CN111751475B - 一种采用高效液相色谱检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法及应用 - Google Patents

一种采用高效液相色谱检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种采用高效液相色谱检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法，其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A是庚烷磺酸钠和三氟乙酸的混合溶液；流动相B是乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃任一种或者两种的混合液；稀释剂是纯水或其与甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃任一种或两种的混合溶液；该方法可用于甲磺酸卡莫司他有关物质的测定和在合成工艺中使用4‑二甲氨基吡啶作为催化剂和N,N‑二甲基甲酰胺作为精制溶剂的药物中残留量的测定的应用。

Description

一种采用高效液相色谱检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法 及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体提供了一种采用高效液相色谱检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法，该检测方法采用液相色谱法。
背景技术
甲磺酸卡莫司他（英文名：Camostat Mesilate）化学名成为2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基 4-(4-胍基苯甲酰氧基)苯乙酸酯甲磺酸盐，分子式为C20H22N4O5•CH3SO3H，分子量为494.52，CAS登录号: 59721-29-8。其结构如式I所示：
Figure 628615DEST_PATH_IMAGE001
甲磺酸卡莫司他是一种非肽类蛋白抑制剂。口服后甲磺酸卡莫司他迅速作用于机体的激肽生成系统，纤维蛋白溶解系统、凝血系统及补体系统，抑制这些体系的酶活性的异常亢进，从而控制慢性胰腺炎的症状，缓解疼痛，降低淀粉酶值。临床上用于治疗胰腺炎。
近期，德国学者通过体外论证，发现甲磺酸卡莫司他在抑制蛋白酶TMPRSS2的同时，可能对COVID-19有预防保护作用。因此甲磺酸卡莫司他有可能可以预防新冠病毒。
甲磺酸卡莫司他的合成工艺是以对羟基苯乙酸（1）和对氨基苯甲酸（4）为起始原料。对羟基苯乙酸（1）和氯代乙酰二甲胺（2）反应得到中间体4-羟基-苯乙酸[2-（二甲基氨基）-2-氧代乙基）]酯（3）；对氨基苯甲酸（4）和单氰胺反应，得到对胍基苯甲酸盐酸盐（5）。中间体3和中间体5通过酯化反应，得到4-(4-胍基苯甲酰氧基)苯乙酸[2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基]酯盐酸盐（6）。中间体6通过饱和碳酸氢钠溶液处理得到4-(4-胍基苯甲酰氧基)苯乙酸[2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基]酯碳酸盐（7），再通过甲磺酸酸化得到4-(4-胍基苯甲酰氧基)苯乙酸[2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基]酯甲磺酸盐（8），即甲磺酸卡莫司他；
Figure 727021DEST_PATH_IMAGE002
对羟基苯乙酸和对氨基苯甲酸是合成甲磺酸卡莫司他的起始物料，杂质C、杂质J、中间体3、中间体5是合成甲磺酸卡莫司他的工艺杂质，对羟基苯乙酸、中间体3和5、杂质C、杂质J同时也是甲磺酸卡莫司他的降解杂质。对氨基苯甲酸为中间体5的合成起始物料，并且中间体5不会降解成对氨基苯甲酸，故无需在甲磺酸卡莫司他里控制。甲磺酸卡莫司他杂质谱极其复杂，稳定性差，容易降解。为了保证用药安全，对甲磺酸卡莫司他进行有关物质控制是十分必要的。
杂质C为4-(4-胍基苯甲酰氧基)苯乙酸甲磺酸盐，其结构式如下：
Figure 149912DEST_PATH_IMAGE003
杂质J为4-(4-(4-胍基苯甲酰氧基)胍基苯甲酰氧基)苯乙酸[2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基]酯三氟乙酸盐，其结构式如下：
Figure 891691DEST_PATH_IMAGE004
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法，该方法可用于甲磺酸卡莫司他有关物质的测定和在合成工艺中使用4-二甲氨基吡啶作为催化剂和N,N-二甲基甲酰胺作为精制溶剂的药物中残留量的测定的应用。
色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A是庚烷磺酸钠和三氟乙酸的混合溶液；流动相B是乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃任一种或者两种的混合液，稀释剂是纯水或其与甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃任一种或两种的混合溶液；
检测器为紫外检测器，二极管阵列检测器中的一种；
以一定量的样品浓度进样分析。
优选地，所述的稀释剂为纯水与乙腈的混合溶液。
进一步，所述的纯水与乙腈的混合溶液为70%~98%乙腈水溶液，所述百分数为体积分数。
优选地，所述的流动相A中庚烷磺酸钠为0.05%~0.5%，所述百分数为质量分数；三氟乙酸为0.05%~0.1%，所述百分数为体积分数。
优选地，所述的流动相B为乙腈。
优选地，所述的流动相A和流动相B按梯度洗脱，按表1优选梯度设置如下：
表1 梯度洗脱
Figure 58230DEST_PATH_IMAGE005
优选地，所述色谱柱为Waters Xbridge RP18，流速为0.5-1.2ml/min，柱温为30~40℃。
优选地，所述检测器为二极管阵列检测器，检测波长为230nm和265nm双波长。
优选地，所述的样品浓度为1.0~2.5mg/ml。
本发明进一步公开了该检测方法在合成工艺中溶剂残留量的测定方面的应用，所述的合成工艺指的是：使用4-二甲氨基吡啶作为催化剂和N,N-二甲基甲酰胺作为精制溶剂的合成工艺。实验结果显示该方法具有良好的专属性、灵敏度、精密度和准确度。
本发明提供的甲磺酸卡莫司他有关物质的检测方法采用高效液相色谱法实现了同时对对羟基苯乙酸、中间体3、5、工艺杂质及降解杂质进行快速准确测定，具有较高的灵敏度和专属性，操作简捷，分离度符合标准（所有杂质峰之间分离度均大于2.0，杂质峰与主峰的最小分离度为2.0）。因此，可用于甲磺酸卡莫司他的质量控制，同时还能在合成工艺中使用4-二甲氨基吡啶作为催化剂和精制溶剂为N,N-二甲基甲酰胺的药物中其残留量的测定，具有现实意义。
本发明主要解决了甲磺酸卡莫司他有关物质测定中不能将所有杂质完全分离和部分杂质不易保留的问题，重点考察了本专利所述检测方法的专属性、灵敏度和准确度。主要的难点在于增加不易保留杂质的保留时间，可以达到准确定量，使强保留化合物具有非常高的检测灵敏度，并且保证所有化学性质非常的杂质完全达到基线分离。甲磺酸卡莫司他有关物质仅被日本药典收录，该方法采用专属性差、灵敏度低、准确度较差的波层色谱法。专利所诉检测方法具有非常高的创新性和新颖性。
附图说明
图1为稀释剂定位溶液液相色谱图；
图2为中间体5定位溶液液相色谱图；
图3为中间体3定位溶液液相色谱图；
图4为杂质C定位溶液液相色谱图；
图5为杂质J定位溶液液相色谱图；
图6为对羟基苯乙酸定位溶液液相色谱图；
图7为甲磺酸卡莫司他定位溶液液相色谱图；
图8为混合溶液液相色谱图；
图9为对羟基苯乙酸线性和范围图；
图10为中间体3线性和范围图；
图11为中间体5线性和范围图；
图12为杂质C线性和范围图；
图13为杂质J线性和范围图；
图14为甲磺酸卡莫司他线性和范围图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
1）实验条件
Agilent1260-DAD高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters Xbridge RP18 4.6×150mm 3.5μm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
样品浓度：1mg/ml；
稀释剂：90%乙腈水溶液；
检测波长：230nm和265nm;
流动相A：庚烷磺酸钠为0.075%（质量分数），三氟乙酸的体积分数为0.1%（体积分数）。
流动相B：乙腈
Figure 807880DEST_PATH_IMAGE006
2）溶液制备
杂质对照品储备液：分别取对羟基苯乙酸对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品及杂质J对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质10μg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取甲磺酸卡莫司他对照品10mg，置于10ml量瓶中，加入1ml对照品储备液，用稀释剂溶解并定容。
3）测定法
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
4）实验结果
表2 实验结果
Figure 168717DEST_PATH_IMAGE007
从上表可以看出，各化合物分离度良好。
实施例2
实验条件：
Agilent1260-DAD高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters Xbridge RP18 4.6×150mm 3.5μm；
流速：1.0mL/min；
检测波长：230nm及265nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
样品浓度：1mg/ml；
稀释剂：90%乙腈水溶液；
检测波长：230nm和265nm;
流动相A：庚烷磺酸钠为0.075%（质量分数），三氟乙酸的体积分数为0.05%（体积分数）。
流动相B：乙腈
Figure 371028DEST_PATH_IMAGE008
2）溶液制备
杂质对照品储备液：分别取对羟基苯乙酸对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品及杂质J对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质10μg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取甲磺酸卡莫司他对照品10mg，置于10ml量瓶中，加入1ml对照品储备液，用稀释剂溶解并定容。
3）测定法
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
4）实验结果
表3 实验结果
Figure 606837DEST_PATH_IMAGE009
从上表可以看出，各化合物分离度良好。
实施例3
实验条件：
Agilent1260-DAD高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters Xbridge RP18 4.6×150mm 3.5μm；
流速：0.8mL/min；
检测波长：230nm及265nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
样品浓度：1mg/ml；
稀释剂：90%乙腈水溶液；
检测波长：230nm和265nm;
流动相A：庚烷磺酸钠为0.075%（质量分数），三氟乙酸的体积分数为0.10%（体积分数）。
流动相B：乙腈
Figure 915721DEST_PATH_IMAGE010
2）溶液制备
杂质对照品储备液：分别取对羟基苯乙酸对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品及杂质J对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质10μg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取甲磺酸卡莫司他对照品10mg，置于10ml量瓶中，加入1ml对照品储备液，用稀释剂溶解并定容。
3）测定法
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
4）实验结果
表4 实验结果
Figure 945994DEST_PATH_IMAGE011
从上表可以看出，各化合物分离度良好。
实施例4
实验条件：
Agilent1260-DAD高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters Xbridge RP18 4.6×150mm 3.5μm；
流速：1.2mL/min；
检测波长：230nm及265nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
样品浓度：1mg/ml；
稀释剂：90%乙腈水溶液；
检测波长：230nm和265nm;
流动相A：庚烷磺酸钠为0.075%（质量分数），三氟乙酸的体积分数为0.05%（体积分数）。
流动相B：乙腈
Figure 901181DEST_PATH_IMAGE012
2）溶液制备
杂质对照品储备液：分别取对羟基苯乙酸对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品及杂质J对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质10μg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取甲磺酸卡莫司他对照品10mg，置于10ml量瓶中，加入1ml对照品储备液，用稀释剂溶解并定容。
3）测定法
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
4）实验结果
表5 实验结果
Figure 707725DEST_PATH_IMAGE013
从上表可以看出，各化合物分离度良好。
实施例5
实验条件：
Waters 超高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters BEH C18 2.1×100mm 1.7μm；
流速：0.2mL/min；
检测波长：230nm及265nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
样品浓度：1mg/ml；
稀释剂：90%乙腈水溶液；
检测波长：230nm和265nm;
流动相A：庚烷磺酸钠为0.05%（质量分数），三氟乙酸的体积分数为0.05%（体积分数）。
流动相B：乙腈
Figure 369650DEST_PATH_IMAGE014
2）溶液制备
杂质对照品储备液：分别取对羟基苯乙酸对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品及杂质J对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质10μg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取甲磺酸卡莫司他对照品10mg，置于10ml量瓶中，加入1ml对照品储备液，用稀释剂溶解并定容。
3）测定法
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
4）实验结果
表6 实验结果
Figure 570825DEST_PATH_IMAGE015
从上表可以看出，各化合物分离度良好。
实施例6
一、仪器与条件
Waters高效液相色谱仪；Milli-Q 超纯水机；梅特勒XS205DU电子天平、超声波清洗器；真空过滤装置；色谱柱：Waters Xbridge RP18 4.6×150mm 3.5μm；流动相A：庚烷磺酸钠为0.05%（质量分数），三氟乙酸的体积分数为0.05%（体积分数）按下表梯度洗脱：
Figure 13307DEST_PATH_IMAGE016
流速：1.0mL/min；检测波长：230nm及265nm；柱温：35℃；进样量：10 μL；样品浓度：1mg/ml；稀释剂：90%乙腈水溶液。
二、实验步骤
1. 溶液的配制：
杂质对照品储备液：分别取对羟基苯乙酸对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品及杂质J对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质10μg的溶液。
线性溶液：分别将起始物料对照品、中间体3对照品、中间体5对照品、杂质C对照品、杂质J对照品及甲磺酸卡莫司他对照用稀释剂制成浓度为LOQ浓度~3μg/ml的混合溶液。
系统适用性溶液：精密称取甲磺酸卡莫司他对照品10mg，置于10ml量瓶中，用杂质对照品储备液溶解并定容。
甲磺酸卡莫司他定位溶液：取甲磺酸卡莫司他对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含1.0mg的溶液。
对羟基苯乙酸定位溶液：取对羟基苯乙酸对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含10μg的溶液。
中间体3定位溶液：取中间体3对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含10μg的溶液。
中间体5定位溶液：取中间体3对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含10μg的溶液。
杂质C定位溶液：取杂质C对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含10μg的溶液。
杂质J定位溶液：取杂质J对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含10μg的溶液。
混合溶液：同系统适用性溶液。
对照品溶液：精密量取杂质对照品储备液0.1ml，置于100ml量瓶中，用稀释剂溶解并定容。
供试品溶液：取本品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含甲磺酸卡莫司他1.0mg的溶液，平行制备两份。
0.1%自身对照溶液：精密量取供试品溶液0.1ml，置于100ml量瓶中，用稀释剂溶解并定容。
2. 方法学验证
2.1 专属性试验
分别取稀释剂、对羟基苯乙酸定位溶液、中间体3定位溶液、中间体5定位溶液、杂质C定位溶液、杂质J定位溶液、甲磺酸卡莫司他定位溶液及混合溶液各10μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图。见表7 和附图1~8。
表7 定位实验结果
Figure 820945DEST_PATH_IMAGE017
2.2 线性和范围，检出限和定量限
实验结果见表8、表9和附图9~14。
表8 线性和范围实验结果
Figure 462011DEST_PATH_IMAGE018
表9 灵敏度实验结果
Figure 460185DEST_PATH_IMAGE019
2.3 样品测定
对羟基苯乙酸及中间体3，采用对照品外标法进行测定，中间体5、杂质C及杂质J采用加相对响应因子的主成分自身对照法进行测定。
2.4 结论
该方法可以实行甲磺酸卡莫司他有关物质的准确定量，达到质量控制的目的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种采用高效液相色谱检测甲磺酸卡莫司他有关物质的方法，其特征在于：所述检测方法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A是庚烷磺酸钠和三氟乙酸的混合溶液；所述的流动相A中庚烷磺酸钠的质量百分数为0.05%~0.075%，三氟乙酸的体积百分数为0.05%~0.1%；流动相B是乙腈；
稀释剂为体积份数为70%~98%乙腈水溶液；所述的流动相A和流动相B按梯度洗脱，梯度设置如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述流动相的流速为0.2-1.2ml/min；
所述色谱柱选自： Kromasil C18、ODS-C18、Thermo Syncronis C18、Thermo HypersilGOLD C18 、Waters symmetry C18、Waters RP C18、Agilent XDB C18、Agilent EclipsePlus C18、Shimadzu GL ODS C18、Waters BEH C18 、Waters Xbridge RP18；
所述色谱柱的柱温为35℃； 以一定样品浓度进样，所述样品浓度为1.0-2.5mg/ml；
检测器为紫外检测器，二极管阵列检测器中的一种；所述检测器的检测波长为230 nm和265nm;
所述的甲磺酸卡莫司他有关物质指的是：中间体5、中间体3、杂质C、杂质J、对羟基苯乙酸；其中，中间体5结构式如下：
Figure 509594DEST_PATH_IMAGE002
中间体3结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
杂质C结构式如下：
Figure 722007DEST_PATH_IMAGE004
杂质J结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱为Waters Xbridge RP18。
3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：流动相的流速为0.5-1.2ml/min。
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