CN111705065A

CN111705065A - 一种抗kras突变体单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN111705065A
Application number: CN202010620814.0A
Authority: CN
Inventors: 刘晗青; 屠志刚
Original assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-07-01
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-07-01
Also published as: CN111705065B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗KRAS突变体单克隆抗体及其用途。本发明采用纯化后的KRAS突变体蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，提取免疫成功后的小鼠脾脏淋巴细胞，通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗KRAS突变的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得抗KRAS单克隆抗体，本发明的抗KRAS突变单克隆抗体可用于免疫学检测，所获抗体经验证具有良好的特异性结合能力。

Description

一种抗KRAS突变体单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗KRAS突变体单克隆抗体及其用途。

背景技术

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，也是我国恶性肿瘤的首位死亡原因。肺癌通常分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC肺癌占所有肺癌患者中的80%-85%，且大多数肺癌患者在确诊时已处于晚期阶段。目前，以手术、化疗和放疗为主的传统治疗方法已进入一个瓶颈期，而分子靶向治疗和免疫治疗正逐渐成为治疗NSCLC的重要手段。

Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）是NSCLC中最常见的突变致癌基因之一，约有30.9%的 NSCLC患者发生有KRAS基因突变。KRAS基因突变导致KRAS蛋白的异常表达，持续刺激细胞的生长，是导致肿瘤发生的原因之一。KRAS同时也是体内许多重要信号通路的关键激活因子，例如，磷脂酰肌醇激酶（PI3K）和 Ral蛋白都是 KRAS 的下游效应物，拮抗KRAS的表达能够抑制其下游信号通路的活化，或许能够抑制肿瘤的发生。因此，开发出一种高效的高特异性的抗KRAS抗体显得尤为必要，对进一步研究以KRAS突变体为靶点的诊断及治疗药物等方面具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种抗KRAS突变体单克隆抗体及其用途。

本发明利用原核表达的重组突变体KRAS蛋白（KRAS Mut）作为免疫原免疫6~8周龄的BALB/c雌性小鼠，采用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下进行体外相融合，通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验ELISA 法筛选阳性产抗KRAS突变体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，随后将杂交瘤细胞株接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗KRAS突变体单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗KRAS突变体单克隆抗体，并且对抗KRAS突变体单克隆抗体进行效价测定和特异性的鉴定。获得的抗KRAS突变体单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，对进一步以KRAS为靶点的生物诊断及治疗药物的研究与开发等方面具有重要的意义。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一种经突变的KRAS蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

一种经突变的KRAS蛋白，由上述经突变的KRAS蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

一种表达载体，该载体含有上述经突变的KRAS蛋白基因。

在某一具体实施方案中，本发明还提供有一种抗KRAS单克隆抗体，所述抗KRAS单克隆抗体采用上述经突变的表达载体为免疫原；所述的抗KRAS单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

本发明所述的抗KRAS突变体单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

在某一具体实施方式中，本发明还提供所述抗KRAS突变体单克隆抗体的制备方法，本发明首先用KRAS Mut蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗KRAS突变体单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗KRAS突变体单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗KRAS突变体单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：

（1）重组KRAS Mut蛋白的表达与纯化；

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；

（4）抗KRAS突变体单克隆抗体的生产及纯化。

在某一具体实施方式中，本发明还提供了一种能产生上述抗KRAS突变体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明还提供了所述的抗KRAS突变体单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。

进一步地，所述的抗KRAS突变体单克隆抗体在制备检测KRAS突变体蛋白的生物检测试剂中的用途。进一步的所述的用途为制备检测KRAS突变体抗原的试剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

KRAS属于原癌基因家族，能够调控细胞的生长、分化和凋亡过程。KRAS的突变可以使正常细胞完全转化为肿瘤细胞，且KRAS可作为分子开关蛋白调控游信号通路的活化，使用抗KRAS阻断其下游信号通路的激活可能成为肿瘤治疗的新策略。本发明对KRAS基因进行优化改造，得到优化后的KRAS突变体基因，进一步应用此基因制备出抗KRAS单克隆抗体，本发明的抗KRAS单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×10⁵以上。本发明所得到的抗KRAS突变体单克隆抗体能够特异性的结合KRAS蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，也可能对进一步开发以KRAS为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

附图说明

图1是重组KRAS突变体蛋白组分收集的SDS-PAGE电泳图；

图2是纯化后的KRAS突变体单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；

图3是不同稀释度的抗KRAS突变体单克隆抗体的免疫效价检测结果图；

图4是抗KRAS突变体单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；

图5是抗KRAS突变体单克隆抗体对HPAEpiC、A549、SW480细胞进行Western blot实验的结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种抗KRAS突变体单克隆抗体及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1：抗KRAS突变体单克隆抗体制备

（1）重组KRAS Mut蛋白的表达与纯化

a. 转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白

KRAS基因的核苷酸序列可以在公共数据库中获得，KRAS 的Genbank登陆号为3845，对KRAS 进行突变体优化改造，改造后的KRAS 突变体（KRAS Mut）基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1 所示，其序列经南京金斯瑞生物技术有限公司合成并插入至原核表达载体pET-30a中，构成重组表达质粒pET-30a-KRAS Mut；采用42℃热激90 s的方法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500 mL LB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。

b. 重组蛋白纯化

将菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Novagen），4℃结合过夜，弃去上清，用WashBuffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，图1是重组KRAS突变体蛋白洗脱组分收集的SDS-PAGE电泳图，如图1所示KRAS 突变体蛋白经1次洗脱后即能获得较高的纯度，收集合并洗脱后的蛋白，冻干后进行后续动物免疫。

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测

本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫（参考北京大学出版社出版的《现代抗体技术及其应用》和科学出版社的《抗体制备与使用实验指南》）。

用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价。取重组KRAS Mut蛋白，用pH 9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将KRAS Mut蛋白稀释为1 μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1 h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：10⁵以上小鼠，进行第三次免疫。

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选

制备饲养层细胞，准备SP2/0骨髓瘤细胞，免疫结束后3~4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。融合后的细胞铺板（4块96孔板），利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，经过两轮亚克隆筛选得到抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株编号命名为：KRAS MutmAb。

（4）抗KRAS突变体单克隆抗体的生产及纯化。

按常规方法制备小鼠单克隆抗体腹水，利用正辛酸-蛋白G法对腹水抗体进行纯化，抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，如图2所示，KRAS Mut mAb 抗体经洗脱后能获得较高的纯度，抗KRAS突变体单克隆抗体IgG(H+L)分子量约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD，IgG轻链约为25 KD。

实施例2：KRAS突变体单克隆抗体效价测定及特异性

（1）单克隆抗体的效价测定：

用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将KRAS Mut蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将以上单克隆抗体按1:10³、1:10⁴、1：10⁵、1：10⁶稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h；取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30 min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值，结果如图3所示，本发明中纯化后的KRAS Mut mAb单克隆抗体的效价达到1×10⁵。

（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：

用碳酸盐缓冲液将KRAS Mut、VEGFA、TIGIT、HB-EGF、HSP90蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，用KRAS突变体单克隆抗体进行间接法ELISA检测，实验结果如图4所示，KRAS突变体单克隆抗体与VEGFA、TIGIT、HB-EGF、HSP90蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体的特异性较好。

实施例3：KRAS突变体单克隆抗体的Western blot实验

分别收集人肺泡上皮细胞HPAEpiC（购自中科院昆明细胞库）、人肺癌细胞系A549（购自中科院昆明细胞库）、人结肠癌细胞系SW480（购自中科院昆明细胞库），用RIPA裂解液将细胞裂解，5000 g 4℃离心20 min，收集上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度；细胞裂解液经12％SDS-PAGE电泳分离，随后将PAGE胶置于PVDF膜上，120 mA转膜240 min；将PVDF膜放入5％的脱脂牛奶中室温封闭1 h，然后分别用1:5000本发明中KRAS突变体单克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜；取出PVDF膜，PBS-T漂洗3次，每次5 min，置于1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗中室温孵育1 h后，弃二抗，PBS-T洗涤5次，每次5 min后将膜加入显色液中避光显影，拍照记录实验结果，图5是Western blot实验结果图；如图5所示，本发明实施例1中所制备的KRAS突变体单克隆抗体能够特异性识别人肺癌细胞系A549、人结肠癌细胞系SW480中的KRAS蛋白，KRAS突变体单克隆抗体能够检测出KRAS突变的A549和SW480细胞中的KRAS蛋白，说明本发明所生产的KRAS突变体抗体具有较高的选择性以及特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司

<120> 一种抗KRAS突变体单克隆抗体及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaagt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480

agagagatcc gacaatacag attgaaaaaa atcagcaaag aagaaaagac tcctggctgt 540

gtgaaaatta aaaaatgcat tataatgggt gttgatgatg ccttctatac attagttcga 600

gaaattcgaa aacataaaga aaagatgagc aaagatggta aaaagaagaa aaagaagtca 660

aagacaaagt gtgtaattat gtaa 684

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 2

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Ser Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

65 70 75 80

Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys

115 120 125

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys

165 170 175

Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met Gly Val Asp

180 185 190

Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys

195 200 205

Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys

210 215 220

Val Ile Met

225

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 3

Asp Ile Cys Lys Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 4

Gln Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ile Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ser Gly Tyr Val Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

Claims

1.一种KRAS 突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

2.一种KRAS突变体蛋白，其特征在于，由权利要求1所述KRAS突变体基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3.一种表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的KRAS突变体蛋白基因。

4.一种抗KRAS突变体单克隆抗体，其特征在于，以权利要求2所述KRAS 突变体蛋白为免疫原；所述抗体包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述的抗KRAS突变体单克隆抗体，其特征在于，所述抗体还包括轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种能产生权利要求4所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

7.根据权利要求4所述的抗KRAS突变体单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。

8.根据权利要求 7所述的抗KRAS突变体单克隆抗体的应用，其特征在于，在制备检测KRAS突变体蛋白的生物检测试剂中的用途。

9.根据权利要求7所述的抗KRAS突变体单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测KRAS突变体抗原的试剂。