CN111718933A - 一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法与应用。本发明选择rrbp1基因敲除靶点，设计sgRNA，合成双链DNA片段，构建sgRNA表达载体，体外转录，得到sgRNA，将其与Cas9蛋白混合，显微注射到受精卵中，筛选，得到rrbp1基因敲除热带爪蛙模型。本发明不但为阐明rrbp1基因在热带爪蛙中的功能提供了可靠的遗传修饰动物模型，为以此模型为基础进一步研究rrbp1基因相关的肿瘤及心血管疾病提供了有力的研究工具；同时，本发明的方法为热带爪蛙模式动物种质资源创新提供了技术支撑。

Description

一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法与应用。
背景技术
核糖体结合蛋白1(ribosome-binding protein 1，RRBP1)是内质网(endoplasmicreticulum，ER)的重要结构蛋白之一，包含几个功能结构域，主要定位于ER膜上。RRBP1对于哺乳动物细胞中新生蛋白的转运和分泌以及核糖体结合至关重要，其主要通过增强进入分泌区域位点处胶原生物合成的特殊机制来促进核糖体在ER上的结合。研究表明，RRBP1参与各种疾病或功能障碍，包括癌症与心脏相关疾病的发生发展过程，对于阐明相关疾病的分子机制及研发有效的靶向干预疗法非常重要。
热带爪蛙(Xenopus tropicalis)是爪蛙属中唯一具有真正二倍体遗传背景的两栖类模式动物，具有个体小、发育快、体外受精、繁殖量大、培育费用低、早期胚胎透明等优点，已经发展成为发育生物学、遗传学及再生医学领域的理想模式动物。然而，rrbp1基因在热带爪蛙中的功能及相应的基因敲除品系目前仍未见相关报道。因此，研发rrbp1基因敲除热带爪蛙不但有助于阐明rrbp1基因的功能，建立rrbp1基因相关的疾病模型，而且可为rrbp1基因相关的肿瘤及心血管疾病的机制研究、靶点甄别、药物筛选及靶向干预疗法的建立提供良好的研究模型和工具。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)设计sgRNA：利用CRISPR/Cas9系统选择rrbp1基因敲除靶点，设计sgRNA序列及其互补序列；
(2)体外合成sgRNA：将步骤(1)设计的sgRNA序列及其互补序列退火，形成双链DNA片段，构建sgRNA表达载体，体外转录，得到sgRNA；
(3)显微注射：将步骤(2)得到的sgRNA与Cas9蛋白混合，显微注射到受精卵中；
(4)培育：将步骤(3)显微注射后的受精卵培养至成蛙，获得F0代嵌合体热带爪蛙，将其与野生型杂交，得到F1代杂合子，自交，得到F2代纯合子，即rrbp1基因敲除热带爪蛙模型。
步骤(1)中所述的rrbp1基因敲除靶点位于rrbp1基因第一外显子，该外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(1)中所述的sgRNA序列及其互补序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
步骤(2)中所述的sgRNA序列及其互补序列退火前加入BbsI酶切位点粘性末端，正义链5’端添加TAGG；反义链5’端添加AAAC。
步骤(2)中所述的将sgRNA序列及其互补序列退火的体系：浓度为100μM的sgRNA序列及其互补序列各1μL、T4 PNK 0.5μL、T4 ligation buffer(10×)1μL、RNase-free water补充补充至10μL；退火的程序：37℃、30min；95℃、5min；逐步降温至25℃(-5℃/min)。
步骤(2)中所述的构建sgRNA表达载体采用的载体为pUC57-Simple-gRNA。
所述的pUC57-Simple-gRNA采用BbsI酶切。
所述的酶切的反应体系：pUC57-Simple-gRNA 1μg、酶切buffer 2μL、BbsI酶(10U/μL)1μL、RNase-free water补充至20μL；反应条件：37℃、2h。
步骤(2)中所述的构建sgRNA表达载体的连接体系：双链DNA片段1μL、线性化的pUC57-Simple-gRNA 1μL、T4 DNA ligase 1μL、T4 ligation buffer(10×)1μL、RNase-free water补充至10μL；反应条件：22℃、3h。
步骤(3)中所述的sgRNA与Cas9蛋白的注射用量分别为100pg/卵和300pg/卵。
步骤(3)中所述的受精卵为1细胞期的受精卵。
步骤(3)中所述的受精卵注射前采用pH 7.8-8.0的一水合半胱氨酸盐酸盐作为脱膜液进行脱胶膜处理。
上述rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法在热带爪蛙模式动物种质资源创新中的应用。
上述rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法在rrbp1基因相关疾病研究中的应用。
所述的相关疾病为肿瘤或心血管疾病。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明针对rrbp1基因的第一外显子，设计了sgRNA，其能特异性地靶向rrbp1基因的第一外显子，利用该sgRNA与Cas9蛋白共同注射受精卵能产生较高的靶基因敲除效率。本发明不但为阐明rrbp1基因在热带爪蛙中的功能提供了可靠的遗传修饰动物模型，为生命科学及医学领域以此模型为基础进一步研究rrbp1基因相关的肿瘤及心血管疾病提供了有力的研究工具；同时，本发明的方法为热带爪蛙模式动物种质资源创新提供了技术支撑。
附图说明
图1是本发明所设计的靶向热带爪蛙rrbp1基因的sgRNA的设计位点；其中，A为NCBI中rrbp1基因的7个转录本的外显子对比图；B为靶向rrbp1基因第一外显子的sgRNA-T1的设计位点示意图。
图2是转录回收后sgRNA的凝胶电泳结果图。
图3是基因型鉴定引物设计及PCR产物凝胶电泳结果结果图；其中，A为基因型鉴定引物设计示意图；B为利用基因型鉴定引物扩增的PCR产物的凝胶电泳结果图。
图4是本发明所设计的rrbp1-sgRNA-T1所导致的插入/缺失突变效率检测结果图。
图5是四只性成熟的F0代热带爪蛙的基因型鉴定结果图。
图6是三种突变表型的F1代杂合子热带爪蛙的基因型鉴定结果图。
图7是两种引起移码突变的F2代纯合子热带爪蛙的基因型鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在NCBI上查询热带爪蛙rrbp1基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas9系统的基因编辑原理，针对rrbp1基因第一外显子(SEQ ID NO.1)设计10条sgRNA(表1)。sgRNA的设计位点见图1。
表1.靶向rrbp1第一外显子的10条sgRNA序列
Figure BDA0002556920410000041
上述sgRNA的DNA序列中，粗体序列为CRISPR/Cas9识别靶位点的PAM序列。
实施例2 sgRNA表达载体的构建及体外转录
(1)将实施例1设计的sgRNA克隆到pUC57-Simple-gRNA骨架载体上(Addgene，#51306)，用于构建sgRNA的表达载体。因pUC57-Simple-gRNA骨架载体需要用BbsI进行酶切，因此需要在sgRNA及其互补序列上人为添加BbsI酶切位点的粘性末端(正义链5’端添加TAGG；反义链5’端添加AAAC)，以利于将sgRNA克隆到pUC57-Simple-gRNA骨架载体。将设计好的加入BbsI酶切位点粘性末端的sgRNA序列及其互补序列作为合成引物退火形成带有粘性末端的双链DNA片段，并连接到经BbsI酶切的pUC57-Simple-gRNA骨架载体上，进而构建相应的sgRNA表达载体。
表2 sgRNA的退火反应体系
sgRNA-Fw(100μM) 1μL
sgRNA-Re(100μM) 1μL
T4 PNK 0.5μL
T4 ligation buffer(10×) 1μL
RNase-free water To10μL
反应条件：37℃、30min；95℃、5min；逐步降温至25℃(-5℃/min)。
表3 pUC57-Simple-gRNA载体的线性化酶切反应体系
pUC57-Simple-gRNA质粒 1μg
酶切buffer(NEB) 2μL
BbsI酶(10U/μL，NEB) 1μL
RNase-free water to 20μL
反应条件：37℃、2h。
表4双链DNA片段与线性化pUC57-Simple-gRNA酶连反应体系
Figure BDA0002556920410000051
反应条件：22℃、3h。
(2)将连接好的sgRNA表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单克隆进行测序。将测序正确的菌种保存于-80℃。其中转化的具体步骤如下：
1.将sgRNA表达载体10μL加入到50μL溶解的感受态细胞溶液中，轻轻混匀，冰上放置30min。
2. 42℃水浴30s，然后立即在冰上放置2min。
3.向离心管中加入200μL提前37℃预热的LB培养基。
4.将离心管固定在37℃摇床中200rpm培养振荡1h左右。
5.取适量菌液涂布于AMP抗性的LB平板上，于37℃培养箱正向放置30min后，倒置培养过夜。
菌液测序，利用质粒小量制备试剂盒(GENErayTM Biotechnology)分别提取适量的构建完成的10种pUC57-rrbp1-sgRNA表达质粒(T1-T10)。所提取的质粒用TranscriptAidT7 High Yield Transcription Kit(Thermo Scientific)体外转录试剂盒进行体外转录，合成相应的sgRNA(T1-T10)。
表5体外转录反应体系
5×TranscriptAid Reaction Buffer 2μL
ATP(100mM) 1μL
CTP(100mM) 1μL
GTP(100mM) 1μL
UTP(100mM) 1μL
DNA片段 1μL
TranscriptAid Enzyme Mix 1μL
RNase-free water to 10μL
反应条件：37℃反应3.5h。
转录反应结束后纯化回收，将回收前后的样品进行琼脂糖凝胶电泳验证条带是否单一，并用紫外分光光度计测量验证。结果显示，回收前后sgRNA的电泳结果均为单一条带，并无杂带(图2)。
实施例3热带爪蛙胚胎的显微注射
热带爪蛙产卵时打开氮气气阀，调整好压力和时间，将需要注射的各种试剂按需调配好，按照Cas9蛋白注射300pg/卵，实施例2获得的sgRNA(T1-T10)注射100pg/卵的量进行注射。根据需要，选择胚胎注射的时期为1细胞期的受精卵。脱去卵胶膜后将需要注射的胚胎转移到0.1×MBS胚胎培养液(由5×MBS(配置方法：称取NaCl 25.9g、Hepes 11.9g、NaHCO3 1.0g、KCl 0.4g、MgSO4 0.5g，Ca(NO3)2 0.8g、CaCl2 0.2g，加入800mL去离子水并混匀，pH调至7.4，容量瓶定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存备用)稀释而成)中，再用吸管转移到载玻片上，根据注射的需要调节胚胎的位置。然后使用(PV820型和PV830型，美国WorldPrecision Instruments公司)皮微升显微注射仪进行注射。将需要注射的样品转移到注射针后，在体视镜下用镊子小心的夹断尖端，通过调节气压和注射时间使来调节注射液滴的大小。具体包括以下步骤：
1.受精卵的处理：为了便于进行胚胎显微操作，将1细胞期受精卵使用pH7.8-8.0的一水合半胱氨酸盐酸盐作为脱膜液进行脱胶膜处理。30mL脱膜液消化200个受精卵。轻轻的不间断地摇晃盛有受精卵和脱膜液的烧杯。处理时间不宜过长，时间太长胶膜液对胚胎会造成损伤，当受精卵彼此分离且彼此很靠近时即停止处理。脱膜后，快速用0.1×MBS冲洗胚胎6-7次，彻底去除脱膜液。脱膜后的胚胎于21℃、0.1×MBS中培养。
2.制备胚胎显微注射用针：显微注射用针为内径为0.55mm，外径1mm的玻璃毛细管，经显微注射拉针仪(MODELP97 Flaming，SutterInstrument公司)拉制而成。使用前用镊子去除玻璃针最尖端。
3.显微注射：装好显微注射玻璃显微针后，取处理后的1细胞期受精卵，整齐排放在载玻片上，稍加水以保证胚胎湿润，把载玻片置于体视解剖显微镜下，调节显微注射仪注射压力，将适量溶液注射进受精卵中，每个受精卵注射2nL，其中包含300pg的Cas9蛋白及100pg的sgRNA。
4.胚胎注射后的培养：显微注射完成后将胚胎放入21℃恒温培养箱中继续培养过夜，次日将温度调制25℃，直至胚胎发育到相应的阶段。
实施例4 sgRNA的编辑效率检测
将实施例3显微注射后的热带爪蛙胚胎挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rrbp1基因是否发生突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。
待注射后的胚胎发育至20期(Stage 20，St20)，利用基因组DNA提取试剂盒(GENErayTM Biotechnology)提取胚胎的基因组DNA，以基因组为模板进行PCR扩增，反应体系和条件见表6和7。鉴定引物rrbp1test-Fw和rrbp1test-Re设计在靶位点两端约350bp左右的位置，PCR产物长度为718bp(图3A)。
rrbp1test-Fw：5’-ATGGAGCAAAATCATCTGCCG-3’；
rrbp1test-Re：5’-CAGGCACTGGTGTCTTCTCC-3’。
表6 PCR反应体系
RNase-free water 32μL
10×PCR Buffer 5μL
2mM dNTPs 5μL
25mM MgSO<sub>4</sub> 3μL
Primer1(10μM each) 1.5μL
Primer2(10μM each) 1.5μL
模板 1μL
KOD-Plus-Neo(1U/μL) 1μL
Total to 50μL
表7 PCR反应条件
Figure BDA0002556920410000081
将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳(图3B)，电泳后的目的特异性条带进行切胶回收，回收完成的样品连接到T克隆载体(pEASY-T1,TransGen Biotech)，然后转化到大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养。从每块LD培养基平板挑取10个白斑单克隆(X-gal筛选)进行测序验证，10条sgRNA分别与Cas9组合对热带爪蛙基因组的切割效率统计结果见表8。由表8的统计结果可知，sgRNA-T1的切割效率最高，达80％。所以后续选择sgRNA-T1组基因敲除爪蛙继续饲养，进行突变体筛选。提取sgRNA-T1组爪蛙基因组，sgRNA-T1所导致变基因组的碱基个数与原始序列对比结果如图4所示，测到了多种突变型，所突变的碱基数目各不相同。
表8所设计的sgRNA在热带爪蛙基因组中的切割效率
Figure BDA0002556920410000082
Figure BDA0002556920410000091
实施例5 rrbp1基因敲除纯合子热带爪蛙的筛选及鉴定
将实施例4含有突变的一组热带爪蛙(sgRNA-T1)饲养至成蛙，筛选F0代嵌合体。首先，随机地挑选10只成年爪蛙，分别剪取适量的后肢指甲提取基因组，以基因组为模板进行PCR扩增(引物为实施例4的rrbp1test-Fw和rrbp1test-Re)，将718bp的特异性条带进行胶回收后，克隆到T载体，转化后挑选阳性克隆进行DNA测序。测序结果表明，共筛选到4只携带基因突变的F0代嵌合体热带爪蛙。其中，F0-1#热带爪蛙有3种不同的突变型，F0-2#有2种不同的碱基突变型，F0-3#有4种不同的突变碱基，F0-4#有3种不同的突变型(图5)。
随后，选取F0-3#雄性嵌合体热带爪蛙与雌性的野生型热带爪蛙进行交配，用于筛选F1代杂合子。饲养该F1代蝌蚪至成蛙后，剪取热带爪蛙后肢指甲，提取基因组DNA模板，利用PCR及DNA测序技术鉴定每只热带爪蛙的突变基因型。最终，鉴定出3种杂合子表型：(1)插入4bp的突变型，雌蛙2只；(2)删除11bp的突变型，雌蛙1只，雄蛙6只；(3)删除14bp的突变型，雌蛙1只，雄蛙1只(图6)。
上述3种突变表型均能引起靶基因的移码突变进而敲除靶基因，但含有删除11bp及删除14bp的F1代杂合子均含有雌雄两种性别的热带爪蛙，便于纯合子的筛选。因此，将上述筛选的删除11bp及删除14bp的两种F1代杂合子突变型的雌、雄热带爪蛙分别自交，用于筛选F2代纯合子热带爪蛙。饲养该F2代蝌蚪至成蛙，剪取成年热带爪蛙后肢指甲，提取基因组DNA模板，利用PCR及DNA测序技术鉴定每只热带爪蛙的突变表型。最终，筛选到删除11bp及删除14bp的两种突变表型的纯合子热带爪蛙(图7)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法与应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1003
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> rrbp1基因第一外显子的核苷酸序列
<400> 1
atggatttgt acgatccaca aaccttgggc gtcatggtgt ttggtggctt tatgttggtt 60
tctgctcttg gaatctttct tgtgtcaacc ttttcaatga aagagacatc ctatgaagaa 120
gcattggcca agcagcgcaa agaaactgag aagaaccagc ccaaagttga taagaagaag 180
aaagaaaagc tcccagttca aaaaggaaaa gctaaaaaga aggatgaaaa gcccaatgga 240
aaaatacctg aacatgaatc taaccaggaa cctacagacc caaaaaaagc tgaatctgga 300
catgagctaa ttctggagaa gacaccagtg cctgttgtac cagttgtacc tgtggaagtt 360
ccaattgtgc ctgtggtagc accagttcct aagaaatctg ctccaggttc tgtaaaatct 420
gctccagttt ccgaaaaacc tgctcccgtt tctcaaaagc ctgctcccgt ttcccaaaag 480
cctgctccgg tttcccaaaa gcctgctccg gtttctcaaa agcctgctcc ggtttcccaa 540
aagcctgctc cggtttccca aaagcctgct ccggtttccc aaaagcctgc tccggtttcc 600
caaaagcctg ctccggtttc tcaaaagcct gctcccgttt ctcaaaagcc tgctcccgtt 660
cccgaaaagc ccgctcctgc ttccgaaaag cctgctccag ttcaagaaaa atctgctcca 720
tctcctaaag acaaaaagaa aaagccggaa aagaaggtcc ttaaggttga accatctcca 780
agtccagctg taactttcac ccaggctgtg tcctctaagc atgtgccagt gttagatgca 840
cctatcaaag aagtgcctgt cgttgcagta tctcctgttg gatctcagcc tgcatcctcc 900
actcaacccc ctaaaaaagc tgaagccata gttaatcaag aagactccaa acaggagaat 960
gtgccaaaga aaaagagtgc tcctaagaaa aaaactgaac caa 1003
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA序列
<400> 2
ggtgtttggt ggctttatgt tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA互补序列
<400> 3
ccaacataaa gccaccaaac acc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2序列
<400> 4
ggatgtctct ttcattgaaa agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2互补序列
<400> 5
ccttttcaat gaaagagaca tcc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T3序列
<400> 6
ttgtacgatc cacaaacctt ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T3互补序列
<400> 7
cccaaggttt gtggatcgta caa 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T4序列
<400> 8
accaaacacc atgacgccca agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T4互补序列
<400> 9
ccttgggcgt catggtgttt ggt 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T5序列
<400> 10
accttgggcg tcatggtgtt tgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T5互补序列
<400> 11
ccaaacacca tgacgcccaa ggt 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T6序列
<400> 12
tccacaaacc ttgggcgtca tgg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T6互补序列
<400> 13
ccatgacgcc caaggtttgt gga 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T7序列
<400> 14
accatgacgc ccaaggtttg tgg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T7互补序列
<400> 15
ccacaaacct tgggcgtcat ggt 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T8序列
<400> 16
tttatgttgg tttctgctct tgg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T8互补序列
<400> 17
ccaagagcag aaaccaacat aaa 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T9序列
<400> 18
ttgggcgtca tggtgtttgg tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T9互补序列
<400> 19
ccaccaaaca ccatgacgcc caa 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T10
<400> 20
tttgtacgat ccacaaacct tgg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T10互补序列
<400> 21
ccaaggtttg tggatcgtac aaa 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> rbp1test-Fw
<400> 22
atggagcaaa atcatctgcc g 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> rrbp1test-Re
<400> 23
caggcactgg tgtcttctcc 20

Claims (8)

1.一种rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)设计sgRNA：利用CRISPR/Cas9系统选择rrbp1基因敲除靶点，设计sgRNA序列及其互补序列；
(2)体外合成sgRNA：将步骤(1)设计的sgRNA序列及其互补序列退火，形成双链DNA片段，构建sgRNA表达载体，体外转录，得到sgRNA；
(3)显微注射：将步骤(2)得到的sgRNA与Cas9蛋白混合，显微注射到受精卵中；
(4)培育：将步骤(3)显微注射后的受精卵培养至成蛙，获得F0代嵌合体热带爪蛙，将其与野生型杂交，得到F1代杂合子，自交，得到F2代纯合子，即rrbp1基因敲除热带爪蛙模型；
步骤(1)中所述的rrbp1基因敲除靶点位于rrbp1基因第一外显子，该外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(1)中所述的sgRNA序列及其互补序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的sgRNA序列及其互补序列退火前加入BbsI酶切位点粘性末端，正义链5’端添加TAGG；反义链5’端添加AAAC；
步骤(2)中所述的构建sgRNA表达载体采用的载体为pUC57-Simple-gRNA；
所述的pUC57-Simple-gRNA采用BbsI酶切。
3.根据权利要求1所述的rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中所述的sgRNA与Cas9蛋白的注射用量分别为100pg/卵和300pg/卵；
步骤(3)中所述的受精卵为1细胞期的受精卵；
步骤(3)中所述的受精卵注射前采用pH 7.8-8.0的一水合半胱氨酸盐酸盐作为脱膜液进行脱胶膜处理。
4.根据权利要求1所述的rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的sgRNA序列及其互补序列退火的体系：浓度为100μM的sgRNA序列及其互补序列各1μL、T4 PNK 0.5μL、10×T4 ligation buffer 1μL、RNase-free water补充补充至10μL；退火的程序：37℃、30min；95℃、5min；-5℃/min逐步降温至25℃；
步骤(2)中所述的构建sgRNA表达载体的连接体系：双链DNA片段1μL、线性化的pUC57-Simple-gRNA1μL、T4 DNA ligase 1μL、10×T4 ligation buffer 1μL、RNase-free water补充至10μL；反应条件：22℃、3h。
5.根据权利要求2所述的rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法，其特征在于，
所述的酶切的反应体系：pUC57-Simple-gRNA1μg、酶切buffer 2μL、10U/μL BbsI酶1μL、RNase-free water补充至20μL；反应条件：37℃、2h。
6.权利要求1-5任一项所述的rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法在热带爪蛙模式动物种质资源创新中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的rrbp1基因敲除热带爪蛙模型的制备方法在rrbp1基因相关疾病研究中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的相关疾病为肿瘤或心血管疾病。
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