CN111778272A

CN111778272A - 一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉

Info

Publication number: CN111778272A
Application number: CN202010686545.8A
Authority: CN
Inventors: 郜晓峰; 崔丽丽; 王深垒; 马盼盼; 夏丹丹; 康文艺
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉。具体制备步骤包括：提取沙门氏菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增、与pLB质粒连接、转化、筛选、鉴定并提取质粒、制备冻干粉成品等步骤。本申请中，发明人以现有若干菌株作为标准菌株，以invA和fimI毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关沙门氏菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于沙门氏菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。

Description

一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高，人们对于食品安全问题日益重视。在食品安全问题中，食源性微生物所导致的食品质量问题一直居于首位，而由食源性微生物所引起的食源性疾病已经成为最重要的世界性卫生疾病问题之一。受限于技术实际和其他客观条件，现阶段我国检测食源性微生物时，即时性检测时，由于定性检验DNA参考物质体系尚不不完整，因此大大限制了检验检测的技术水平。

沙门氏菌(Salmonella)，能够感染水源、食物后引起肠胃炎、腹泻等疾病，严重危害人类身体的健康安全。作为食源性微生物中主要常见致病菌之一，在食品卫生以及流行病学领域，沙门氏菌也是重要的基础性研究对象。对沙门氏菌的基因组研究表明，沙门氏菌侵袭蛋白A基因(invA)编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白，inv基因簇与沙门氏菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，其中invA基因编码的蛋白属于沙门氏菌的主要毒力因子。沙门氏菌菌毛是由fim基因决定簇编码，fim基因操纵子都包含编码结构组分的基因和编码菌毛有序装配装配蛋白的基因，其中fimI基因编码黏附素蛋白。因此，如能开发一种针对致病沙门氏菌毒力基因检测用标准品，对于相关致病菌的即时、快速检测具有十分重要的技术意义。

发明内容

本申请目的在于提供一种检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉，以此作为标准品应用时，可为沙门氏菌的快速、即时检测体系的建立和食品安全奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉，以鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50071、CMCC 50115(中国医学细菌保藏管理中心)、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028（美国菌种保藏中心）或者肠炎沙门氏菌CICC 21482（中国工业微生物菌种保藏管理中心）这四种菌株为例，以invA（编码侵扰蛋白）基因和fimI（编码黏附素蛋白）基因为目标毒力基因，以pLB质粒作为载体质粒，通过基因工程技术手段，转化制备成含有目标毒力基因的标准品，从而为致病菌标准化检测体系奠定基础，具体步骤如下：

（一）提取沙门氏菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增

利用现有细菌基因组DNA提取试剂盒，参考其说明书，提取沙门氏菌全基因组DNA备用；

针对目标毒力基因invA和fimI，分别设计PCR扩增用引物序列如下：

fimI-F：5’- CACTAAATCCGCCGATCAA-3’，

fimI-R：5’- CAACGGTGAGGAGGTATTATC-3’；

invA-F：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，

invA-R ：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGACCC-3’；

以所提取的沙门氏菌全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增；

对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；

（二）连接、转化

以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；

（三）筛选、鉴定并提取质粒

对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；

（四）制备冻干粉成品

配合赋形剂、保护剂，将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价沙门氏菌致病性时的标准化质粒标准品（即作为对照品应用）。

所述食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，具体用于检测菊花，作为阳性对照，用于判定菊花是否受到致病性沙门氏菌污染。

利用所述食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉的沙门氏菌检测方法，包括如下步骤：

（一）处理样品

对检测样品进行处理，提取待检测样品中微生物DNA；

（二）设计引物并进行PCR扩增

具体引物序列同前述，即具体为：

fimI-F：5’- CACTAAATCCGCCGATCAA-3’，

fimI-R：5’- CAACGGTGAGGAGGTATTATC-3’；

invA-F：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，

invA-R ：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGACCC-3’；

以步骤（一）中所提取微生物DNA为模板，分别利用上述引物对中一对或两对进行PCR扩增，以此作为检测样；

同时，利用沙门氏菌用标准化质粒冻干粉作为模板，分别利用上述引物对中一对或两对引物进行PCR扩增，以此作为标准样；

（三）对比和鉴定

对步骤（二）中扩增产物进行电泳分析和对比，如果检测样具有与标准样相同带型，则表明待检样品受到了沙门氏菌污染。

本申请中，发明人以现有特定的几种沙门氏菌菌株的invA和fimI毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因invA和fimI的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关食源性沙门氏菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于沙门氏菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。

附图说明

图1为沙门氏菌全基因组DNA电泳图，M：Marker，1：伤寒沙门氏菌CMCC50071；2：沙门氏菌CMCC 50956；3：鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028；4：肠炎沙门氏菌CICC 21482；

图2为沙门氏菌中毒力基因PCR扩增结果，(a)和 (b)分别为invA和fimI基因；M：D2000DNA Marker；1：伤寒沙门氏菌CMCC50071；2：沙门氏菌CMCC 50956；3：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；4：肠炎沙门氏菌CICC 21482；

图3为转化后菌落PCR鉴定结果，M：Marker，1、2、3、4为平板上随机挑选的四个单菌落；

图4为传代15代后所提取质粒电泳结果，M：Marker，1：invA基因；2：fimI基因；

图5为冻干粉成品PCR鉴定结果；M:Marker；1-3：25℃条件下；4-6:4℃条件下；7-9：-20℃条件下；

图6 为沙门氏菌invA（a）和fimI（b）基因PCR检测灵敏度结果，M：D2000 DNA Marker；1-6：10^-1、10^-2、10-³、10^-4、10^-5和10^-6系列浓度梯度；7：阴性对照；

图7为菊花样品中invA的PCR检测结果，M：D2000 DNA Marker；A ：1-15：菊花样品；16：阴性对照；17：阳性对照；B：1-8：菊花样品；9：阴性对照；10：阳性对照；

图8为菊花样品中 fimI的PCR检测结果，M：D2000 DNA Marker；A：1-15：菊花样品；16：阴性对照；17：阳性对照；B：1-8：菊花样品；9：阴性对照；10：阳性对照；根据阳性对照也就是沙门氏菌毒力基因invA质粒冻干粉的跑胶结果可以看出7、15菊花样品中含有invA毒力基因，可能被沙门氏菌不同程度污染。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

相关引物序列合成和测序工作，由北京六合华大基因科技有限公司和生工生物工程有限公司完成；

鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50071、CMCC 50115(中国医学细菌保藏管理中心)、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028（美国菌种保藏中心）、肠炎沙门氏菌CICC 21482（中国工业微生物菌种保藏管理中心）均为本领域研究中常用微生物菌株；

实验试剂：

细菌全基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）(DP302) 、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）（DP209）、pLB零背景快速克隆试剂盒（不含MCS）VT206、质粒小提试剂盒（DP103）、土壤基因组DNA提取试剂盒（DP336）、2×Pfu PCR MasterMix(KP201)、感受态细胞（DH-5α）、电泳用Marker等，均为天根生化科技有限公司产品；

6×DNA loading Buffer、GoldView核酸染色剂、Amp等，均为Solarbio公司产品；

实验仪器：

核酸蛋白检测仪、PCR扩增仪，均为Thermo scientific公司产品；

脉冲场凝胶电泳仪，JUNYI公司产品；

东胜龙BIS910 凝胶成像系统，北京东胜创新生物科技有限公司产品。

实施例1

由于相关质粒构建是本申请技术方案基础，因此本实施例就相关重组质粒的构建过程简要介绍说明如下。

（一）提取沙门氏菌全基因组DNA

参考细菌全基因组DNA提取试剂盒(DP302)说明书，分别提取鼠伤寒沙门氏菌CMCC50071、CMCC 50115(中国医学细菌保藏管理中心)、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028（美国菌种保藏中心）或者肠炎沙门氏菌CICC 21482（中国工业微生物菌种保藏管理中心）这四种菌株的全基因组DNA；具体操作也可参考如下操作：

取沙门氏菌菌液1ml，4℃、12000 r/min离心2 min，弃上清；向菌体沉淀中加入200 μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；

向管中加入20 μL的Proteinase K溶液，混匀后再加入220 μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10 min（溶液应变清亮），简短离心以去除管盖内壁的水珠；再加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15 sec（此时可能会出现絮状沉淀），简短离心以去除管盖内壁的水珠；

转移至吸附柱CB3中，12000 rpm (13400×g ) 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；加入500μL缓冲液GD，12000 rpm离心30sec，倒掉废液；再加入600μL漂洗液PW，12000 rpm离心30 sec，倒掉废液，可重复漂洗一次以确保漂洗效果；最后将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm离心2 min，倒掉废液；室温放置数分钟以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5 min，12000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中（此即为所提取DNA）；

进一步利用蛋白核酸测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度，结果如下：

从上表结果可以看出，提取结果是满足后续使用要求的。

进一步对所提取的四种菌株的全基因DNA分别进行1.5%琼脂凝胶核酸电泳分析，结果如图1所示。可以看出，均只有一条清晰的特异性条带，这进一步表明提取效果较好，可以满足后续实验需要。

（二）PCR扩增

针对目标毒力基因invA和fimI，设计PCR扩增用引物序列如下：

fimI-F：5’- CACTAAATCCGCCGATCAA-3’，

fimI-R：5’- CAACGGTGAGGAGGTATTATC-3’；

invA-F：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，

invA-R ：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGACCC-3’；

分别以步骤（一）中所提取的沙门氏菌全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增，25μL扩增体系参考设计如下：

DNA模板，0.5μL；

上、下引物，分别0.5µl（浓度均为10µM）；

2×PfuPCR MasterMix，12.5μl；

ddH₂O补至25μl；

具体扩增程序参考为：

。

对PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，成像结果如图2所示。进一步对扩增产物进行回收、纯化和测序。

可以看出：invA和fimI引物扩增分别得到284 bp和262 bp左右的条带，与预期的条带大小一致。

具体扩增序列部分如下：

invA基因（284bp），如SEQ ID No.1所示：

GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGGTCCTTTGACGGTGCGATGA

fimI基因（262bp），如SEQ ID No.2所示：

CAACGGTGAGGAGGTATTATCAAGAATCTCAATCCCGACGCCGGTTGCGGTAGTGCTATTGTCCGCAGAGGAGACAGCCAGCAAATTAGGGTTGGTGTTATCTGCCTGACCAGAGAAAGCCACGGCAGCGGTGGCCGCCACTTTCGGATCGCAGTCATTCAGGACGATGGAGAAAGGCACCTGCGCAGTCGTATTACCAATCGCCGTAAAGCTGGCGGTACGGTATTGACCCAGCGTCACCGTTTGATCGGCGGATTTAGTGATCTCTCTA。

（三）连接、转化

参考pLB零背景快速克隆试剂盒说明书，将步骤（二）所回收的PCR扩增产物（即，invA和fimI毒力基因）分别与pLB-simple Vector载体进行连接，并进一步连接产物转化至沙门氏菌DH5α感受态细胞，培养重组沙门氏菌，挑取阳性菌落经菌落PCR和测序鉴定无误后，然后提取和纯化获得含有毒力基因的重组质粒。

具体实验操作过程可参考如下：

连接时，10µl连接体系如下：

毒力基因的PCR片段，10ng；

pLB-Simple Vector，1 μL（35 ng/μl）

2×Reaction Solution，5 μL；

T4 DNA Ligase，1 μL；

ddH₂O补足至10 µl；

混合均匀后，22℃连接反应5 min。

具体转化时，采用热激转化法：在连接产物中加入100 μL感受态细胞中，混匀后冰浴30 min，再42℃恒温90 sec，再立即置于冰浴中放置2min；随后加入300 μL、37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150 rpm、37℃振荡培养45 min以使菌体复苏；

再吸取100μL复苏后菌液涂布到含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体琼脂培养基上，37℃倒置培养16 h。

（四）筛选、鉴定并提取质粒

对步骤（三）中的转化产物进一步挑取阳性单菌落进行培养扩增后，取1μL菌液作为DNA模板进行菌落PCR鉴定，部分鉴定结果如图3所示。可以看出，转化重组正确。

进一步将鉴定正确菌落于含有氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB液体培养基中，150rpm、37℃摇床培养大约12小时，即可进一步提取质粒以便于制备冻干粉标准品。

为确定利用菌株保藏质粒时，菌株繁殖后质粒传代过程中的质粒的稳定性，发明人进一步将含有转化质粒的转化菌株进行连续传代培养15代，然后提取质粒并进行电泳检测和测序验证。

部分电泳结果如图4所示。进一步结合测序对比结果，可以明确，传代过程中质粒传代稳定。

（五）制备冻干粉

将步骤（四）中所提取质粒进一步由北京六合华大基因科技有限公司制备成冻干粉后即为检测用标准品（浓度在300 ng/g）。

为确定冻干粉中质粒稳定性，每周随机不重复抽样进行PCR定性检测，具体方式为：

随机取样后，将冻干粉分别置于25℃、4℃及-20℃环境中，前期每7天进行一次取样检测，后期一个月进行一次取样检测；

检测时，每次用10µL的ddH₂O溶解冻干粉，取0.5µL作为模板进行PCR扩增（具体扩增体系及扩增结果参考前述内容）。

部分批次扩增结果如图5所示。从图中可以看出，扩增结果稳定，表明质粒冻干粉可以稳定保存，并可作为标准品加以应用。

另一方面，以步骤（一）中所提取全基因组DNA为模板，将其进行10倍梯度倍比稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6系列浓度，进行PCR实验，以确定本申请检测方法的检测灵敏度。

部分实验结果如图6所示。可以看出，利用PCR方法检测时，检测对灵敏度可达pg级别。

实施例2

以实施例1所制备质粒冻干粉作为标准品，以市场随机购买的不同批次、不同来源的菊花作为检测对象，对其是否受到沙门氏菌污染进行检测判定，以评价本申请所制备冻干粉标准品的准确性。具体实验过程简要介绍如下。

（一）样品情况

具体23批次样品编号及产地情况如下：

。

（二）样品微生物基因组 DNA 提取

称取20g菊花样品，加入 pH 7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 225 mL，振荡 30 min，超声处理 10 min；

收集液体，6000 r/min离心10 min，取沉淀，利用土壤基因组DNA提取试剂盒（DP336）提取微生物基因组 DNA。具体操作参考如下：

取750 µL 缓冲液SA和0.25 g研磨珠至2 mL离心管中，加入样本0.25g，涡旋混匀15 s；随后加入60 µL缓冲液SC，涡旋振荡10 min至样本混匀；

12000 rpm离心1 min，转移上清液 (约500 µL) 至新的2 mL离心管；

加入250 µL缓冲液HA，涡旋5 s，4℃放置5 min；再12000 rpm离心1 min，转移上清至新的2 mL离心管，加入200 µL缓冲液HB混匀，4℃放置5 min；随后，12000 rpm离心1 min，转移上清液至新的2 mL离心管，加入1200 µL缓冲液GF颠倒混匀；

取上述所得溶液700 µL于一个吸附柱CB3中，12000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入500 µL漂洗液PWS，12000 rpm离心30 s，倒掉废液；再向吸附柱CB3中加入500 µL 70%乙醇，12000 rpm离心30 s，倒掉废液；再次12000 rpm 离心2 min，倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴50-100 µL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12000 rpm 离心2 min，将溶液收集到离心管中。

（三）PCR扩增

以步骤（一）中所提取基因组DNA为模板，利用实施例1中PCR引物，进行PCR扩增。

PCR扩增时，以灭菌的去离子水代替模板DNA作为阴性对照；同时，以实施例1中所制备的含有毒力基因的冻干质粒标准品作为模板进行，进行PCR扩增，以此作为阳性对照。

将质粒标准品进行梯度稀释（稀释得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6系列浓度梯度）后进行应用，以对质粒标准品检测限进行判定，进一步可将标准质粒浓度按照下列计算方式换算为拷贝数：

（6.02×10²³拷贝·mol^-1）×质粒质量浓度（ng/µL）×10^-9/（DNA长度×660）=拷贝·µL^-1

DNA长度=载体长度+目的基因长度。

PCR扩增结束后，分别对扩增产物进行电泳检测。

（四）进一步验证

对于PCR检测结果呈现阳性的菊花样品，进一步进行传统微生物的分离、纯化和鉴定（参考国标4789.4-2016的方法），具体方法如下：

取PCR检测呈现阳性的菊花样品25 g加入225 mL营养肉汤培养基中，37℃、振荡培养24h，随后用接种环将培养液划线接种于BS平板上和XLD琼脂平板上，37℃、培养24 h，选取具有特征形态的单菌落接种于普通营养琼脂平板上进行形态鉴定；

挑取单菌落接种于普通营养肉汤中，提取全基因组DNA，进行16S r DNA扩增并结合扩增结果进行分子鉴定；

PCR扩增时，引物序列设计为：

16S-F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，

16S-R：5’- GGTTACCTTGTTACGACTT -3’；

PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，2℃再延伸7 min，扩增产物4℃保存，并送往生工生物有限公司进行测序，进一步结合测序结果进行菌种鉴定。

而对23批菊花样品的检测结果（主要检测了invA和fimI）表明，部分结果如图8所示。

从图中可以看出，本申请所制备的质粒冻干粉标准品条带清晰，可较好作为标准品加以应用，而通过对于条带明亮度对比，即可较为快速和直观的定性判定菊花样品是否受到沙门氏菌的污染（检测限试验结果表明invA和fimI质粒标准品的检测限分别为9.91×10⁷拷贝/μL和1.13×10⁸拷贝/uL）。

进一步对PCR鉴定样品的菊花样品的微生物分离鉴定结果表明，结果均未检测出沙门氏菌，分析认为这是由于受污染样品中沙门氏菌菌株不属于优势菌株，未能成功分离结果，但也再次表明了本申请检测的灵敏度和准确性。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> 一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 285

<212> DNA

<213> salmonella

<400> 1

gtgaaattat cgccacgttc gggcaattcg ttattggcga tagcctggcg gtgggttttg 60

ttgtcttctc tattgtcacc gtggtccagt ttatcgttat taccaaaggt tcagaacgcg 120

tcgcggaagt cgcggcccga ttttctctgg atggtatgcc cggtaaacag atgagtattg 180

atgccgattt gaaggccggt attattgatg cggatgctgc gcgcgaacgg cgaagcgtac 240

tggaaaggga aagccagctt tacgggtcct ttgacggtgc gatga 285

<210> 2

<211> 271

<212> DNA

<213> salmonella

<400> 2

caacggtgag gaggtattat caagaatctc aatcccgacg ccggttgcgg tagtgctatt 60

gtccgcagag gagacagcca gcaaattagg gttggtgtta tctgcctgac cagagaaagc 120

cacggcagcg gtggccgcca ctttcggatc gcagtcattc aggacgatgg agaaaggcac 180

ctgcgcagtc gtattaccaa tcgccgtaaa gctggcggta cggtattgac ccagcgtcac 240

cgtttgatcg gcggatttag tgatctctct a 271

Claims

1.一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，利用如下步骤制备获得，

（一）提取沙门氏菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增

提取沙门氏菌全基因组DNA备用；

同时针对目标毒力基因invA和fimI，分别设计PCR扩增用引物序列如下：

fimI-F：5’- CACTAAATCCGCCGATCAA-3’，

fimI-R：5’- CAACGGTGAGGAGGTATTATC-3’；

扩增产物262bp；

invA-F：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，

invA-R ：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGACCC-3’；

扩增产物284bp；

对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；

（二）连接、转化

（三）筛选、鉴定并提取质粒

（四）制备冻干粉成品

将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价沙门氏菌致病性时的标准化质粒标准品。

2.如权利要求1所述快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，步骤（一）中，提取沙门氏菌全基因组DNA时，以鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50071、CMCC50115、ATCC 14028或者肠炎沙门氏菌CICC 21482这四种菌株中任一种为全基因组DNA来源。

3.权利要求1所述快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，其特征在于，利用PCR检测时，作为阳性对照模板样品进行应用。

4.如权利要求3所述快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，其特征在于，用于菊花检测，以判定菊花是否受到致病性沙门氏菌污染。

5.利用权利要求1所述食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉的沙门氏菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（一）处理样品

对检测样品进行处理，提取待检测样品中微生物DNA；

（二）设计引物并进行PCR扩增

引物序列为：

fimI-F：5’- CACTAAATCCGCCGATCAA-3’，

fimI-R：5’- CAACGGTGAGGAGGTATTATC-3’；

invA-F：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，

invA-R ：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGACCC-3’；

以步骤（一）中所提取微生物DNA为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者任意几对进行PCR扩增，以此作为检测样；

同时，利用沙门氏菌用标准化质粒冻干粉作为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者任意几对进行PCR扩增，以此作为标准样；

（三）对比和鉴定