CN111690754B - 一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法 - Google Patents

一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法，属于家禽养殖技术领域，在1600只绍兴鸭中随机选择300只作为全基因组关联分析的实验对象，开产日龄和产蛋量数据记录同上，蛋品质测定为在299日龄、300日龄和301日龄，对300只蛋鸭的鸭蛋全部进行测定，在实验过程中除去蛋品质测定只有一天的及死淘的蛋鸭，在实验末期进行血样采集，提取基因组DNA，经过检测所提取到的基因组DNA的完整性、纯度及浓度，最终合格样品有166个进行重测序，然后对绍兴鸭产蛋性状的11项指标进行全基因组关联分析，筛选候选基因，为今后优质蛋鸭新品种选育提供理论支撑。

Description

一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法
技术领域
本发明属于家禽养殖技术领域，具体地说，涉及一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法。
背景技术
我国是养殖大国，鸭根据其主要经济性状的不同，分为肉鸭、蛋鸭及肉蛋兼用型三大类。其中绍兴鸭是我国蛋鸭的当家品种，其产蛋性能具有蛋品质优良、产蛋率高等特点。蛋鸭的产蛋性能是衡量其经济价值的重要指标，主要包括开产日龄、产蛋量、蛋品质等性状。通过科学技术手段，找到影响蛋鸭产蛋性能的候选基因，通过分子标记辅助育种技术，能够显著提高其产蛋性能。全基因组关联分析(GWAS)即通过重测序在全基因组范围内找出与目标性状相关联的候选区域及基因。目前已经挖掘到较多的与蛋鸭产蛋形状相关的候选基因，如OIH基因、GnIH基因等。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法，在1600只绍兴鸭中随机选择300只作为全基因组关联分析的实验对象，开产日龄和产蛋量数据记录同上，蛋品质测定为在299日龄、300日龄和301日龄，对300只蛋鸭的鸭蛋全部进行测定，在实验过程中除去蛋品质测定只有一天的及死淘的蛋鸭，在实验末期进行血样采集，提取基因组DNA，经过检测所提取到的基因组DNA的完整性、纯度及浓度，最终合格样品有166个进行重测序，然后对绍兴鸭产蛋性状的11项指标进行全基因组关联分析，筛选候选基因，为今后优质蛋鸭新品种选育提供理论支撑。
其技术方案如下：
一种鸭产蛋性能的全基因组关联分析方法，包括以下步骤：
步骤1、实验动物的养殖
实验选用的动物是绍兴鸭青壳系，均来自湖北省神丹健康食品有限公司种鸭场，共饲养1600余只，为三层阶梯笼养，湿帘通风，乳头式饮水，饲料机按时喂料，饲养周期为18个月，从该群体中随机挑选300只作为全基因组重测序的实验对象。
步骤2、样品采集及处理
样品采集主要是采血，为避免由于采血使绍兴鸭产生应激反应，从而对其产蛋情况带来的影响，所以选择在饲养末期(72周龄之后)用含有EDTA抗凝剂的抗凝管进行采血，采完血之后需将抗凝管上下摇匀，使血液与抗凝剂充分混合，并将采完血的抗凝管置于含有冰袋的保温箱内，运至实验室后，放于-20℃冰箱储存，备用。
步骤3、生长性能数据记录及蛋品质测定
前期数据的收集主要有开产日龄、300日龄蛋品质、每日的产蛋量。其中蛋品质测定：将实验的300只绍兴鸭在299日龄、300日龄、301日龄时进行蛋品质测定。经过三日蛋品质的测定(筛选掉只有一次蛋品质的绍兴鸭)及死淘，最终的实验对象为216只绍兴鸭。产蛋量记录：从绍兴鸭开产之日起每天准确记录其产蛋情况。
步骤4、基因组DNA的提取及检测
基因组DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化铵法，按照常规提取步骤提取基因组DNA，提取到的基因组DNA需进行完整性、纯度及浓度的检测，符合要求的保留，不符合要求的淘汰或进行重新提取再检测。
步骤5、测序数据质控及与参考基因组比对统计
实验按照Illumina公司提供的标准protocol执行，对检测合格的基因组DNA样品，通过凝胶电泳的方法选择合适的大小片段，然后通过PCR扩增建库，再对建好的文库进行质量检测，合格的文库再用Illumina测序，该测序由百迈客生物科技有限公司进行。为保证信息分析质量，在Illumina测序系统测序时，要进行碱基测序质量分布分析、碱基类型分布检查及将高通量测序得到的原始图像数据(Raw Reads)文件进行过滤。
步骤6、数据处理和统计分析
61)产蛋性状描述性统计分析
产蛋性状的描述性统计分析是通过IBM SPSS Statistics 21.0软件中分析-描述统计分析获得，分析的产蛋性状指标有：开产日龄、43周产蛋量、66周产蛋、鸭蛋长径、鸭蛋短径、蛋形指数、平均蛋重、蛋白高度、蛋黄色度、哈氏单位、蛋壳强度；分析的结果为有效记录数、极大值、极小值、均值及标准差；
62)全基因组关联分析
测序数据经过质控之后，使用TASSEL 3.0软件的一般线性模型(GLM)、EMMAX及Fastlmm软件分别进行关联分析，挖掘出与绍兴鸭产蛋性能相关的SNPs。其中GLM模型的公式计算如下：
y＝Xα+e (1)
公式中，y为性状表型值向量；α为SNP、群体结构等的固定效应定量；e为残差效应向量，X为关联矩阵。
在进行数据分析时，运用Bonferroni方法进行多重检验对全基因组关联分析结果P值进行校正，以P<1.339*10-8，P＝0.1/N，N＝7467544，为检测到的有效SNP数目，为达到显著水平，以P<1.339*10-9，P＝0.01/N，N＝7467544，为检测到的有效SNP数目，为达到极显著水平。
63)群体分层
群体分层是指由于祖先不同导致的等位基因频率差异，已被证实是一个混杂因素，可能会导致许多假阳性的结果，因此在对绍兴鸭产蛋性能进行关联分析时，对绍兴鸭产蛋性能的11项指标绘制Q-Q图，来判断关联分析中是否出现偏差和样本群体的分层现象。
64)显著SNPs基因注释
在获得全基因组关联分析的显著SNPs位点后，下载该位点上下游100kb的碱基序列，通过NCBI和Ensembl等数据库进行序列比对，确定显著SNPs位点附近的基因，并筛选出与该位点距离最近的基因。
进一步，步骤3中，关联分析了43周龄产蛋量和66周龄产蛋量。
进一步，步骤5中，将测序获得的最终的序列重新定位到参考基因组上，再进行后续分析。把可以定位到参考基因组上的Clean-Reads占总Clean-Reads的比率称为比对效率，即Mapped(％)。参考基因物种为绿头野鸭，参考基因组为：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/fasta/anas_platyrhynchos/dna/。
进一步，在全基因组范围内共检测到10个与产蛋性状显著关联的SNPs，其中有4个SNPs与开产日龄显著关联、6个SNPs与66周龄产蛋量显著关联，在这些位点附近找到的候选基因有：MARCHF6、CA2、WDR18、GRIN3B。
本发明的有益效果为：
本发明的全基因组关联分析结果显示，在全基因组范围内共检测到10个与产蛋性状显著关联的SNPs，其中有4个SNPs与开产日龄显著关联、6个SNPs与66周龄产蛋量显著关联。在这些位点附近共找到MARCHF6、CA2、WDR18、GRIN3B等候选基因。本发明通过全基因组关联分析在全基因组范围内筛选出与绍兴鸭产蛋性能相关的候选基因区域，为今后优质蛋鸭新品种选育提供理论支撑。
附图说明
图1为基因组DNA原液1％琼脂糖凝胶电泳图(部分展示)；
图2为开产日龄全基因关联分析结果的曼哈顿图；横坐标代表染色体位置，纵坐标代表关联值的-lg，一个点代表一个SNP位点，上排水平线代表P<1.339*10-9，下排水平线代表P<1.339*10-8(以下图3-图5中代表的含义相同)；
图3为66周龄产蛋量全基因关联分析结果的曼哈顿图(GLM)；
图4为66周龄产蛋量全基因关联分析结果的曼哈顿图(FAST-LMM)；
图5为66周龄产蛋量全基因关联分析结果的曼哈顿图(EMMAX)；
图6为本发明的技术路线图；
图7为绍兴鸭开产日龄的Q-Q图结果；
图8为绍兴鸭66周产蛋量的Q-Q图结果(GLM)；
图9为66周产蛋量的Q-Q图结果(FAST-LMM)；
图10为66周产蛋量的Q-Q图结果(EMMAX)；
图11为43周产蛋量的Q-Q图结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
实验选用的动物是绍兴鸭青壳系，均来自湖北省神丹健康食品有限公司种鸭场，共饲养1600余只，为三层阶梯笼养，湿帘通风，乳头式饮水，饲料机按时喂料，饲养周期为2017年7月至2018年12月，从该群体中随机挑选300只作为全基因组重测序的实验对象。
1.1.2样品采集及处理
样品采集主要是采血，为避免由于采血使绍兴鸭产生应激反应，从而对其产蛋情况带来的影响，所以选择在饲养末期(72周龄之后)用含有EDTA抗凝剂的抗凝管进行采血，采完血之后需将抗凝管上下摇匀，使血液与抗凝剂充分混合，并将采完血的抗凝管置于含有冰袋的保温箱内，运至实验室后，放于-20℃冰箱储存，备用。
1.2实验方法
1.2.1生长性能数据记录及蛋品质测定
前期数据的收集主要有开产日龄、300日龄蛋品质、每日的产蛋量。其中蛋品质测定：将实验的300只绍兴鸭在299日龄、300日龄、301日龄时进行蛋品质测定。蛋品质的测定方法同第二章。经过三日蛋品质的测定(筛选掉只有一次蛋品质的绍兴鸭)及死淘，最终的实验对象为216只绍兴鸭。产蛋量记录：从绍兴鸭开产之日起每天准确记录其产蛋情况，本实验主要关联分析了43周龄产蛋量和66周龄产蛋量。
1.2.2实验技术路线如图6所示。
1.2.3基因组DNA的提取及检测
基因组DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammoniumAmmonium Bromide，CTAB)，按照常规提取步骤提取基因组DNA，提取到的基因组DNA需进行完整性、纯度及浓度的检测，符合要求的保留，不符合要求的淘汰或进行重新提取再检测。
1.2.4测序数据质控及与参考基因组比对统计
实验按照Illumina公司提供的标准protocol执行，对检测合格的基因组DNA样品，通过凝胶电泳的方法选择合适的大小片段，然后通过PCR扩增建库，再对建好的文库进行质量检测，合格的文库再用Illumina测序，该测序由百迈客生物科技有限公司进行。为保证信息分析质量，在Illumina测序系统测序时，要进行碱基测序质量分布分析、碱基类型分布检查及将高通量测序得到的原始图像数据(Raw Reads)文件进行过滤。
将测序获得的最终的序列重新定位到参考基因组上，再进行后续分析。把可以定位到参考基因组上的Clean-Reads占总Clean-Reads的比率称为比对效率，即Mapped(％)。参考基因物种为绿头野鸭，参考基因组为：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/ fasta/anas_platyrhynchos/dna/。
1.3数据处理和统计分析
1.3.1产蛋性状描述性统计分析
产蛋性状的描述性统计分析是通过IBM SPSS Statistics 21.0软件中分析-描述统计分析获得，分析的产蛋性状指标有：开产日龄(AFE)、43周产蛋量(EP43)、66周产蛋量(EP66)、鸭蛋长径(LD)、鸭蛋短径(SD)、蛋形指数(ESX)、平均蛋重(AEW)、蛋白高度(AH)、蛋黄色度(YC)、哈氏单位(Hu)、蛋壳强度(SS)；分析的结果为有效记录数(N)、极大值(Max)、极小值(Min)、均值(Mean)及标准差(SD)。
1.3.2全基因组关联分析
测序数据经过质控之后，使用TASSEL 3.0软件的一般线性模型(GLM)、EMMAX及Fastlmm软件分别进行关联分析，挖掘出与绍兴鸭产蛋性能相关的SNPs。其中GLM模型的公式计算如下：
y＝Xα+e (1)
公式中，y为性状表型值向量；α为SNP、群体结构等的固定效应定量；e为残差效应向量，X为关联矩阵。
在进行数据分析时，运用Bonferroni方法进行多重检验对全基因组关联分析结果P值进行校正，以P<1.339*10-8(P＝0.1/N，N＝7467544，为检测到的有效SNP数目)为达到显著水平，以P<1.339*10-9(P＝0.01/N，N＝7467544，为检测到的有效SNP数目)为达到极显著水平。
1.3.3群体分层
群体分层是指由于祖先不同导致的等位基因频率差异，已被证实是一个混杂因素，可能会导致许多假阳性的结果，因此在对绍兴鸭产蛋性能进行关联分析时，对绍兴鸭产蛋性能的11项指标绘制Q-Q图(Quantile-Quantile Plot)，来判断关联分析中是否出现偏差和样本群体的分层现象。
1.3.4显著SNPs基因注释
在获得全基因组关联分析的显著SNPs位点后，下载该位点上下游100kb的碱基序列，通过NCBI和Ensembl等数据库进行序列比对，确定显著SNPs位点附近的基因，并筛选出与该位点距离最近的基因。
2结果与分析
2.1基因组DNA检测结果
所有样品提取到的基因组DNA均需要通过琼脂糖凝胶电泳图进行质量检测，部分基因组DNA检测结果如图1所示，要求电泳点样孔干净无污染、主带清晰、无拖尾，另外要求DNA的纯度检测1.6<OD260/OD280<2.0，1.8<OD260/OD230<2.1。基因组DNA的检测结果要同时满足上述要求，才可以进行构建文库等，不合格样品需淘汰或者进行再次提取DNA。本实验的所有样品经过检测，达到合格要求的共有166个。
2.2测序数据质控及与参考基因组比对结果
测序数据质控结果见表1。碱基类型分布检测主要用于检查有无AT、CG分离现象，这种现象可能来自于测序也有可能是建库，若有明显分离现象则会对后续分析产生影响，由表1可知，样品G和C碱基占总碱基的百分比(GC(％))平均为43.11％，质量值大于等于20的碱基占总碱基数的百分比(Q20(％))平均为96.40％，质量值大于等于30的碱基占总碱基数的百分比(Q30(％))平均为91.35％。样品基因组DNA与参考基因组DNA的比对效率均在95％以上，平均为96.44％，说明该样品的文库构建和测序正常。
表1样品测序数据评估统计
Figure BDA0002550840940000091
Figure BDA0002550840940000101
注：Clean-Reads：过滤后的reads数；Clean-Base：过滤后的碱基数，Clean Reads数乘以序列长度。
2.3样品与参考基因组间SNP的检测结果统计
SNP类型的突变主要有两种，分别是转换(Transition/Ti，同类碱基的变异)和颠换(Transversion/Tv，不同类型碱基之间的变异)，一般情况下，转换的概率要高于颠换，即Ti/Tv大于1，由表2可知，该实验共检测到的SNP数为689127233，Ti/Tv值约为2.38，且杂合子占比(Het-ratio)是58.98％。
表2与参考基因组间SNP的检测结果统计
Figure BDA0002550840940000102
注：Heterozygosity Number杂合子数，Homozygosity Number纯合子数，Het-ratio杂合子占比。
2.4产蛋性状描述性统计分析结果
产蛋性状描述统计分析结果见表3，有描述性统计分析的结果可知，在分析的166个个体中，绍兴鸭开产日龄最早为105日龄，最晚为172日龄，平均为136.95日龄；43周产蛋量最少是113个，最多是189个，平均为151.27个；66周产蛋量最少是194个、最多是325个，平均为268.96个；蛋品质的各项指标中平均蛋重为70.04g，蛋形指数平均为1.32，哈氏单位平均为76.45。
表3产蛋性状描述性统计分析
Figure BDA0002550840940000103
Figure BDA0002550840940000111
2.5全基因组关联分析结果
本实验利用TASSEL软件的一般线性模型(GLM)、EMMAX及Fastlmm软件分别进行关联分析，对166只(经过提取基因组DNA，符合质量要求的绍兴鸭为166只)绍兴鸭的产蛋性能进行了全基因组关联分析。在全基因组范围内关联到了与开产日龄和产蛋量的显著相关的SNPs，但并未关联到与蛋品质显著相关的SNPs。
2.5.1开产日龄全基因组关联分析结果
开产日龄全基因组关联分析结果见表4，对应的曼哈顿图见图2。与开产日龄达到显著相关水平的SNPs有4个，均定位在Chr2上，密集分布在7.4kb(82.88Mb～82.89Mb)的区域内。
2.5.2产蛋量全基因组关联分析结果
绍兴鸭66周龄产蛋量全基因组关联分析结果见表5，对应的曼哈顿图见图3至图5。产蛋量的分析有两个指标即43周龄产蛋量和66周龄产蛋量，对于43周龄产蛋量在全基因组范围内未关联到显著的SNPs，而66周龄产蛋量的关联结果中，选择的模型不同得到的结果也是有所差异，GLM模型下的分析结果是有3个SNPs与66周龄产蛋量显著相关，均定位于Chr2上，密集分布在51kb(129.85Mb～129.90Mb)区域内。FAST-LMM模型下分析的结果是有3个SNPs与66周龄产蛋量显著相关，分别定位于Chr29和Chr2，且在Chr29上密集分布在19kb(4.48Mb～4.50Mb)区域内。EMMAX模型下的结果有2个与66周龄产蛋量显著相关的SNPs，均定位于Chr29上，与FAST-LMM模型下显著位点的位置一致，P值有所差异。
表4与开产日龄显著相关的SNP位点信息
Figure BDA0002550840940000121
注：Chr：染色体；Position：位置(bp)；P-value：P值；Allele：等位基因；MAF：次要等位基因频率；Model：模型，下同。
表5与66周产蛋量显著相关的SNP位点信息
Figure BDA0002550840940000122
Figure BDA0002550840940000131
注：加黑字体的为EMMAX模型下分析的结果。
2.6群体分层评估结果
产蛋性能指标中开产日龄与66周龄产蛋量均有显著SNPs位点，其Q-Q图如图7-图11所示，横坐标代表期望值，纵坐标代表观测值。图中细线代表45°线是预测的阈值，灰色区域即图上散点95％的置信区间，SNP与实线的距离越远，代表关联强度越好。由图7-图11可知，图的左下角大部分位点均在对角线上，说明模型选择合理，右上角超过对角线及置信区间的代表与目的性状存在较高的显著性。另外66周龄产蛋量的三种不同的模型Q-Q图基本一致，说明分析结果可靠，实验群体不存在群体分层现象。
2.7全基因组水平显著关联SNPs的基因注释
通过GWAS，在全基因组范围内共检测到10个与产蛋性能显著相关的SNPs，主要是与开产日龄和66周龄产蛋量显著相关，这些显著的SNPs主要分布在2号染色体和29号染色体上，通过NCBI和Ensembl对这些位点进行了初步的基因注释，注释结果详见表6。
与开产日龄显著相关的SNPs共有4个，均分布在2号染色体上，其中SNP4位于MARCHF6基因内第15个外显子上；SNP1、SNP2和SNP3均位于ROPN1L和MARCHF6基因之间。GLM模型分析的结果显示与66周龄产蛋量显著相关的SNPs有3个，均在2号染色体上，其中SNP5位于CA2基因的下游42kb处，SNP6和SNP7均位于CA2和ATP6V0D2基因之间；FAST-LMM模型分析的结果显示与66周龄产蛋量显著相关的SNPs同样也是3个，但是在2号染色体只有1个，另外两个分布在29号染色体上，其中位于2号染色体上的SNP10位置与SNP7相近，均是位于ATP6V0D2上游62kb处；SNP8位于WDR18上游1kb处；SNP9位于GRIN3B和TMEM259基因之间，具体位于GRIN3B基因下游75bp处。
从染色体分布来看，与产蛋性能相关的显著SNPs主要集中分布在2号染色体和29号染色体上，其中2号染色体有8个位点，29号染色体有2个位点。
表6与绍兴鸭AFE和EP66显著相关的SNPs位点功能注释
Figure BDA0002550840940000141
Figure BDA0002550840940000151
3结论
3.1绍兴鸭产蛋性状表型值
本实验最初的实验样本数是300只绍兴鸭，该300只绍兴鸭是在笼养的1600只中随机挑选，并在其299日龄、300日龄和301日龄时进行蛋品质测定，为保证数据的真实及准确性，我们淘汰掉了蛋品质测定数据不足两日的绍兴鸭，而且为了减少人为误差，三天的蛋品质测定均有同一人进行。产蛋量是从开产之日起每天上午7：30开始按照顺序进行记录每只鸭子的产蛋量，一共记录到66周龄，数据均有电子版本和纸质版本的一一对应，且产蛋率也符合基本的生产规律，因此数据来源真实可靠。在实验末期进行血样采集时，除去死淘的绍兴鸭，实验样本共剩余216只。经过提取基因组DNA，进行完整性、纯度及浓度的检测最终获得实验样本数为166只。
经过查阅文献发现，GWAS在鸭上的应用主要集中在肉鸭的羽色喙色、肉用性状、血液性状等方面，而关于蛋鸭方面的研究很少，所以我们选择绍兴鸭的开产日龄、产蛋量和蛋品质的性状进行全基因组关联分析，这些性状不仅与绍兴鸭本身的品种特征密切相关，而且有助于在全基因组范围内获得与绍兴鸭产蛋性能相关的候选基因。
3.2显著关联SNPs的基因注释
在本实验中，我们共检测到10个SNPs位点与开产日龄和66周龄产蛋量显著相关。在2号染色体上有4个SNPs与开产日龄显著相关，其中有一个SNP位点位于MARCHF6基因内，另外三个SNPs位点均位于MARCHF6基因上游2～4kb处；另外在2号染色体上还有4个SNPs与66周龄产蛋量显著相关，且均位于CA2和ATP6V0D2基因之间，其中有一个SNP位于CA2基因下游42kb处，另外3个SNPs位点均位于ATP6V0D2基因上游62kb～73kb处；在29号染色体上，有2个SNPs与66周龄产蛋量显著相关，分别位于WDR18基因上游1kb处和GRIN3B基因下游75bp处。
3.2.1MARCHF6基因
MARCHF6全称是Membrane Associated Ring-CH-Type Finger 6，也可以写成MARCH6。MARCHF6基因是一种膜相关的含有Ring-CH型锌指结构域的E3泛素连接酶家族成员，编码的蛋白质使II型脱碘酶泛素化，是甲状腺激素信号传导中的重要调控步骤。MARCHF6基因也是哺乳动物细胞中胆固醇生物合成途径中的一个控制点，主要通过参与角鲨烯单氧酶(SM)和HMGCR的降解，SM和HMGCR二者均是胆固醇合成途径中的一种限速酶。鸭蛋黄的胆固醇含量丰富，蛋鸭在开产前期身体各项机能应为开产做好准备，因此MARCHF6基因有可能会对其开产产生一定影响。
3.2.2CA2基因
CA2全称是Carbonic Anhydrase 2，碳酸酐酶2(CA-II)，该基因编码的蛋白是碳酸酐酶的几种同工酶之一，催化二氧化碳的可逆水合反应，在人体中这种酶的缺陷与骨质疏松和肾小管酸中毒有关，目前已发现该基因有两种不同亚型的转录本。有研究表明用重组人硬化蛋白(rhSCL)处理人类hOCy细胞和小鼠MLO-Y4细胞时，编码碳酸酐酶2(CA2/Car2)、酒石酸抗性酸性磷酸酶(ACP5/ACP5)和组织蛋白酶K(CTSK/CTSK)的基因上调，与pH敏感性染料共培养表明，rhSCL处理显著降低了细胞内和细胞外的pH值，并导致矿化细胞层的钙离子的释放和丢失。这些作用被乙酰唑胺，一种碳酸酐酶抑制剂所阻断。Kogawa等人的结论是，骨细胞能够通过改变碳酸酐酶的表达来调节钙沉积。碳酸酐酶(CA)在蛋壳形成过程中起着重要作用，Nishita等人通过研究白色来亨鸡血液中CA-II、CA-III含量和年龄变化的关系，发现CA-III含量在母鸡体内的变化规律是1周龄至16周龄并没有发生变化，16周龄至63周龄CA-III含量持续增加，至73周龄时呈下降状态，而到93周龄时又呈现出持续增加的状态，对于公鸡而言CA-III含量一直处于稳定状态，CA-II含量的变化规律与之相似，且作者发现16周龄至63周龄的CA-II、CA-III含量与产蛋率有显著相关。对于鸡的生产周期中，16周处于开产前期，一直至63周龄是鸡产蛋的青年期，同样，蛋鸭的产蛋周期与鸡相似，这说明CA-II、CA-III含量与产蛋性能方面有着密切关系。Everaert等发现如果将孵育后期的鸡胚胎放在一个高浓度CO2的环境下，与正常条件下相比胚胎红细胞中的CA-II蛋白丰度和活性明显升高，这说明鸡胚在孵育后期会通过增加CA-II蛋白在红细胞中的表达和功能来适应CO2。Chang等人通过cDNA微阵列研究发现碳酸酐酶II(CA2)基因是鸭蛋形成期峡部上皮中差异表达的转录产物之一，且该作者研究了柴鸭CA2基因的单核苷酸多态性，探讨了SNP基因型与鸭蛋产蛋性状的关系，发现CA2基因的不同基因型与蛋重、产蛋量等方面存在显著相关。
3.2.3WDR18基因
WDR18基因全称是WD repeat domain 18，WD-repeat蛋白在多种生物过程中发挥作用，如细胞骨架组装、细胞内转运、mRNA剪接、转录调控和细胞迁移等。Gao等研究发现，虽然斑马鱼胚胎在早期发育过程中表现为左右对称，但分子和细胞事件的发生是不对称的，最终形成左右轴(L-R)，其中WDR18是内胚层器官不对称发育所必需的，其调控决定L-R不对称的基因表达。所有生物体的基因组都暴露在各种各样的损伤之下，为了维持基因组的完整性，真核生物已经进化出一种复杂的监视机制，即DNA损伤检查点信号来检测受损的DNA并阻止细胞周期的进展，以便有时间来处理和修复DNA损伤，Yan等人则通过实验证明WDR18是一种真正的检查点蛋白，WDR18与TopBP1(拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1)共同作用，促进DNA损伤的检查点信号传导。
3.2.4GRIN3B基因
GRIN3B基因全称glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 3B，其中NMDA指N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid)。谷氨酸是大脑中最重要的兴奋性神经递质，NMDA受体是一个由多个亚基组成并受甘氨酸结合位点调控的谷氨酸门控的离子化通道。人类GRIN3B基因编码蛋白主要在运动神经元中表达，GRIN3B作为NMDA受体中的一员，GRIN3B基因是许多精神相关疾病的研究热点。
这些基因均是与显著SNPs位点接近的基因或在其内，其中CA2基因已经有众多研究结果证明，该基因与产蛋性能有显著关系，另外几个基因虽然没有直接的实验证据证明其与产蛋性能相关，但是从其位置、功能及结构等方面分析，可能与产蛋性能存在某种关系，不过还需要后续实验的进一步验证。
全基因组关联分析结果显示，在全基因组范围内共检测到10个与产蛋性状显著关联的SNPs，其中有4个SNPs与开产日龄显著关联、6个SNPs与66周龄产蛋量显著关联。在这些位点附近共找到MARCHF6、CA2、WDR18、GRIN3B等候选基因。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种鸭产蛋性能的全基因组水平SNP分子标记分析方法，其特征在于，
步骤1、实验动物的养殖
实验选用的动物是绍兴鸭青壳系，共饲养1600余只，为三层阶梯笼养，湿帘通风，乳头式饮水，饲料机按时喂料，饲养周期为18个月，从该群体中随机挑选300只作为全基因组重测序的实验对象；
步骤2、样品采集及处理
在饲养末期72周龄之后用含有EDTA抗凝剂的抗凝管进行采血，放于-20℃冰箱储存，备用；
步骤3、生长性能数据记录及蛋品质测定
收集开产日龄、蛋品质、每日产蛋量数据；其中蛋品质测定：将实验的300只绍兴鸭在299日龄、300日龄、301日龄时进行蛋品质测定；经过三日蛋品质的测定筛选掉只有一次蛋品质的绍兴鸭及死淘，最终的实验对象为216只绍兴鸭；产蛋量记录：从绍兴鸭开产之日起每天准确记录其产蛋情况；
步骤4、基因组DNA的提取及检测
提取基因组DNA，进行完整性、纯度及浓度的检测，符合要求的保留，不符合要求的淘汰或进行重新提取再检测；
步骤5、测序数据质控及与参考基因组比对统计
实验按照Illumina公司提供的标准protocol执行，对检测合格的基因组DNA样品，通过凝胶电泳的方法选择合适的大小片段，然后通过PCR扩增建库，再对建好的文库进行质量检测，合格的文库再用Illumina测序系统进行测序；为保证信息分析质量，在Illumina测序系统测序时，要进行碱基测序质量分布分析、碱基类型分布检查及将高通量测序得到的原始数据文件进行过滤；将测序获得的最终的序列重新定位到参考基因组上，再进行后续分析；把能定位到参考基因组上的Clean-Reads占总Clean-Reads的比率称为比对效率；参考基因物种为绿头野鸭，参考基因组为：
ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/fasta/anas_platyrhynchos/dna/；
步骤6、数据处理和统计分析
61)产蛋性状描述性统计分析
产蛋性状的描述性统计分析是通过IBM SPSS Statistics 21.0软件中分析-描述统计分析获得，分析的产蛋性状指标有：开产日龄、43周产蛋量、66周产蛋、鸭蛋长径、鸭蛋短径、蛋形指数、平均蛋重、蛋白高度、蛋黄色度、哈氏单位、蛋壳强度；分析的结果为有效记录数、极大值、极小值、均值及标准差；
62)全基因组关联分析
测序数据经过质控之后，使用TASSEL 3.0软件的一般线性模型GLM、EMMAX及Fastlmm软件分别进行关联分析，挖掘出与绍兴鸭产蛋性能相关的SNPs；其中GLM模型的公式计算如下：
y＝Xα+e
公式中，y为性状表型值向量；α为SNP、群体结构的固定效应定量；e为残差效应向量，X为关联矩阵；
在进行数据分析时，运用Bonferroni方法进行多重检验对全基因组关联分析结果P值进行校正，以P<1.339*10-8为达到显著水平，其中P＝0.1/N，N＝7467544为检测到的有效SNP数目；以P<1.339*10-9为达到极显著水平，其中P＝0.01/N，N＝7467544；
63)群体分层
对绍兴鸭产蛋性能的11项指标绘制Q-Q图，来判断关联分析中是否出现偏差和样本群体的分层现象；
64)显著SNPs基因注释
在获得全基因组关联分析的显著SNPs位点后，下载该位点上下游100kb的碱基序列，通过NCBI和Ensembl数据库进行序列比对，确定显著SNPs位点附近的基因，并筛选出与该位点距离最近的基因；
通过所述分析，在全基因组范围内共检测到10个与鸭产蛋性状显著关联的SNPs，其中有4个SNPs与开产日龄显著关联，分别为SNP1位于Chr2的82877692bp处，基因型为T/A，SNP2位于Chr2的82879486bp处，基因型为G/A，SNP3位于Chr2的82880023bp处，基因型为T/G，SNP4位于Chr2的82885064bp处，基因型为T/C；6个SNPs与66周龄产蛋量显著关联，分别为SNP5位于Chr2的129851977bp处，基因型为G/T，SNP6位于Chr2的129891861bp处，基因型为C/T，SNP7位于Chr2的129903026bp处，基因型为A/G，SNP8位于Chr29的4481956bp处，基因型为G/A，SNP9位于Chr29的4500604bp处，基因型为C/T，SNP10位于Chr2的129902811bp处，基因型为A/G。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115992254A (zh) * 2020-12-22 2023-04-21 广东海洋大学 一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的snp位点的基因型的试剂
CN113186302B (zh) * 2021-06-04 2022-02-01 华中农业大学 鲌鲂杂交种先锋2号的性别特异分子标记及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017108941A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Growth differentiation factor 15 as biomarker for metformin
CN108546764A (zh) * 2018-05-02 2018-09-18 浙江省农业科学院 一种与蛋鸭产蛋性能相关的分子标记及其在育种中的应用
CN108982786A (zh) * 2018-08-29 2018-12-11 扬州大学 一种鸭蛋品质综合评定方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019071407A1 (zh) * 2017-10-10 2019-04-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种鸡全基因组snp芯片及其应用
WO2020062160A1 (zh) * 2018-09-29 2020-04-02 中国农业大学 一种蛋鸡全基因组snp芯片及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017108941A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Growth differentiation factor 15 as biomarker for metformin
CN108546764A (zh) * 2018-05-02 2018-09-18 浙江省农业科学院 一种与蛋鸭产蛋性能相关的分子标记及其在育种中的应用
CN108982786A (zh) * 2018-08-29 2018-12-11 扬州大学 一种鸭蛋品质综合评定方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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京海黄鸡部分重要经济性状的全基因组关联分析研究;樊庆灿;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)农业科技辑》;20160515(第05期);第二章 *

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