CN111690550A - 一种从废纸中获得的脱墨微生物及其获得方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从废纸中获得的脱墨微生物及其获得方法与应用，所述脱墨微生物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.18086，保藏日期为2019年7月8日。本发明以废纸作为唯一营养来源，进行变温液体发酵培养，固体培养基筛选培养，对菌落进行形态学鉴定及分子生物学鉴定，将PCR产物进行测序，对测序结果进行序列分析，结果证明从废纸中筛选出一株具有脱墨作用的芽孢杆菌，命名为TM‑01。本发明有利于再生资源利用、利于环境保护、极大幅度的降低了造纸业生产成本。

Description

一种从废纸中获得的脱墨微生物及其获得方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种从废纸中获得的脱墨微生物及其获得方法与应用。
背景技术
纸张是我们人类生活的必需品，是我们获取知识、传递信息的重要媒介物质，而纸浆作为造纸业生产的基本原料，它的生产和重复利用将决定造纸业发展前景。但是当前造纸业面临两大亟待解决难点，一是我国林木资源匮乏，导致高达70％纸浆依赖于进口；二是80％纸张使用于书籍、报纸、杂志等，而这部分纸张因脱墨方法的高污染性，导致对环境污染巨大。
发明内容
为了解决我国林木资源匮乏和传统脱墨方法的高污染性以及昂贵成本，本发明提供了一种从废纸中获得的脱墨微生物及其获得方法与应用。本发明以废纸作为唯一营养来源，将菌液接种到以报纸为唯一营养来源的固体培养基上，改变培养温度，进行初筛。挑取20个菌落接种到筛选培养基进行复筛。对菌落进行形态学鉴定，以及对脱墨微生物进行分子生物学鉴定，通过特异性PCR扩增，将PCR产物进行测序，对测序结果进行序列分析，结果证明从废纸中筛选出一株具有脱墨作用的枯草芽孢杆菌，命名为TM-01。本发明有利于再生资源利用，寻找无污染的新能源；有利于环境保护、节约造纸业生产成本等发挥有效作用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种从废纸中获得的脱墨微生物，其分类命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.18086，保藏日期为2019 年7月8日。
一种从废纸中获得上述脱墨微生物的方法，包括如下步骤：
步骤一、以废纸为唯一营养来源，进行脱墨微生物的培养：
将10g废旧报纸用剪刀剪碎，放入100ml灭菌的蒸馏水中，浸泡1d，用打浆机打成匀浆，放入摇床中震荡培养12～36h；
步骤二、以废纸为唯一营养来源，通过驯化培养进一步获得脱墨微生物：
(1)吸取步骤一的菌液1ml，加入到灭菌的9ml蒸馏水中；
(2)充分混匀之后吸取步骤(1)的菌液1ml，加入到灭菌的9 ml蒸馏水中；
(3)充分混匀之后再取步骤(2)的菌液1ml，加入到灭菌的9 ml蒸馏水中；
(4)从步骤(1)、(2)、(3)的菌液中分别吸取50μL和100 μL，通过平板涂布法，将菌液均匀涂布在以废纸为唯一营养来源的固体培养基(废旧报纸20g、琼脂粉1.5g，定容到100mL)中，每个浓度重复3次，依次在40℃、50℃、60℃培养箱中进行驯化培养18～24 h；
(5)从平板中挑取20个单菌落接种到筛选培养基中(废旧报纸 20g、OP-10 9mL、菜籽油3mL、2mL0.1％的罗丹明B、0.2mmol/L CuSO4溶液2ml、琼脂粉1.5g，定容到100mL)，培养18～24h，并将此平板在紫外透射分析仪，设置365nm下观察并摄像，再用SGZ (丁香醛连氮)法进行鉴定，获得能够同时分泌脂肪酶和漆酶的脱墨菌株，进一步将脱墨菌株应用于废纸脱墨过程中。
本发明对上述脱墨微生物进行了形态学鉴定，分子生物学上的鉴定，并建立系统发育树，确定该种脱墨微生物的分类地位。具体方法如下：
1、对脱墨微生物进行形态学鉴定的方法如下：
一、通过简单染色进行脱墨微生物鉴定
以废纸为唯一营养来源，通过驯化培养，在固体平板中生长出单个菌落，对培养24h的脱墨微生物进行菌落形态观察，菌落形状不规则，有很多褶皱，呈淡黄色，大小直径为2mm。用接种环挑取单个菌落，均匀涂布于载玻片中央，经过干燥、压片，用1.5％碱性染液氯化甲基玫瑰苯胺进行染色，进行镜检，结果在显微镜下看到许多杆状结构的细菌，根据观察结果，参考《常见细菌系统鉴定手册》进行初步鉴定，确定为杆菌。
二、通过革兰氏染色进行脱墨微生物鉴定
以废纸为唯一营养来源，通过驯化培养后，在固体平板中生长出单个菌落，挑取20个单菌落，均匀涂布于载玻片中央，经过干燥、压片，用1.5％碱性染液氯化甲基玫瑰苯胺进行染色，之后用1％碘- 碘化钾进行媒染，用95％酒精洗去浮色，再用0.6％藏红T进行复染，镜检观察，细菌形态为中型杆菌，大小为0.6～1×2μm，排列方式为分散存在，具有芽孢，结果证明为革兰氏阳性菌。
三、通过芽孢染色进行脱墨微生物鉴定
用着色力强的1％孔雀石绿染色剂，在加热条件下进行染色，用蒸馏水进行水洗，再用1％沙黄进行复染，镜检观察，芽孢呈椭圆形，位于菌体中央，直径大小与菌体大小相似。利用SGZ(丁香醛连氮) 法进行鉴定，菌落呈浅粉色，证明获得的脱墨菌株能够分泌漆酶。
2、对脱墨微生物进行分子生物学鉴定的方法如下：
一、脱墨微生物基因组DNA的获得方法
经过对脱墨微生物进行形态学鉴定后，挑取单菌落，转接到液体LB培养基中进行过夜发酵培养，吸取3ml菌液，12000rmp离心弃上清，收集菌体，用液氮进行迅速冷冻菌体，将冷冻的菌体倒入研钵中，再次加入液氮2～3次，进行充分研磨，将研磨的粉末放入1.5ml离心管中，迅速加入含有十二烷基硫酸钠的Tris-EDTA缓冲液中，70℃水浴1h，取1ml菌液加入1.5ml离心管中，8000rmp离心6min，将上清液移入1.5ml离心管中，加入等体积的KAC PH4.8 8000rmp离心6min，将上清液再次转移到1.5ml离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，不要晃动，放到4℃冰箱中，放置24h，8000rmp离心6min，用75％酒精洗涤2次，弃上清，向沉淀DNA中加入TE Buffer 50μL，使其溶解，保存于-80℃冰箱中，待用。
二、脱墨微生物基因组DNA的鉴定
称取1g琼脂糖加入到100ml1*TAE中，微波炉加热，充分溶解，冷却到50℃后，加入1μL溴化乙锭，制成1％胶板，将基因组DNA 与溴酚蓝充分混匀后进行点样，在电压90V，电流65A，进行跑胶， 25min后利用紫外凝胶成像系统进行观察，检测DNA的纯度和完成性，结果获得单条带，证明DNA提取成功。
三、进行PCR扩增获得16s rDNA
利用细菌鉴定的16s rDNA序列通用引物541R/27F作为脱墨微生物的分子鉴定引物，在PCR反应体系中加入2×Taq PCR预混试剂Ⅱ及基因组DNA对脱墨微生物进行16s rDNA扩增，引物序列如下：
27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’；
541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在1000bp和 1500bp之间有一条单带，与16s rDNA大小相同，对PCR产物进行纯化、转化测序，测序得到的16s rDNA序列进行比对，分析脱墨微生物所属类群。
3、建立系统发育树进一步确定脱墨微生物种类的方法如下：
在NCBI中下载5条同源性较高及相对较低的微生物种类的16s rDNA序列，利用软件clustalx和软件MEGA对5条16s rDNA序列进行多重序列比对，结果与Bacillus subtilisStrain属于一个单元群，相似度97％，证明本发明获得的脱墨微生物属于枯草芽孢杆菌。
保藏信息：
分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；
保藏日期：2019年7月8日；
保藏编号：CGMCC No.18086。
附图说明
图1为液体发酵培养结果图；
图2发酵液生物量测定结果图；
图3为驯化培养固体平板培养结果图；
图4为简单染色结果图；
图5为革兰氏染色结果图；
图6为芽孢染色结果图；
图7为菌株在紫外透射分析仪照射下的结果图；
图8为加入SGZ前后的对比图；
图9为脱墨微生物总DNA图；
图10为脱墨微生物16s rDNA PCR图；
图11为脱墨微生物16s rDNA序列系统发育树图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明在酶法脱墨研究基础上，开展以废纸作为唯一营养来源，通过微生物培养，从废纸样品中通过驯化培养，分离得到一株新型脱墨微生物，并进行形态学鉴定，分子生物学上的鉴定，并建立系统发育树，确定该种脱墨微生物是枯草芽孢杆菌。具体步骤如下：
1、液体发酵培养
从废旧报纸中剪下含有油墨数量相同的纸张，分为三组，每组分别称量10g，放入100ml灭菌的蒸馏水中，浸泡1d，用打浆机打成匀浆，放入摇床中进行震荡培养，每隔6h，利用紫外分光光度计测量3ml培养液在OD 600nm吸光值，结果发现，随着培养时间的延长，在0～24h培养液吸光值不断升高，6h、12h的OD值分别为0.4、 0.8，表明培养液中脱墨微生物的菌体数量正在增长，并且培养液的颜色逐渐变浅，说明脱墨微生物在随着培养时间的延长，生物量不断增加，脱墨效果也在不断增加。当培养到30h时，培养液吸光值不再升高，当培养到36h时，培养液吸光值下降。同时还发现，随着脱墨微生物生物量的增加，培养液中油墨的颜色不断减少，证明油墨被脱墨微生物进行生物降解(如图1、2所示)。
2、驯化培养固体平板培养结果
吸取菌液1ml，加入到灭菌的9ml蒸馏水中，充分混匀之后吸取1ml菌液，加入到灭菌的9ml蒸馏水中，充分混匀之后再取1ml 菌液，加入到灭菌的9ml蒸馏水中，分别从上述菌液中吸取50μL和 100μL，通过平板涂布法，将菌液均匀涂布在以废纸为唯一营养来源的固体培养基中，每个浓度重复3次，分别在40℃、50℃、60℃培养箱中进行驯化培养，获得耐高温脱墨菌株，并且在菌落周围出现透明圈，证明该脱墨微生物将培养基中的油墨进行了降解(如图3所示)。并将此平板在紫外透射分析仪，设置365nm下观察并摄像，再用SGZ (丁香醛连氮)法进行鉴定，菌落呈浅粉色，证明获得的脱墨菌株能够分泌漆酶(如图7、8所示)。
3、形态学鉴定
(1)通过简单染色进行脱墨微生物鉴定
以废纸为唯一营养来源，通过驯化培养，在固体平板中生长出单个菌落，对培养24h的脱墨微生物进行菌落形态观察，菌落形状不规则，有很多褶皱，呈淡黄色，大小直径为2mm。用接种环挑取单个菌落，均匀涂布于载玻片中央，经过干燥、压片，用1.5％碱性染液氯化甲基玫瑰苯胺进行染色，进行镜检，结果在显微镜下看到许多杆状结构的细菌，根据观察结果(图4)，参考《常见细菌系统鉴定手册》进行初步鉴定，确定为杆菌。
(2)通过革兰氏染色进行脱墨微生物鉴定
以废纸为唯一营养来源，通过驯化培养后，在固体平板中生长出单个菌落，挑取单个菌落，均匀涂布于载玻片中央，经过干燥、压片，用1.5％碱性染液氯化甲基玫瑰苯胺进行染色，之后用1％碘-碘化钾进行媒染，用95％酒精洗去浮色，再用0.6％藏红T进行复染，镜检观察，细菌形态为中型杆菌，大小为0.6～1×2μm，排列方式为分散存在，具有芽孢(图5)，结果证明为革兰氏阳性菌。
(3)通过芽孢染色进行脱墨微生物鉴定
用着色力强的1％孔雀石绿染色剂，在加热条件下进行染色，用蒸馏水进行水洗，再用1％沙黄进行复染，镜检观察，芽孢呈椭圆形，位于菌体中央，直径大小与菌体大小相似。
4、分子生物学鉴定
(1)脱墨微生物总DNA的获得
经过对脱墨微生物进行形态学鉴定后，挑取单菌落，转接到液体LB培养基中进行过夜发酵培养，吸取3ml菌液，12000rmp离心弃上清，收集菌体，用液氮进行迅速冷冻菌体，将冷冻的菌体倒入研钵中，再次加入液氮2～3次，进行充分研磨，将研磨的粉末放入1.5ml离心管中，迅速加入含有十二烷基硫酸钠的Tris-EDTA缓冲液中，70℃水浴1h，取1ml菌液加入1.5ml离心管中，8000rmp离心6min，将上清液移入1.5ml离心管中，加入等体积的KAC PH4.8 8000rmp离心6min，将上清液再次转移到1.5ml离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，不要晃动，放到4℃冰箱中，放置24h，8000rmp离心6min，用75％酒精洗涤2次，弃上清，向沉淀DNA中加入TE Buffer 50μL，使其溶解，保存于-80℃冰箱中，待用。
(2)脱墨微生物总DNA的鉴定
提取脱墨微生物总DNA后，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示总DNA条带，为单条带，没有出现降解现象，并且蛋白质清除较干净。表明所提取DNA完整性较好。DNA产物可以用于后续试验 (如图9所示)。
(3)脱墨微生物16s rDNA PCR
利用细菌鉴定的16s rDNA序列通用引物541R/27F作为脱墨微生物的分子鉴定引物，在PCR反应体系中加入2×Taq PCR预混试剂Ⅱ及基因组DNA对脱墨微生物进行16s rDNA扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，图10所示结果显示在1000bp和1500bp之间有一条单带，与16s rDNA大小相同，对PCR产物进行纯化、转化测序，测序得到的16s rDNA序列进行比对，分析脱墨微生物所属类群。
(4)脱墨微生物16s rDNA序列
脱墨微生物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5、脱墨微生物16s rDNA序列系统发育树
通过与测序结果校正，保留中间可靠部分序列10 49bp，进行系统发育树分析，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，并比较分离菌株与已知在NCBI中下载5条同源性较高及相对较低的微生物种类的16s rDNA序列，利用软件clustalx和软件MEGA对5条16s rDNA序列进行多重序列比对，结果与Bacillus subtilis Strain属于一个单元群，相似度97％，证明本发明获得的脱墨微生物为芽孢杆菌。脱墨微生物16s rDNA序列系统发育树如图11所示。
Figure RE-GDA0002333111280000111
<110> 哈尔滨学院
<120> 一种从废纸中获得的脱墨微生物及其获得方法与应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1049
<212> DNA
<213> 脱墨微生物TM-01的16s rDNA序列
<400> 1
gggcgtcgtg ctatactgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120
ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa ggtggcttcg 180
gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca 240
aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420
aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540
aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctagtgg tttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840
taagcactcc ggcctggggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga aattgacggg 900
ggcccgcaca agcgggggga agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac tcctctgaca tccctaaaga taggacgtcc ctttcggggc aaaatgacag 1020
ggggttcatg gttgtcccca cttcgggcc 1049

Claims (6)

1.一种从废纸中获得的脱墨微生物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.18086。
2.根据权利要求1所述的从废纸中获得的脱墨微生物，其特征在于所述脱墨微生物的16s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种权利要求1和2任一权利要求所述脱墨微生物的获得方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
步骤一、以废纸为唯一营养来源，进行脱墨微生物的培养：
将10g废旧报纸用剪刀剪碎，放入100ml灭菌的蒸馏水中，浸泡1d，用打浆机打成匀浆，放入摇床中震荡培养12～36h；
步骤二、以废纸为唯一营养来源，通过驯化培养进一步获得脱墨微生物：
(1)吸取步骤一的菌液1ml，加入到灭菌的9ml蒸馏水中；
(2)充分混匀之后吸取步骤(1)的菌液1ml，加入到灭菌的9ml蒸馏水中；
(3)充分混匀之后再取步骤(2)的菌液1ml，加入到灭菌的9ml蒸馏水中；
(4)从步骤(1)、(2)、(3)的菌液中分别吸取50μL和100μL，通过平板涂布法，将菌液均匀涂布在以废纸为唯一营养来源的固体培养基中，每个浓度重复3次，依次在40℃、50℃、60℃培养箱中进行驯化培养18～24h；
(5)从平板中挑取20个单菌落接种到筛选培养基中，培养18～24h，获得能够同时分泌脂肪酶和漆酶的脱墨菌株。
4.根据权利要求3所述的脱墨微生物的获得方法，其特征在于所述以废纸为唯一营养来源的固体培养基配方为：废旧报纸20g、琼脂粉1.5g，定容到100mL。
5.根据权利要求3所述的脱墨微生物的获得方法，其特征在于所述筛选培养基配方为：废旧报纸20g、OP-10 9mL、菜籽油3mL、2mL0.1％的罗丹明B、0.2mmol/L CuSO4溶液2ml、琼脂粉1.5g，定容到100mL。
6.一种权利要求1和2任一权利要求所述脱墨微生物在废纸脱墨过程中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103525793A (zh) * 2013-10-29 2014-01-22 中国农业科学院饲料研究所 一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用

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