分子。

核酸分子为DNA分子或RNA分子。

核酸分子为单链DNA分子或单链RNA分子。

核酸分子为双链DNA分子或双链RNA分子或双链杂合子(单链DNA和单链RNA形成)。

所述探针分子由2-50个核苷酸组成。

检测微反应单元的报告光信号时，可以形成单层平铺进行检测。

检测微反应单元的报告光信号时，可以形成单层或单列进行检测。

检测微反应单元的报告光信号时，可以直接对微孔板进行检测。

CRISPR/Cas系统包括但不限于CRISPR/Cas13a系统、CRISPR/Cas12a系统等。

当CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas13a系统时，所述探针分子为单链RNA分子。

当CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas13a系统时，所述Cas蛋白为Cas13a蛋白(具体可为LwaCas13a蛋白)。

当CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas13a系统时，所述gRNA又称为crRNA。crRNA中具有靶序列结合区(引导区)和Cas蛋白结合区(scaford区)。

当CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas12a系统时，所述探针分子为单链DNA分子。

当CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas12a系统时，所述Cas蛋白为Cas12a蛋白。

当CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas12a系统时，所述gRNA又称为crRNA。crRNA中具有靶序列结合区和Cas蛋白结合区。

所述核酸扩增包括但不限于如下任一所述：重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymerase Amplification,RPA)、重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aidamplification，RAA)、RPA滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、链替代扩增反应(SDA)、依赖解旋酶恒温扩增技术(HAD)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、实时荧光核酸等温扩增(SAT)、单引物等温扩增技术(SPIA)、交叉引物扩增技术(CPA)等。

核酸扩增所需的组分包括扩增靶序列的引物对。核酸扩增所需的组分包括DNA聚合酶。核酸扩增所需的组分包括dNTPs和/或NTPs。核酸扩增所需的组分包括RNA聚合酶。核酸扩增所需的组分包括重组酶和单链DNA结合蛋白。

示例性的，所述RNA聚合酶可为T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶等。

扩增靶序列的引物对由正向引物和反向引物组成；正向引物中具有启动子(位于5’端)。示例性的，启动子可为T7启动子、T3启动子、M13启动子等。

检测微反应单元的报告光信号变化，可检测所有微反应单元的报告光信号变化，可以抽样检测部分微反应单元的报告光信号变化。

示例性的，所述反应的条件可为20-55℃反应10-120min。

示例性的，所述反应的条件可为37℃反应20min。

所述微反应单元可为微米量级的反应单元。

第二方面，本发明还保护一种用于实现以上任一所述方法的基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的系统，包括：

组件甲，用于生成多个微反应单元；

组件乙，包括容置多个所述微反应单元的检测场所；

组件丙，用于对所述检测场所内的反应后所述微反应单元的报告光信号变化进行检测；

组件丁，包括借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分。

借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分包括：gRNA、Cas蛋白和探针分子；gRNA为单链RNA，具有靶序列结合区和Cas蛋白结合区；gRNA和Cas蛋白形成复合体；复合体识别并结合gRNA的靶序列后，Cas蛋白的附属切割活性被激活，从而切割探针分子引起光信号变化；所述靶序列是基于所述目标序列设计的。

所述目标序列可为一种目标生物的一种特异性序列。

当CRISPR/Cas系统具体可为以上任一所述。

优选地，所述组件丁还包括：核酸扩增所需的各个组分。

核酸扩增具体可为以上任一所述。

核酸扩增所需的组分具体可为以上任一所述。

优选地，所述组件甲为微反应单元生成装置，所述微反应单元生成装置包括但不限于微孔板和微滴化装置，所述反应在微孔板或微滴化装置生成的微滴中进行。

优选地，所述组件乙为反应杯，此时将所述微反应单元转移到所述反应杯中，使所述微反应单元呈单层平铺在所述反应杯进行检测；

或者，所述组件乙为检测室，此时将所述微反应单元注入所述检测室中，使所述微反应单元呈单层平铺在所述检测室进行检测；

或者，所述组件乙为微流检测通道，此时将所述微反应单元注入到所述微流检测通道中，使所述微反应单元单层或单列通过所述微流检测通道进行检测；

又或者，所述组件乙为微孔板，所述微孔板具有多个微孔，每一所述微孔中容纳一个所述微反应单元，对所述微孔板微孔中的微反应单元进行检测。

优选地，所述组件丙包括检测装置，所述检测装置通过检测所述微反应单元的报告光信号，分析获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

优选地，所述检测装置对所述组件乙中的所述微反应单元受照射后发出的报告光信号进行检测，然后通过特定方法，计算出待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

优选地，所述检测装置为带有激发光源的报告光检测装置，即该报告光检测装置配套于需要激发的报告光基团，实现激发报告光基团和检测报告光信号变化两个功能；

或者，所述检测装置为不带有激发光源的报告光检测装置，即该报告光检测装置配套于无需激发的报告光基团，实现检测报告光信号变化一个功能。

第三方面，本发明还保护上述任一所述系统在检测核酸分子中的应用。

示例性的，以上任一所述目标生物可为流感病毒，具体可为Influenza A virus，更具体可为A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)。

示例性的，所述目标序列为A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的PA基因片段(如序列表的序列1所示)。

示例性的，gRNA(crRNA)的靶序列如序列表的序列2所示。

示例性的，正向引物如序列表的序列3所示，反向引物如序列表的序列4所示。

示例性的，gRNA(crRNA)如序列表的序列5所示。

示例性的，探针分子如下：5’-UAUAUUU-3’。

示例性的，以上任一所述目标生物可为EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)。

示例性的，所述目标序列为EB病毒的EBNA-1基因片段(如序列表的序列6所示)。

示例性的，gRNA(crRNA)的靶序列如序列表的序列7所示。

示例性的，gRNA(crRNA)如序列表的序列8所示。

示例性的，探针分子如下：5’-TTCTTA-3’。

示例性的：A溶液：B溶液：油相＝1:1:7(体积比)。

示例性的微滴为球型，直径125±10μm。

通过泊松分布原理及阳性微滴的比例，可以采用的公式包括但不限于实施例中采用的公式，公式中各个参数的含义同样包括但不限于实施例中的含义。例如公式中,N代表微液滴总数，实际应用中，N也可以代表抽样的微液滴数量或其他。例如公式中，F为代表阳性微液滴总数，实际应用中，F也可以代表抽样微液滴中的阳性微液滴数量或其他。例如公式中,n代表抽样微液滴数量，n也可以代表微液滴总数或其他。例如公式中，f代表抽样阳性微液滴数量，f也可以代表微液滴中的阳性微液滴总数或其它。

本发明提供的方法，首先将待测样本和检测试剂形成多个相互独立的微反应单元。微反应单元中含有或不含一个至数个由待测核酸样本提供的核酸分子；每个微反应单元中，均含有适量借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的各个组分。当需要进行核酸扩增时，还需保证每个微反应单元中均含有适量的扩增引物和扩增所需的酶。将微反应单元置于适当的温度下进行反应。当微反应单元中含有具有目标序列的核酸分子时可以检测到光信号变化。最后，通过对发生光信号变化的微反应单元计数或者根据分布原理(泊松分布原理和/或二项分布原理，或其他数学分布原理)及阳性微滴的比例等方式，计算出具有目标序列的核酸分子的浓度或拷贝数。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：本发明不需要特定的热循环设备，降低了检测设备的开发难度；Cas蛋白的附属切割活性较高，可以在短时间内产生足够的检测信号，从而缩短检测时间；同时，CRISPR/Cas系统的特异性较高，提高了检测的准确性；同时，本发明无需采用标准曲线或参照信号就可以进行待测核酸的分子检测，提高了检测的灵敏度。

附图说明

图1为本发明一实施例中系统的结构示意图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的较佳实施例进行详细说明，以便更清楚理解本发明的目的、特点和优点。应理解的是，附图所示的实施例并不是对本发明范围的限制，而只是为了说明本发明技术方案的实质精神。

图1展示了根据本发明的较佳实施例提供的基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的系统，该系统包括：组件甲1，用于生成多个微反应单元；组件乙2，包括容置多个微反应单元的检测场所；组件丙3，用于对检测场所内的反应后微反应单元的报告光信号变化进行检测；组件丁(图中未示出)，包括借助CRISPR/Cas系统检测目标序列的各个功能元件。

在上述实施例中，优选地，组件甲1为微反应单元生成装置，微反应单元生成装置包括但不限于微孔板和微滴化装置，反应在微孔板或微滴化装置生成的微滴中进行。为了达到同样的目的，微反应单元生成装置也可以采用核壳结构的管道，此时亦可以实现微滴生成功能。当然，在具体实施过程中，采用其它任意一种可实现相同功能的装置都是可以的。具体地，如图1所示，组件甲1采用基于流动聚焦法的微滴化装置，该微滴化装置具有三个通道，中间通道通入油相，两侧通道分别通入A溶液和B溶液，三个通道汇聚于一点形成“收缩颈”结构。在油相入口、A液入口和B液入口处可以外接泵(气泵或液泵等均可)提供正压使油相和A、B混合溶液流动并经过“收缩颈”结构，A、B混合溶液在油相的切割和“收缩颈”结构的共同作用下断裂成油包水的微滴。

在上述实施例中，优选地，组件乙2可以为反应杯，此时将微反应单元转移到反应杯中，使微反应单元呈单层平铺在反应杯进行检测。或者，组件乙2可以为检测室，此时将微反应单元注入检测室中，使微反应单元呈单层平铺在检测室进行检测。或者，组件乙2可以为微流检测通道，此时将微反应单元注入到微流检测通道中，使微反应单元单层或单列通过微流检测通道进行检测。又或者，组件乙2可以为微孔板，微孔板具有多个微孔，每一微孔中容纳一个微反应单元，对微孔板微孔中的微反应单元进行检测。

在上述实施例中，优选地，组件丙3可以包括检测装置，检测装置通过检测微反应单元的报告光信号，分析获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

在上述实施例中，优选地，检测装置对组件乙2中的微反应单元受照射后发出的报告光信号进行检测，然后通过对产生报告光信号的微反应单元计数或者通过分布原理(泊松分布原理和/或二项分布原理，或其他数学分布原理)及阳性微滴的比例，计算出待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

在上述实施例中，优选地，检测装置可以为带有激发光源的报告光检测装置，即该报告光检测装置配套于需要激发的报告光基团，实现激发报告光基团和检测报告光信号变化两个功能。此时，光源用于照射组件乙2内的微反应单元，以使微反应单元发出与微反应单元本身特性相关的光信号，例如荧光。检测装置用于对组件乙2内的微反应单元的光信号进行检测。由于微反应单元中具有荧光物质，荧光物质在光源的照射下被激发，从而发出荧光。进而，由检测装置检测组件乙2内微反应单元的荧光的光强(发光强度)。检测装置可以在光源照射组件乙2内的微反应单元时对组件乙2内的微反应单元的荧光进行检测，也可以在光源照射组件乙2内的微反应单元之后对组件乙2内的微反应单元的荧光进行检测(例如时间分辨发光物质荧光寿命较长，在光源停止照射后的一段时间内粒子仍然发射荧光)，本发明不做限定。

在上述实施例中，优选地，组件丙3还包括成像滤光片(图中未示出)，该成像滤光片用于对微反应单元的荧光进行滤光，例如只让一种荧光通过。由于有成像滤光片的作用，光源发出的光被滤除，因此照片质量较高。

在上述实施例中，优选地，检测装置可以为不带有激发光源的报告光检测装置，即该报告光检测装置配套于无需激发的报告光基团，实现检测报告光信号变化一个功能。

在上述实施例中，优选地，组件丙3还包括滤光片切换装置(图中未示出)，该滤光片切换装置用于让不同波长的光通过，其包括多个成像滤光片，其中一个成像滤光片设置在组件乙2与检测装置之间的光路上，从而实现让一种波长的光进入检测装置；由此，通过切换光路中的成像滤光片，实现不同波长的光分别进入检测装置。例如，滤光片切换装置可以是滤光片转轮，其包括转轮以及圆周阵列在转轮上的多个成像滤光片，其中一个成像滤光片位于组件乙2与检测装置之间的光路上。成像滤光片用于对微反应单元的荧光进行滤光，例如只让一种荧光通过，从而检测一种荧光信号；转轮转动以切换成像滤光片，则能检测另一种荧光信号。

在上述实施例中，优选地，组件丙3开启光源照射微反应单元，使微反应单元内部的荧光物质受到激发，从而发出荧光。组件丙3在光源开启时，或者，在光源照射组件乙2内的微反应单元之后，启动检测装置对组件乙2内的微反应单元的荧光进行检测。检测可以是对组件乙2内的微反应单元进行拍照，得到微反应单元的照片。由于有成像滤光片的作用，光源发出的光被滤除，照片质量高。得到微反应单元的照片后，即可对照片进行图像处理等，得到照片上各微反应单元的荧光强度。根据照片上各微反应单元荧光强度的变化，可判断组件乙2内的各微反应单元是否含有目标序列等。

在上述实施例中，优选地，检测装置可以包括：单点的光敏检测器(光电探测器)，线阵列的光敏检测器和面阵列的光敏检测器中的至少一种。面阵列的光敏检测器优选的可以采用相机。另外，检测装置包括的每种光敏检测器可以是一个也可以是多个。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、Influenza A virus RNA的检测

一、设计目标序列和靶序列

Influenza A virus为负链RNA病毒。

目标病毒为A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的PA基因片段(如序列表的序列1所示，cRNA序列)。

根据目标序列，设计crRNA的靶序列(如序列表的序列2所示)：UAUAUGAUGCAAUCAAAUGCAUG。

二、制备RNA样本

RNA样本如序列表的序列1所示，为单链RNA分子。

取浓度为7.02×10¹¹拷贝/μl的RNA样本，用水稀释，使RNA浓度为1拷贝/μl，即为供试RNA样本1。取浓度为7.02×10¹¹拷贝/μl的RNA样本，用水稀释，使RNA浓度为10拷贝/μl，即为供试RNA样本2。取浓度为7.02×10¹¹拷贝/μl的RNA样本，用水稀释，使RNA浓度为100拷贝/μl，即为供试RNA样本3。取浓度为7.02×10¹¹拷贝/μl的RNA样本，用水稀释，使RNA浓度为1000拷贝/μl，即为供试RNA样本4。水，作为供试RNA样本0。

三、引物、crRNA及探针分子设计

针对目标序列设计的RPA扩增引物如下：

S-RPA-F(序列表的序列3)：5’-GTACTTGCTTCCATGACAGAAGATAATTTG-3’；

S-RPA-R(序列表的序列4)：5’-GATATTAATACGACTCACTATAGGGTGCCTTAAAATTAAGCATTGAGGACCCAAG-3’；

S-RPA-F为正向引物。S-RPA-R为反向引物，其中下划线标注的是T7启动子(实际应用中T7启动子也可替换为T3启动子、M13启动子等)。S-RPA-F和S-RPA-R均为单链DNA分子。

针对目标序列设计crRNA如下(如序列表的序列5所示)：

crRNA序列中，粗体标注部分可与LwCas13a蛋白结合，下划线标注靶序列结合区。crRNA为单链RNA分子。

探针分子如下：

5’-UAUAUUU-3’；

探针分子中，5’末端具有6-羧基荧光素(荧光基团)，3’末端具有4-[4-(二甲基氨基)苯基偶氮]苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(荧光淬灭基团)。探针分子为单链RNA分子。

分别制备S-RPA-F、S-RPA-R、crRNA和探针分子。

四、制备A溶液和B溶液

TwistAmpTM Liquid Basic试剂盒：TwistAmpTM，货号INLQBAS；试剂盒中提供2×RPA反应液、RPA核心反应液和280nM MgOAc溶液。重组LwaCas13a蛋白：北京科昕生物，货号KX-E-003。dNTPs：NEB，货号N0447V。NTPs：NEB，货号N0466S。

供试RNA样本分别为供试RNA样本0、供试RNA样本1、供试RNA样本2、供试RNA样本3或供试RNA样本4。

A溶液(20μl)：供试RNA样本1μl、2×RPA反应液10μl、280nM MgOAc溶液2μl、2mMdNTPs 2μl、10mM NTPs 2μl，10μM S-RPA-F 1μl、10μM S-RPA-R 1μl、20μM探针分子1μl。

B溶液(20μl)：LwaCas13a蛋白0.2μl(蛋白含量为100pmol)、crRNA 1μl(RNA含量为10ng)、2×RPA反应液10μl，RPA核心反应液2μl，余量为ddH₂O。

实际应用时，当S-RPA-F中采用T3启动子时，B溶液中采用T3 RNA聚合酶。

实际应用时，当S-RPA-F中采用M13启动子时，B溶液中采用M13 RNA聚合酶。

五、生成微反应单元

A溶液95℃温育2min，然后降至室温；然后将A溶液和B溶液分别通过A液入口和B液入口注入微滴化装置，而后向油相入口中注入油相(矿物油，又称石蜡油)进行切割，形成A溶液和B溶液的混合液滴。A溶液和B溶液的混合液为分散相，油为连续相，形成油包水的液滴。液滴为球型，直径125±10μm。

A溶液：B溶液：油相＝1:1:7(体积比)。

六、转移或注入至检测场所并进行检测

将液滴注入到检测场所，37℃反应20min，然后采用荧光成像的方式进行检测，用泊松分布及阳性微滴的比例，分析获得待测核酸分子的浓度或拷贝数。

泊松分布计算公式：C＝-N*ln(1-F/N)；其中，N为微液滴总数，F为阳性微液滴总数，C为核酸分子拷贝数。

进行三次重复试验，结果见表1、表2和表3。

表1

表2

表3

实施例2、EB病毒DNA的检测

一、设计目标序列和靶序列

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)为DNA病毒。

目标序列为EB病毒的EBNA-1基因片段(如序列表的序列6所示)。

根据目标序列，设计crRNA的靶序列(如序列表的序列7所示)：ACCATAGGTGGAAACCAGGGAGG。

二、制备DNA样本

DNA样本如序列表的序列6所示，为双链DNA分子。

取浓度为6.02×10¹⁰拷贝/μl的DNA样本，用水稀释，使DNA浓度为2拷贝/μl，即为供试DNA样本1。取浓度为6.02×10¹⁰拷贝/μl的DNA样本，用水稀释，使DNA浓度为10拷贝/μl，即为供试DNA样本2。取浓度为6.02×10¹⁰拷贝/μl的DNA样本，用水稀释，使DNA浓度为100拷贝/μl，即为供试DNA样本3。取浓度为6.02×10¹⁰拷贝/μl的DNA样本，用水稀释，使DNA浓度为1000拷贝/μl，即为供试DNA样本4。水，作为供试DNA样本0。

三、crRNA及探针分子设计

针对目标序列设计crRNA如下(如序列表的序列8所示)：

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCUCCCUGGUUUCCACCUAUGGU-3’；

crRNA序列中，粗体标部分可与LbCas12蛋白结合，下划线标注靶序列结合区。crRNA为单链RNA分子。

探针分子如下：

5’-TTCTTA-3’；

探针分子中，5’末端具有6-羧基荧光素(荧光基团)，3’末端具有4-[4-(二甲基氨基)苯基偶氮]苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(荧光淬灭基团)。探针分子为单链DNA分子。

分别制备crRNA和探针分子。

四、制备A溶液和B溶液

LbCas12a蛋白：北京科昕生物，货号KX-E-002。

供试DNA样本分别为供试DNA样本0、供试DNA样本1、供试DNA样本2、供试DNA样本3或供试DNA样本4。

A溶液(20μl)：供试DNA样本1μl、0.1μM探针分子2μl，余量为ddH₂O。

B溶液(20μl)：LbCas12a蛋白0.2μl(蛋白含量为100pmol)、crRNA 1μl(RNA含量为10ng)，余量为ddH₂O。

五、生成微反应单元

A溶液95℃温育2min，然后降至37℃；然后将A溶液和B溶液混匀后分别通过A液入口和B液入口注入微滴化装置，而后向油相入口中注入油相(矿物油，又称石蜡油)进行切割，形成A溶液和B溶液的混合液滴。A溶液和B溶液的混合液为分散相，油为连续相，形成油包水的液滴。液滴为球型，直径125±10μm。

A溶液：B溶液：油相＝1:1:7(体积比)。

六、转移或注入至检测场所并进行检测

将液滴注入到检测场所，37℃反应20min，然后采用单列通过微流检测通道的方式对待测液滴逐个进行检测，用泊松分布及阳性微滴的比例，分析获得待测核酸分子的浓度或拷贝数。

泊松分布计算公式：c＝-(m/v_d)*ln(1-f/n)，其中m为稀释倍数，为A、B总溶液体积与供试DNA样本溶液体积的比值，本实施例m为40；v_d为单个微液滴体积的平均值，n为检测到的微液滴总数，f为检测到的阳性微液滴数，c为供试DNA样本核酸分子浓度。每个微液滴的体积可根据v＝(π*D³)/6计算，D为微液滴的测量直径。

进行三次重复试验，结果见表4、表5和表6。

表4

表5

表6

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法及系统

<130> GNMXB201534

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2150

<212> RNA

<213> Influenza A virus

<400> 1

uaacucaaug cauguguaag gaaggaguug aaccaagaag cauuaagcaa aacccaggga 60

ucauuaauua ggcacuccuc aauugcuuca uauagccccc caagaucaaa ggucccaggu 120

uccagauugu cccuaagagc cugaacgaua agaagcaguu uucuugauuc agcugaaaau 180

ccuucuaguu guggagaugc auacaagcug uuaaauaccg acuuugcuaa uaaaguccug 240

cagaccuucc caauggaacu uuccuccacu ccuuugggag acucuccaau gggccauguu 300

ucugauuugu ucucaaagaa cucuuugguc augucuuucu cuuugacaga ggacucagcu 360

ucaaucauac ucucaauuug uugaagugac uggaggagac aacgccucau cuccauuccc 420

cauuucauuu uaauuuuuga gguuccauuu guccucacau acaagaacau gggccuugaa 480

accuggccua uggcacuucu uagaagcaua ucuccuaucu caagaacaca guacuucucc 540

cauuugugug guucaagucu ugggucagug agagaaaacu ccaugcucac aaaguuuacc 600

acgucggugu cauuccuuaa gugggaucuu ccuuuuauga ugaaaccaua caaguugguc 660

uuucgccuuc ccuccuuagu ucuacacuug cuuaucauug gaauuaauug gaaaucaucc 720

auugcugcac aagaugcauu aaguaaggca guauugaugu acacccccuu cauuauguau 780

ucuguggcuc ugcagugaga caccucugau gugaaauaau uccuucucau gcuugcaaug 840

uguucaauug gagccacauc uucuccaauc ucaucaagcu cuauccagcu ugaaucuguc 900

aguucgcaug ccuuguugaa cucauucuga auccaacuug caagcgaccu caauucuggu 960

ucaucacuau cauauugcuu caaaucaccu acaucuuuac agucgucaaa gucuaccuuu 1020

ucuggugcca uguucucacc aagugcccac uuuagcugac uuguuuuuuu cauauuuuua 1080

gucuuuggaa uuuucuccuc auucucaaug uccugcaguu cugccaguac uugcuuccau 1140

gacagaagau aauuuggauu uauucccuuu ucgugugguu uaacaacauu ggguuccuuc 1200

cauccaaaga auguucucau gcauuugauu gcaucauaua gcgguauucc cucuccuuca 1260

ugacuugggu ccucaaugcu uaauuuuaag gcauccauca gcaggaauuu ggaccgcuga 1320

gaacagggag gcccauucgg aagucuaagu ggucguggug uuguuuucaa aaaagguuca 1380

auucuagcau uuacuucuuu ggacauuuga gacagcuugc ccucaaugua gccguucggu 1440

ucgaauccau ccacauaggc ucuaaaauuu ucaaggcugg agaaguucgg cgggagacuu 1500

uggucggcaa gcuugcgcau uguuccugug auuucaaacc uuucuucaau ugucucuucu 1560

ccucucucgg acugacgaaa ggaaucccag aggccucugc uggccauuuc uugucuuaug 1620

gugaauagcc ugguuuugau ccuagcccug cuuucuucau cgagagugua gucggccuuu 1680

guggccauuu cuuccccagu gaacgagaaa auguggaugu guguuuucuc agauuuaauu 1740

uuauuggccu uuuccagaua guauauguga acuucucucc uuguuacucc aauuucgaug 1800

aaucuauuuu ccuuguaauc auacaaaucu gguagaaacu uugguuucuc agccccugua 1860

guguugcaaa uacaauggcc uggacaguag uaaacagugc gaucucuucc cucgauuauu 1920

ucaaaucugu gcuucaaaag ugcauuagga ucaccaaguu cuacgauuau ugacucgccu 1980

ugcucauuga ugaaguggaa aucugaauac augaagcaua cuuccaagug agugcauauu 2040

gcugcaaauu uguuuguuuc gauuuucagg uccuccccau acucuuucau uguuuuuucc 2100

gcaagcucga caaucaucgg auugaagcau ugucgcacaa aaucuuccau 2150

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> Influenza A virus

<400> 2

uauaugaugc aaucaaaugc aug 23

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gtacttgctt ccatgacaga agataatttg 30

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gatattaata cgactcacta tagggtgcct taaaattaag cattgaggac ccaag 55

<210> 5

<211> 59

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccaug cauuugauug caucauaua 59

<210> 6

<211> 1926

<212> DNA

<213> Epstein-Barr virus

<400> 6

atgtctgacg aggggccagg tacaggacct ggaaatggcc taggagagaa gggagacaca 60

tctggaccag aaggctccgg cggcagtgga cctcaaagaa gagggggtga taaccatgga 120

cgaggacggg gaagaggacg aggacgagga ggcggaagac caggagcccc gggcggctca 180

ggatcagggc caagacatag agatggtgtc cggagacccc aaaaacgtcc aagttgcatt 240

ggctgcaaag ggacccacgg tggaacagga gcaggagcag gagcgggagg ggcaggagca 300

ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggaggg 360

gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga 420

ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca ggaggagggg caggaggggc aggagcagga 480

ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagc aggaggaggg 540

gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggagga 600

ggggcaggag caggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca 660

ggaggagggg caggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca 720

ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg 780

gcaggagcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggagca 840

ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggggcaggag gggcaggagc aggaggggca 900

ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggagcagga 960

ggggcaggag caggaggtgg aggccggggt cgaggaggca gtggaggccg gggtcgagga 1020

ggtagtggag gccggggtcg aggaggtagt ggaggccgcc ggggtagagg acgtgaaaga 1080

gccagggggg gaagtcgtga aagagccagg gggagaggtc gtggacgtgg agaaaagagg 1140

cccaggagtc ccagtagtca gtcatcatca tccgggtctc caccgcgcag gccccctcca 1200

ggtagaaggc catttttcca ccctgtaggg gaagccgatt attttgaata ccaccaagaa 1260

ggtggcccag atggtgagcc tgacgtgccc ccgggagcga tagagcaggg ccccgcagat 1320

gacccaggag aaggcccaag cactggaccc cggggtcagg gtgatggagg caggcgcaaa 1380

aaaggagggt ggtttggaaa gcatcgtggt caaggaggtt ccaacccgaa atttgagaac 1440

attgcagaag gtttaagagc tctcctggct aggagtcacg tagaaaggac taccgacgaa 1500

ggaacttggg tcgccggtgt gttcgtatat ggaggtagta agacctccct ttacaaccta 1560

aggcgaggaa ctgcccttgc tattccacaa tgtcgtctta caccattgag tcgtctcccc 1620

tttggaatgg cccctggacc cggcccacaa cctggcccgc taagggagtc cattgtctgt 1680

tatttcatgg tctttttaca aactcatata tttgctgagg ttttgaagga tgcgattaag 1740

gaccttgtta tgacaaagcc cgctcctacc tgcaatatca gggtgactgt gtgcagcttt 1800

gacgatggag tagatttgcc tccctggttt ccacctatgg tggaaggggc tgccgcggag 1860

ggtgatgacg gagatgacgg agatgaagga ggtgatggag atgagggtga ggaagggcag 1920

gagtga 1926

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Epstein-Barr virus

<400> 7

accataggtg gaaaccaggg agg 23

<210> 8

<211> 44

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

uaauuucuac uaaguguaga uccucccugg uuuccaccua uggu 44

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法，为方法Ⅰ或方法Ⅱ；

所述方法Ⅰ包括如下步骤：在微反应单元中进行反应；部分微反应单元不含有由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有1个由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有2个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；借助CRISPR/Cas系统检测微反应单元中是否含有目标序列；

所述方法Ⅱ包括如下步骤：在微反应单元中进行反应；每个微反应单元含有1个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；借助CRISPR/Cas系统检测微反应单元中是否含有目标序列；

借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分包括gRNA、Cas蛋白和探针分子；gRNA为单链RNA，具有靶序列结合区和Cas蛋白结合区；gRNA和Cas蛋白形成复合体；复合体识别并结合gRNA的靶序列后，Cas蛋白的附属切割活性被激活，从而切割探针分子引起光信号变化；所述靶序列是基于所述目标序列设计的；

所述探针分子为单链RNA分子或单链DNA分子；

所述微反应单元为将待测核酸样本和借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分混合，然后进行微滴化，得到微液滴；或所述微反应单元为将待测核酸样本、借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的组分和核酸扩增所需的组分混合，然后进行微滴化，得到微液滴；

所述微反应单元是将A溶液和B溶液进行微滴化得到的微液滴，所述A溶液中含有待测核酸样本，所述B溶液中含有gRNA和Cas蛋白，所述A溶液和/或所述B溶液中含有所述探针分子；

当所述微反应单元中涉及核酸扩增所需的组分时，所述A溶液中还含有扩增靶序列所需的引物对、dNTPs或NTPs，所述B溶液中还含有扩增靶序列所需的酶；所述核酸扩增为重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温核酸扩增技术、RPA滚环扩增、环介导等温扩增、链替代扩增反应、依赖解旋酶恒温扩增技术、依赖核酸序列的扩增技术、实时荧光核酸等温扩增、单引物等温扩增技术或交叉引物扩增技术；

所述Cas蛋白为Cas12a蛋白或Cas13a蛋白；

所述目标序列为目标生物的特异性序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述方法Ⅰ包括如下步骤：

（1）生成微反应单元，然后进行反应；部分微反应单元不含有由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有1个由待测核酸样本提供的核酸分子，部分微反应单元含有2个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；每个微反应单元中，均含有借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的各个组分；

（2）通过检测微反应单元的报告光信号变化获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数；

所述方法Ⅱ包括如下步骤：

（1）生成微反应单元，然后进行反应；每个微反应单元含有1个以上由待测核酸样本提供的核酸分子；每个微反应单元中，均含有借助CRISPR/Cas系统检测目标序列所需的各个组分；

（2）通过检测微反应单元的报告光信号变化获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述方法Ⅰ还包括如下步骤：检测微反应单元的报告光信号变化后，通过特定方法，分析获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数；

所述方法Ⅱ还包括如下步骤：检测微反应单元的报告光信号变化后，通过特定方法，分析获得待测核酸样本中目标序列的浓度或拷贝数；

所述特定方法为对产生报告光信号的所述微反应单元计数或者所述特定方法为通过特定分布原理及阳性微滴的比例；所述特定分布原理包括泊松分布原理和/或二项分布原理。