CN111727046A - 类二十烷酸产生促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明欲解决的课题是提供一种医疗组合物，其促进来自巨噬细胞的PPARγ活化物质的产生。本发明的解决手段是一种类二十烷酸产生促进剂，其包含间充质干细胞的分泌物作为有效成分，且是用于促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生，类二十烷酸是15‑脱氧‑δ‑12，14‑前列腺素J2以及15‑羟基二十碳四烯酸(15‑HETE)的任一方或两方。

Description

类二十烷酸产生促进剂
技术领域
本发明是涉及一种医药组合物，其促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生。
背景技术
巨噬细胞中的PPARγ的活化会抑制往脂多糖(LPS)及干扰素γ(INFγ)处理所导致的巨噬细胞的炎症型表现系的转变(非专利文献1)。产生生物防御所需要的一氧化氮的iNOS基因若过剩地表现则会成为使炎症反应恶化的要因，但PPARγ的活化配体亦即15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)会显着地抑制iNOS基因的转录程度与控制其基因表现的NFκB的活化程度。
再者，巨噬细胞中的PPARγ的活化被报告有助于肌肉的再生。已报告PPARγ的缺损会导致骨骼肌的再生不良，相反地，被配体活化的PPARγ会促进转化生长因子(TGF)家族的生长分化因子3(GDF3)的基因表现，GDF3通过促进肌前驱细胞的分裂会促进肌肉的再生(非专利文献2)。
又，巨噬细胞中的PPARγ缺损动物不会进行往抗炎症型巨噬细胞(M2型)的分化，在摄取高脂肪食物的小鼠中，葡萄糖负荷时的耐糖能力低下，显示胰岛素感受性降低(非专利文献3)。
日本特许第3518547号公报(专利文献1)中记载作为免疫抑制剂的类二十烷酸。
日本特许第5950428号公报(专利文献2)中，作为PPARγ配体的例子，记载有15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2、硝化亚油酸、氧化LDL、长链脂肪酸、类二十烷酸、噻唑烷二酮类药剂以及非类固醇性抗炎症药。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第3518547号公报
专利文献2：日本特许第5950428号公报
非专利文献
非专利文献1：Nature.1998 Jan 1；391(6662)：79-82.
非专利文献2：Immunity.2016 Nov 15；45(5)：1038-1051.
非专利文献3：Nature.2007 Jun 28；447(7148)：1116-1120.
发明内容
发明所欲解决的课题
由上述背景可知，期望一种可使巨噬细胞中的PPARγ活化的医药组合物。
于是，本发明的目的在于提供一种医疗组合物，其促进来自巨噬细胞的PPARγ活化物质的产生。
解决课题的技术方案
本发明基本上是基于以下见解：间充质干细胞的培养上清液等包含间充质干细胞的分泌物者，因为促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生，且类二十烷酸为PPARγ活化配体，所以会使PPARγ活化。
本说明书的第一形态是涉及用于促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生的类二十烷酸产生促进剂。此剂包含间充质干细胞的分泌物作为有效成分。
间充质干细胞优选为源自皮下脂肪组织或脐带组织的间充质干细胞。
类二十烷酸优选为15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)以及15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)的任一方或两方。
间充质干细胞的分泌物的例子是间充质干细胞的培养上清液、或间充质干细胞的培养上清液的成分，优选为使用无血清培养基的培养上清液。
此剂优选为不含有IL-4。所谓不含有IL-4，除了剂完全不包含IL-4以外，也包含剂不包含表现生理活性的量的IL-4。
此剂优选为动脉硬化或糖尿病的治疗剂。
此剂优选为类风湿性关节炎的治疗剂。
此剂优选为前列腺癌、脑梗塞或脑功能障碍的预防剂或治疗剂。
此剂优选为疼痛的预防剂或治疗剂。
发明效果
根据本发明，可提供一种医疗组合物，其促进来自巨噬细胞的PPARγ活化物质的产生。
附图说明
图1A是显示15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2的定量分析结果的取代图片的图表。
图1B是显示15-HETE的定量分析结果的取代图片的图表。
图2A是显示培养后的细胞的取代图片的照片。
图2B是显示定量RT-PCR的结果的取代图片的图表。
图3是显示CD36染色后的荧光显微镜照片的取代图片的照片。图中Merge(合并)表示相差照片与CD36染色的荧光照片重叠的影像。
图4是显示IL-4的表现量的ELISA定量分析结果的取代图片的图表。
具体实施方式
本发明基本上是基于以下见解：间充质干细胞的培养上清液等包含间充质干细胞的分泌物者，因为促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生，且类二十烷酸为PPARγ活化配体，所以会使PPARγ活化。
PPARγ是通过配体结合而活化的转录活化因子，最为人熟知的功能是作为促进往脂肪细胞的分化的主调整器。另一方面，巨噬细胞中的PPARγ作为具有医疗上重要作用的因子而言也是重要的。
作为PPARγ的内源性活化配体，存在15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)、15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)、前列腺素D2(PGD2)、血清素代谢物的5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)、5-甲氧基吲哚乙酸(5-MIA)等，作为合成活化配体，已知有噻唑烷类的罗格列酮、吡格列酮、NSAIDs类的吲哚美辛等。虽有多种物质会活化PPARγ，但依据PPARγ的结合部位分类成具有完整作用的完全激动剂、与具有部分作用的部分激动剂。
如同上述，虽是将特定的脂肪酸代谢物及类二十烷酸作为内源性配体的PPARγ，但前列腺素E2不发挥作为PPARγ的配体的功能。
又，被贩售作为糖尿病改善药的PPARγ活化剂亦即吡格列酮(15mg锭)，其最高血中浓度到达时间(T-max)是2.1±0.9小时，血中浓度半衰期(T-half)是5.3±1.6小时，为了弥补血中浓度的降低，通常对于成人会1日1次给药15mg的吡格列酮(医药品详细说明书 日本药典 吡格列酮盐酸盐锭)。再者，吡格列酮对于心力衰竭患者、严重的肾功能障碍患者、严重的肝功能障碍患者等有其使用禁忌，对于罹患作为糖尿病合并症的肾功能衰竭的患者，也有使用限制。
本说明书的第1形态是涉及用于促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生的类二十烷酸产生促进剂。
此剂包含间充质干细胞的分泌物作为有效成分。间充质干细胞的分泌物的例子是培养上清液、或培养上清液来源的成分。间充质干细胞优选为源自皮下脂肪组织或脐带组织的间充质干细胞。间充质干细胞的分泌物的例子是间充质干细胞的培养上清液、或间充质干细胞的培养上清液的成分，优选为使用无血清培养基的培养上清液。此剂优选为不含有表现生理活性的量的IL-4。
间充质干细胞是具有抗炎症作用的细胞集团，且细胞性医药品的开发正在进行中。在间充质干细胞与担任炎症反应的中心角色的巨噬细胞之间，存在密切的功能性相关。间充质干细胞使巨噬细胞从M1型(炎症型)变化成M2型(抗炎症型)，使炎症反应结束。其作用是由间充质干细胞所分泌的蛋白质的C-C基序趋化因子配体2(CCL2)、与唾液酸受体蛋白质家族的Siglec-9(J Neurosci.2015 Feb 11；35(6)：2452-64.)或类二十烷酸的前列腺素E2(PGE2)承担(Luan B.et.al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Dec 22；112(51)：15642-7.)。
如同上述，PPARγ的活化大多带来临床上有益的结果。又，巨噬细胞中的PPARγ的功能是特别重要的1个。至今为止，作为增强来自巨噬细胞的PPARγ的内源性配体的产生，已报告利用白细胞介素4(IL-4)(Nature.1999 Jul 22；400(6742)：378-82.)。然而，白细胞介素4除了所述作用以外，因存在IgE的产生促进、特应性皮炎、过敏反应的感受性上升等副作用的风险，所以现实上难以选择其作为在生物体内进行作用的剂。实际上，抗白细胞介素4/13受体的单克隆抗体已被承认作为特应性皮炎的治疗药(附件人类型抗IL-4/13受体单克隆抗体赛诺菲股份有限公司)。
在本发明中，偶然而崭新地发现间充质干细胞所分泌的成分具有促进来自巨噬细胞的PPARγ活化配体的产生的作用。更具体而言，15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)以及15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)与其相应。
针对使PPARγ配体的产生增加的剂及方法，目前几乎一无所知。前述的白细胞介素4虽在一部分的报告中已显示表示IL-4是由间充质干细胞分泌的资料(PLoS One.2013Sep 12；8(9)：e73722.)，但白细胞介素4主要是由肥大细胞及活化T细胞等所产生的因子，在间充质干细胞中通常未见其表现。本发明的间充质干细胞来源培养上清液中，也不含有白细胞介素4。因此，本发明的新颖性存在于间充质干细胞来源培养上清液，其发挥作为PPARγ活化配体产生促进剂的功能，且特征是不含有白细胞介素4。
本发明的医药组合物确认到通过其所含有的白细胞介素4以外的物质，而具有间充质干细胞的分泌物增强PPARγ的配体产生的作用。
具有PPARγ的配体产生促进作用的间充质干细胞的分泌物，通常可以间充质干细胞的培养上清液的形态而获得。间充质干细胞虽期望是源自脂肪组织或脐带组织，但不限定分离间充质干细胞的组织，也可是由牙髓、羊膜、骨髓或脐带血所分离的间充质干细胞，甚至由胚胎干细胞(ES细胞)所分化诱导的间充质干细胞、以及由人工多能性干细胞(iPS细胞)所分化诱导的间充质干细胞。
又，用于有效地实施本发明的间充质干细胞，可为人类来源也可为动物来源。供至培养的组织尽可能地排除微生物的混入，因应需要也可利用抗菌剂或抗真菌剂等实施除菌或静菌处理。在培养中，为了无微生物的繁殖，而需要以无菌操作进行培养。
在间充质干细胞的培养中，可任意地选择一般细胞生物学实验等所使用的烧瓶、酶，优选为选择无血清培养基作为细胞增殖培养基以及培养上清液回收培养基。更期望为，针对全部试药及培养基、烧瓶等，可选择不使用动物或人类来源成分的产品，可确保作为医药组合物的生物学安全性。
作为用于回收间充质干细胞的培养上清液的间充质干细胞的细胞分裂次数(PDL)虽未被特别限定，但在非转化细胞中期望是PDL0至100，再优选为选择PDL5至20。最适值会依据此等所使用的培养基而变化。在转化细胞中，只要维持细胞的形质，则可继续回收培养上清液。
作为细胞播种数，在以T烧瓶等平面培养实施培养上清液的回收的情形，是以100至50,000cells/cm2播种细胞，更优选为以500至15,000cells/cm2播种，最优选为以2,000至6,000cells/cm2播种。又，作为本发明的PPARγ配体产生促进剂的培养上清液回收的时间点，在平面培养的情形，可在从细胞增殖率成为烧瓶面积的约90％的时间点起至第20日为止的期间进行回收，更优选为从第2日起至第5日进行回收。
又，除了平面培养以外，通过中空纤维培养、使用微载体的培养，也可回收培养上清液，只要是良好地培养间充质干细胞的环境，则培养方法未被限定。
但是，不能采取会被生物化学手法检测到的量的白细胞介素4蛋白质以表现生理活性的浓度分泌在间充质干细胞的培养上清液中的任何培养方法。更具体而言，白细胞介素4的浓度优选为1pg/mL以下。
确认培养上清液中不含有所述浓度以上的白细胞介素4的否定试验，选择使用白细胞介素4的抗体的ELISA法或蛋白质印迹法。其情形，在充分考虑到抗体本身所具有的非特异性反应的特性的基础上，也同时实施对于培养上清液的控制组样品的定量，通过与其的结果的妥当比较，实施者注意需要慎重地进行判断。若更具体地说明，随处可见抗体显示对非特异性抗原的反应，尤其在被贩售作为研究用试药的抗体中具有所述倾向。配合抗体库的否定试验，利用基因表现分析补全显示无白细胞介素4的基因表现也是有效的。
接下来，所得的包含间充质干细胞的分泌物的培养上清液，期望被保管在多数物质稳定的4℃以下的冷藏或冷冻状态。所得的培养上清液可供至选自通常0.1至0.2μm的PES素材的过滤器的无菌处理、用于去除病毒的病毒清除过滤器、用于成分浓缩的超过滤过滤器等。
如此一来，作为通过本发明的实施而得的医药组合物的包含间充质干细胞来源分泌物的培养上清液，通过使巨噬细胞直接作用，可促进来自被作用的巨噬细胞的PPARγ配体产生。在试管内，只要对所培养的巨噬细胞直接添加间充质干细胞来源培养上清液即可。一般而言，通过1日至3日的处理，增强来自巨噬细胞的PPARγ配体产生，在巨噬细胞的培养液中也回收PPARγ配体。此外，理所当然地，也可从巨噬细胞的细胞内回收往细胞外分泌前的PPARγ配体。
此外，巨噬细胞存在于生物体中的所有组织，在骨髓以及血管内是作为分化程度低的单核细胞，在其他组织中是作为组织巨噬细胞，有肺中的肺泡巨噬细胞、脑中的胶质细胞、骨中的破骨细胞、肠中的肠道巨噬细胞、肝脏中的库弗氏细胞、脾脏中的边缘区巨噬细胞等。针对在生物体内使本发明进行作用的情形，只要通过将由本发明的医药组合物有效地送达至想活化来自巨噬细胞的PPARγ配体产生的组织，而使PPARγ配体的产生增强即可。更具体而言，例如若为肝脏则可从肝门静脉给药使用本发明的剂，在脑中则可经由鼻腔粘膜上皮而经鼻直接送达脑而使用。皮下可进行注射或涂布。为了最广泛地全身性地使本医药组合物进行作用，能选择从静脉的注射。又，可因应其等的送达方法而构成适当的医药组合物的组成。若显示一例，则在以涂布使用本发明作为皮下给药剂时，可配合促进往皮下的渗透的成分亦即缓释性医药品基材(乳酸乙醇酸共聚物：PLGA)等，而有效地送达本发明的医药组合物。
若增强来自巨噬细胞的PPARγ配体产生，则理所当然地也会活化最邻近存在的本身的巨噬细胞的PPARγ。作为其结果，巨噬细胞的PPARγ对于与发病相关的疾病群会发挥治疗效果，因此本医药组合物能成为其等的预防剂或治疗剂。
间充质干细胞的培养上清液的例子，是将通过离心分离而将培养上清液进行固液分离所得的上清液成分亦即培养上清液，通过冷冻干燥去除水分而得的处理物、使用蒸发器等将培养上清液进行减压浓缩而得的处理物、使用超过滤膜等浓缩培养上清液而得的处理物、或使用过滤器将培养上清液进行固液分离而得的处理物、或在进行如上述处理前的培养上清液的原液。又，例如，将已培养本发明的间充质干细胞的上澄清液进行离心分离(例如，1,000×g，10分钟)后，利用硫酸铵(例如，65％饱和硫酸铵)进行区分，将沉淀物以适当缓冲液进行悬浮后进行透析处理，以注射器过滤器(例如，0.2μm)进行过滤，可获得无菌的培养上清液。所采取的培养上清液可直接使用，也可先冷冻保存等到使用时再解冻使用。并且，也可添加药剂学所容许的载体，以成为易操作的液体量，例如0.2ml或0.5ml等的方式分注于灭菌容器。再者，作为感染性病原体风险的对策，也可通过病毒清除过滤器或紫外线照射处理培养上清液。
包含培养上清液作为有效成分的剂，如同例如日本特开2013-18756号公报、日本特许第5139294号以及日本特许第5526320号公报所公开，是周知的。因此，可使用周知的方法制造包含本发明的培养上清液的剂。
作为使用本发明的培养上清液的剂型，可选择液剂与固形剂这两种。在将蛋白质作为主剂的生物医药品中，因稳定性的问题，常选择保存性优异的粉体化。本发明的培养上清液为了提升稳定性与保存期间，也期望以固形剂的形态被制造。
本发明的剂，可同时制造作为有效成分的培养上清液以及药学上所容许的载体或媒体。药学上所容许的载体或媒体，可列举例如赋形剂、稳定化剂、溶解辅助剂、乳化剂、悬浮化剂、缓冲剂、等张化剂、抗氧化剂或保存剂等药学上所容许的物质。又，也可使用聚乙二醇(PEG)等高分子材料或环糊精等共轭化防物。赋形剂的例子是淀粉及乳糖等其本身不具有药理作用的赋形剂。稳定化剂的例子是白蛋白、明胶、山梨糖醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖以及葡萄糖。在此等之中，优选为蔗糖或海藻糖。溶解辅助剂的例子是乙醇、甘油、丙二醇以及聚乙二醇。乳化剂的例子是卵磷脂、硬脂酸铝或失水山梨醇倍半油酸酯。悬浮化剂的例子是聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或羧甲基纤维素(CMC)。等张化剂的例子是氯化钠以及葡萄糖。缓冲剂的例子是柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸以及磷酸盐。作为稀释培养上清液制剂的水性媒质，只要适当使用例如将渗透压及pH调整在生理的范围、已调整盐类浓度等的注射用水溶液等即可，例如可使用乙酸林格氏液、糖-乙酸林格氏液等林格氏液或其他输液、生理盐水或葡萄糖液等，但不限于此等。抗氧化剂的例子是抗坏血酸、亚硫酸氢钠以及焦亚硫酸钠。保存剂的例子是酚、硫柳汞以及苯扎氯铵。
本发明的间充质干细胞的培养上清液等包含间充质干细胞的分泌物的剂(本发明的剂)可使用静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、腹腔内给药、鼻腔内给药、脊髓腔内移植、关节内移植、牙肉内注射、涂布等周知的给药方法进行给药。本发明的剂可直接注射在患部或对象部位，也能通过外科手术将患部开口而给药本发明的剂。依据成为对象的疾病，任何最适合的给药方法都是可能的。在选择静脉内注射作为移植法的情形中，优选为将培养上清液以1mL以上且1,000mL以下进行给药作为1给药单位，更优选为以30mL以上且300mL以下进行给药。
此剂优选为动脉硬化或糖尿病的治疗剂。在日本特许第6250196号公报中记载PPAR激动剂是糖尿病的治疗剂。在日本特许第4515026号中显示活化PPARγ对于糖尿病的治疗是有效的。在日本特许第6157041号中显示PPARγ活化剂对于动脉硬化以及糖尿病的治疗是有效的。本发明的剂因会活化PPARγ，所以对于动脉硬化以及糖尿病的治疗是有效的。
此剂优选为类风湿性关节炎的治疗剂。在类风湿性关节炎模式中，已知15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2会抑制风湿病临床评分、疼痛以及浮肿(Mediators Inflamm.2016；2016：9626427.Epub 2016 Oct 31.)。本发明的剂是促进来自巨噬细胞的PPARγ的活化剂亦即类二十烷酸的产生，例如，因为促进15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2的产生，所以对于类风湿性关节炎的治疗是有效的。
此剂优选为前列腺癌、脑梗塞或脑功能障碍的预防剂或治疗剂。例如，在CancerRes.2001 Jan 15；61(2)：497-503.中，15-HETE抑制前列腺癌细胞株(PC3)的增殖，在多种癌肿中被报告抑制性作用。又，在J Lipid Res.2015 Mar；56(3)：502-14中，报告15-HETE的给药会抑制脑梗塞模式的脑缺血后的脑组织肝功能障碍程度、脑中的炎症反应。本发明的剂促进来自巨噬细胞的PPARγ的活化剂亦即类二十烷酸的产生，例如促进15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)的产生，因此对于前列腺癌的治疗是有效的。在日本特许第5940261号公报中，记载过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)活化剂会预防以及改善高血压症、胰岛素抵抗性疾病、脑梗塞、阿尔茨海默病、神经疾病中的至少一种。本发明的剂因为会活化PPARγ，所以对于脑梗塞以及脑功能障碍的预防以及治疗是有效的。
此剂优选为疼痛的预防剂或治疗剂。例如，在Exp.Ther.Med.2016 Oct；12(4)：2644-2650.中，PPARγ的活化剂亦即吡格列酮的给药会抑制神经肝功能障碍性疼痛中的活化小神经胶质细胞，其结果显示缓和对于机械刺激的疼痛阈值。本发明的剂促进来自巨噬细胞的PPARγ的活化剂亦即类二十烷酸的产生，例如促进15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2的产生，因此对于疼痛的预防或治疗是有效的。
此申请案也提供一种间充质干细胞的分泌物的使用，其是用于制造用于促进来自巨噬细胞的类二十烷酸的产生的类二十烷酸产生促进剂。
此申请案也提供一种促进来自存在于对象体内的巨噬细胞的类二十烷酸的产生方法，其包含对于对象给药间充质干细胞的分泌物的工序。此申请案也提供一种动脉硬化、糖尿病、类风湿性关节炎、前列腺癌、脑梗塞或脑功能障碍的治疗或予防方法，其包含对于对象给药间充质干细胞的分泌物的工序。
由本发明的医药组合物，通过促进来自生物体内的巨噬细胞的内源性PPARγ的活化配体的产生的作用，可持续地使生物体内的内源性PPARγ的活化配体的量增加。再者，通过需要PPARγ的活化的巨噬细胞产生此等活化配体，巨噬细胞本身可优先且有效地接受PPARγ的活化，变得不需要为了治疗而给药高浓度的PPAR活化配体，所以可期待成为在副作用方面也安全性高的医药组合物。
[实施例1]
1.巨噬细胞培养上清液中的类二十烷酸定量
为了评价来自间充质干细胞的分泌物对于来自巨噬细胞的类二十烷酸的分泌量造成的作用，在利用间充质干细胞的培养上清液处理人类巨噬细胞系细胞株THP-1后，定量来自巨噬细胞的类二十烷酸的分泌量。在类二十烷酸的定量中，将巨噬细胞的培养上清液使用于测定样品。
1.1来自脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液的制备
<原代培养(P0)>
由接受使用脂肪组织来源间充质干细胞的再生医学患者分取成为给药用细胞的制备所需要的原料的皮下脂肪组织后的剩余组织，在取得研究用利用用途的同意后，接受皮下脂肪的提供，供至原代培养。皮下脂肪组织供至离心分离(400×g且5分钟)，分离成由上依序是脂质部分、脂肪组织部分以及水性部分这3层。留下中层的脂肪组织部分，废弃上层与下层。对于残留的脂肪组织部分，每组织重量添加4倍量的0.15％胶原酶酵素溶液，在37℃使其浸透1小时，进行酶处理。在分散脂肪组织后，供至离心分离(400×g且5分钟)，作为包含间充质干细胞的间质血管细胞部分，将沉淀部分以30mL的PBS(-)溶液进行悬浮。之后，在细胞过滤器(70μm径)中将悬浮液进行通液，将通液部分再次供至离心分离(400×g且5分钟)，废弃被细胞过滤器捕捉到的组织残渣等。将沉淀部分以6mL的无血清培养液(Procul AD；乐敦制药)进行悬浮，将全部量播种在T-25烧瓶(CellBIND(注册商标)；康宁公司)，静置在培养箱内(37℃，5％CO2)开始原代培养。
<継代培养(P0→P1→P2)>
以3日1次的频率实施培养基全交换，废弃上澄清液，选择性地增殖在烧瓶底面上进行增殖的细胞。对于增殖至半汇合为止的T-25烧瓶的细胞，添加2mL的酶溶液(TrypLESecelt(注册商标)；赛默飞世尔科技公司)并进行剥离(37℃，静置5分钟)。将细胞以PBS(-)进行稀释，供至离心分离(400×g且5分钟)。将已沉淀的细胞以培养液进行悬浮，进行利用台盼蓝染色法的细胞数计测，以无血清培养液(Procul AD；乐敦制药)播种在T-150烧瓶(CellBIND(注册商标)；康宁公司)，静置在培养箱内(37℃，5％CO2)进行継代培养(P0→P1)。之后也同样地实施継代培养，获得需要的细胞数(P1→P2)。
<培养上清液的制备>
在培养上清液的制备中，培养基使用无血清培养液(Procul AD(注册商标)；乐敦制药)。在同培养基，每一个T-150烧瓶以4.5×105细胞的数量播种脂肪组织来源间充质干细胞，在到达半汇合的第3日，回收培养上清液。培养上清液是利用0.2μm的PES注射器过滤器(25mm GD/X注射器过滤器(PES 0.2μm已灭菌)；6896-2502；GE HEALTHCARE JAPAN)进行过滤，在使用于分析前冷冻保管在-28℃。
1.2来自脐带组织来源间充质干细胞的培养上清液的制备
<原代培养(P0)>
将获得进行一般分娩的产妇的同意所取得的脐带组织，在采取的隔天供至原代培养。从约10cm的脐带组织去除脐带血后，利用医疗用手术刀裁切成5mm左右，浸至0.15％胶原酶溶液，37℃且16小时，利用摇动器一边使其缓慢地搅拌一边进行酶处理。以目视确认脐带组织的分散后，以PBS(-)进行10倍稀释后，供至1,000×g且5分钟的离心分离，留下沉淀部分并废弃上层。之后，将沉淀部分以PBS(-)进行悬浮后，供至70μm的过滤器，将通液部分等分至2个离心管后，供至400×g且5分钟的离心分离，将包含细胞的沉淀部分以24mL的无血清培养液(Procul AD(注册商标)；乐敦制药)培养基进行悬浮。之后，将全量播种至1个T-150烧瓶(CellBIND(注册商标)；康宁公司)，静置在培养箱内(37℃，5％CO2)开始原代培养。
<継代培养(P0→P1→P2)>
以2日1次的频率实施培养基全交换，废弃上澄清液，选择性地增殖在烧瓶底面上进行增殖的细胞。对于增殖至半汇合为止的T-150烧瓶的细胞，添加6mL的酶溶液(TrypLESecelt(注册商标)；赛默飞世尔科技公司)并进行剥离(37℃，静置5分钟)。将细胞以PBS(-)进行稀释，供至离心分离(400×g且5分钟)。将已沉淀的细胞以培养液进行悬浮，进行利用台盼蓝染色法的细胞数计测，以无血清培养液(Procul AD；乐敦制药)播种在T-150烧瓶(CellBIND(注册商标)；康宁公司)，静置在培养箱内(37℃，5％CO2)进行継代培养(P0→P1)。以2日1次的频率实施培养基全交换，之后也同样地实施継代培养，确保需要的细胞数(P1→P2)。
<培养上清液的制备>
在培养上清液的制备中，培养基也使用无血清培养液(Procul AD(注册商标)；乐敦制药)。在同培养基，每一个T-150烧瓶以9.0×105细胞的数量播种脐带组织来源间充质干细胞，在到达半汇合的第3日，回收培养上清液。培养上清液是利用0.2μm的PES注射器过滤器(25mm GD/X注射器过滤器(PES0.2μm已灭菌)；6896-2502；GE HEALTHCARE JAPAN)进行过滤，在使用于分析前冷冻保管在-28℃。
1.3巨噬细胞的培养上清液制备
对于人类的巨噬细胞类细胞株THP-1的培养系统，添加如同上述所制备的由脂肪以及脐带组织来源间充质干细胞所得的培养上清液。作为控制组，添加间充质干细胞的培养上清液制备时的培养所使用的无血清培养液(Procul AD；乐敦制药)。
具体的顺序如同以下所述。以每1孔5.0×105将THP-1播种至T-25烧瓶(CellBIND；康宁公司)。培养基是对于添加10％FBS的RPMI添加用于活化THP-1的100nM LPS。培养基量设为每一个烧瓶是6.0mL。在其隔天进行培养基交换，每1孔各加入3.6mL的添加10％FBS的RPMI与2.4mL的受检物，并添加最终浓度100nM的LPS。作为受检物，是脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液、脐带组织来源间充质干细胞的培养上清液、或作为控制组的ProculAD培养基(乐敦制药)这3种类。之后进行2日培养，回收THP-1的培养上清液。所回收的培养上清液是利用0.2μm的PES注射器过滤器(25mm GD/X注射器过滤器(PES 0.2μm已灭菌)；6896-2502；GE HEALTHCARE JAPAN)进行过滤，在使用于分析前冷冻保管在-80℃。
1.4类二十烷酸定量
通过液相色谱法质谱分析(LC-MS/MS)，实施成为PPARγ的活化激动剂的类二十烷酸的定量。也针对经上述间充质干细胞来源培养上清液处理的THP-1的培养上清液、与间充质干细胞的培养上清液进行定量。
<标准物质的制备>
将测定对象的15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)以及15-HETE、还有内部标准物质的氘标记前列腺素E2(PGE2-d4)溶解于甲醇后，以超纯水进行2倍稀释，制备各10ng/mL的标准溶液。
<试料的前处理>
在THP-1的培养上清液900μL中添加100μL的5ng/mL PGE2-d4甲醇溶液并进行混合后，利用固相萃取管柱亦即Empore Solid Phase Extraction Cartridge C18 StandardDensity，4mm/1mL(3M)提纯包含类二十烷酸的部分。更具体而言，将甲醇1mL与超纯水1mL供至树脂的平衡化，在供给试料后，利用超纯水1mL洗净树脂。之后通过9,100×g且1分钟的离心分离进行脱水，将甲醇500μL供至洗脱。经洗脱的部分是通过旋转蒸发器进行离心干燥固定，添加甲醇50μL并利用摇动器进行溶解(2,500rpm，5分钟)。于此添加超纯水50μL进行混合，作为LC-MS/MS的测定样品。
<分析条件>
将LC-MS/MS的分析条件显示于表1。
[表1]
液相色谱法条件
Figure BPA0000290048390000141
质谱分析条件
Figure BPA0000290048390000142
测定对象物
Figure BPA0000290048390000143
<定量分析>
在峰的检测中使用分析软件MassLynx ver.4.1(沃特世公司)。检测极限设为信噪比(S/N)＝3。所检测的峰的面积值是除以内部标准物质(PGE2-d4)的峰面积值并进行标准化。10ng/mL标准溶液与分析试料的标准化后，由峰面积比以及前处理中的浓缩倍率(18倍)算出检体试料中的浓度。将定量结果显示于图1A以及图1B。图1A是显示15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2的定量分析结果的取代图片的图表。图1B是显示15-HETE的定量分析结果的取代图片的图表。
在脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液中以及脐带组织来源间充质干细胞的培养上清液中，皆未检测到15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)以及15-HETE(图1A以及图1B的“AD-CM”以及“UC-CM”)。另一方面，在THP-1的培养上清液中，在任一样品中皆检测到其等的类二十烷酸。针对15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)，经Prucul AD培养基处理的THP-1是0.001ng/mL(图1A以及图1B的“THP-1Procul AD”)，经脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液处理的THP-1是0.0014ng/mL(图1A以及图1B的“THP-1 AD-CM”)，经脐带组织来源间充质干细胞的培养上清液处理的THP-1是0.0018ng/mL(图1A以及图1B的“THP-1 UC-CM”)。接下来，针对15-HETE，经Prucul AD培养基处理的THP-1是0.006ng/mL，经脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液处理的THP-1是0.01ng/mL，经脐带组织来源间充质干细胞的培养上清液处理的THP-1是0.013ng/mL。借此可知，通过使包含间充质干细胞的分泌物的培养上清液对巨噬细胞进行作用，巨噬细胞所产生的15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)以及15-HETE的量会增加。发现间充质干细胞的分泌物是对于巨噬细胞的PPARγ活化激动剂的产生促进剂。
[实施例2]
2.PPARγ控制因子的基因表现分析
在已处理间充质干细胞的培养上清液的巨噬细胞类细胞(THP-1)中，实施由PPARγ控制的代表性基因亦即CD36以及FABP4的表现分析。通过利用PPARγ的活化激动剂处理细胞，两基因已知是PPARγ依赖性表现上升的主要基因，在知道PPARγ的活化状态的前提下可作为指标。
2.1细胞培养与RNA提取
以每1孔1×105cells将THP-1播种至12孔板(CellBIND；康宁公司)。培养基是对于添加10％FBS的RPMI添加用于活化THP-1的100nM PMA。培养基量设为每1孔是800μL。在其隔天进行培养基交换，每1孔添加600μL的添加10％FBS的RPMI与400μL的间充质干细胞培养上清液或控制组的培养基。作为间充质干细胞培养上清液，使用与在“实施例1”使用于类二十烷酸定量者相同批量的样品，并使用由脂肪组织来源间充质干细胞与脐带组织来源间充质干细胞所制备的培养上清液。作为控制组的培养基，设为在制备间充质干细胞的培养上清液时使用于细胞培养的无血清培养基Procul AD(乐敦制药)与未添加FBS的RPMI。
再在3日后去除培养基，以TRI试剂(Molecular Research Center；TR118)溶解细胞，使用SV总RNA纯化系统(Promega；Z3100)，遵循试剂盒所附的说明书进行总RNA的提取。将已进行RNA提取的细胞的照片显示于图2A。图2A是显示培养后的细胞的取代图片的照片。
2.2定量RT-PCR
由各1μg的总RNA，利用PrimeScript(注册商标)II 1st strand cDNA SynthesisKit(宝日医生物技术；6210A)，进行由Oligo dT引物所导致的反转录反应。將所得的cDNA作為模板，使用THUNDERBIRD(注册商标)SYBR qPCR Mix(TOYOBO；QPS-201)，進行CD36基因以及FABP4基因的定量PCR。装置是使用Mx3000P(安捷伦科技)，引物是使用下述。各基因表现量的内部补正是使用GAPDH基因。
“PPARγ引物序列”
PPARγ-Fw：gacaggaaagacaacagacaaatc(序列编号1)
PPARγ-Rv：ggggtgatgtgtttgaacttg(序列编号2)
“FABP引物序列”
FABP4-Fw：ccaccataaagagaaaacgagag(序列编号3)
FABP4-Rv：gtggaagtgacgcctttcat(序列编号4)
“CD36引物序列”
CD36-Fw：gcagcaacattcaagttaagca(序列编号5)
CD36-Rv：gctgcaggaaagagactgtgt(序列编号6)
“GAPDH引物序列”
GAPDH-Fw：ttcaccaccatggagaagg(序列编号7)
GAPDH-Rv：cacacccatcacaaacatgg(序列编号8)
PCR条件是遵循试药制造商的程序手册而实施。针对PCR反应液的组成，设定成如同表2的a，PCR反应条件是如同表2的b而实施。
[表2]
Figure BPA0000290048390000171
[表3]
Figure BPA0000290048390000172
将定量RT-PCR的结果显示于图2B。PPARγ的反应基因亦即FABP4与CD36，在已处理来自脂肪组织来源间充质干细胞以及脐带组织来源间充质干细胞的分泌物的培养上清液的THP-1中(图2B中将前者标记为“AD-CM”，将后者标记为“UC-CM”)，相较于控制组的培养基添加组(图2B中的“RPMI”以及“Procul AD”)，被辨识到各基因表现量的大幅增加。在“实施例1”为了类二十烷酸定量而添加至THP-1的控制组的样品是“Procul AD”，但相较于已处理Procul AD的THP-1，在已检测到15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2(15-deoxy-δ-12，14-PGJ2)以及15-HETE的产生增加的THP-1中(已进行间充质干细胞来源培养上清液处理的THP-1)，确认到PPARγ的反应基因亦即FABP4与CD36的表现上升。
2.3 CD36抗体免疫染色
接下来，针对通过PPARγ而受到表现诱导，且具有将氧化脂质等捕捉进细胞内的功能等的清道夫受体的CD36，评价由间充质干细胞的分泌成分的作用所导致的蛋白质表现诱导。
具体的顺序如同以下。以每1孔2.5×105将THP-1播种至6孔板(CellBIND；康宁公司)。培养基是对于添加10％FBS的RPMI添加用于活化THP-1的100nM LPS。培养基量设为每1孔是3mL。在其隔天进行培养基交换，每1孔添加1.8mL的添加10％FBS的RPMI与1.2mL的受检物，并添加最终浓度100nM的LPS。作为受检物，是脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液、RPMI基本培养基、或Procul AD培养基(乐敦制药)这3种类。之后进行3日培养，供至人类抗CD36抗体免疫染色。
以4％多聚甲醛(PFA)在15分钟室温固定细胞，并利用已以PBS(-)稀释而制备的0.01％曲拉通X-100(Tx-100)洗净3次。接下来，在已添加3％牛血清白蛋白(BSA)的0.01％Tx100/PBS(-)中在室温进行30分钟封闭，接着，利用已以3％BSA/0.01％Tx100/PBS(-)稀释1,000倍的抗CD36抗体溶液，将细胞进行免疫染色(PE anti-Human CD36(BioLegend；Cat.336206)。之后，以3％BSA/0.01％Tx100/PBS(-)进行3次洗净，立刻以荧光显微镜(基恩士；BZ-X)观察利用藻红蛋白(PE)检测条件的CD36的染色像。
将其结果显示于图3。相较于控制组的RPMI基本培养基、以及已处理Procul AD培养基的THP-1中的CD36蛋白质的表现量，在已处理脂肪组织来源间充质干细胞的培养上清液的THP-1(图3的“AD-CM”)中，显示其表现量增加，检测到强荧光信号。此准照图2B中的CD36基因表现分析结果。由此等确认，在受到间充质干细胞的培养上清液的作用的巨噬细胞中，通过PPARγ的活化会诱导表现的因子产生表现诱导。
[实施例3]
3.间充质干细胞培养上清液的白细胞介素4(IL-4)蛋白质表现定量
作为促进来自巨噬细胞的PPARγ配体产生的既知因子，已知有白细胞介素4(IL-4)。作为由实施例1所示的作用，在处理由间充质干细胞所制备的培养上清液的巨噬细胞类细胞(THP-1)中，虽增强PPARγ的产生，但为了验证其是由IL-4的作用所导致，而定量在间充质干细胞的培养上清液中的IL-4蛋白质的分泌量。
3.1培养上清液的制备
用于测定的间充质干细胞的培养上清液是由脂肪组织来源间充质干细胞与脐带组织来源间充质干细胞进行制备，将前者设为“AD-CM”，将后者设为“UC-CM”。将分别由2个不同的组织提供者提供者所制备的检体供至分析，将在“实施例1”以THP-1处理的培养上清液设为“AD-CM-1”以及“UC-CM-1”。此外，针对培养上清液“AD-CM-2”与“UC-CM-2”的制备，也遵循“实施例1”所记载的“AD-CM-1”以及“UC-CM-1”的制备法。培养上清液利用0.2μm的PES注射器过滤器(25mm GD/X注射器过滤器(PES0.2μm已灭菌)；6896-2502；GE HEALTHCAREJAPAN)进行过滤，在使用于分析前冷冻保管在-28℃。
3.2 ELISA定量
使用市售的ELISA试剂盒(Human IL-4 Quantikine HS ELISA Kit；HS400；R&DSYSTEMS)，依据协议记载的方法，进行白细胞介素4(IL-4)蛋白质的定量试验。本试剂盒的检测下限值是0.22pg/mL。为了比较，也测定基本培养基的“RPMI”、已在RPMI添加10％FBS的“RPMI 10％FBS”、使用于制备间充质干细胞的培养上清液的无血清培养基亦即“ProculAD”。如同上述，Procul AD(乐敦制药)是无血清培养基且不含有动物来源成分。亦即，Procul AD中不含有白细胞介素4。
将其结果显示于图4。“RPMI 10％FBS”的IL-4浓度是0.38(±0.03)pg/mL，其他检体是试剂盒的检测极限以下。不含蛋白质的培养基的“RPMI”低于试剂盒的测定浓度范围，“AD-CM-1”、“AD-CM-2”、“UC-CM-1”以及“UC-CM-2”是与由检测杂讯所导致的“RPMI”相同程度的值。借此，在本发明的间充质干细胞的培养上清液中，确认到不含有IL-4，并确认到THP-1中的PPARγ活化配体产生促进的作用是由与IL-4不同的其他因子所导致。
产业上的可利用性
本发明能利用在医药产业。
序列表自由文本
序列编号1 引物
序列编号2 引物
序列编号3 引物
序列编号4 引物
序列编号5 引物
序列编号6 引物
序列编号7 引物
序列编号8 引物
Figure IPA0000290048340000011
Figure IPA0000290048340000021

Claims (9)

1.一种类二十烷酸产生促进剂，其特征在于，包含间充质干细胞的分泌物作为有效成分，且是用于促进来自巨噬细胞的PPARγ活化物质亦即类二十烷酸的产生。
2.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，所述间充质干细胞是来自皮下脂肪组织或脐带组织的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，所述间充质干细胞的分泌物是使用无血清培养基的培养上清液。
4.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，所述PPARγ活化物质亦即类二十烷酸是15-脱氧-δ-12，14-前列腺素J2以及15-羟基二十碳四烯酸的任一方或两方。
5.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，不含有IL-4。
6.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，是动脉硬化或糖尿病的治疗剂。
7.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，是类风湿性关节炎的治疗剂。
8.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，是前列腺癌、脑梗塞或脑功能障碍的预防剂或治疗剂。
9.根据权利要求1所述的剂，其特征在于，是疼痛的预防剂或治疗剂。
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