CN111678897B - 检测hbv的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法。在本发明中,以金属有机骨架材料(MIL‑101)为印迹载体,在其表面修饰病毒适体,并加入荧光染料单体罗丹明B和模板病毒进行印迹,洗脱模板后得到具有适体和分子印迹腔双重识别的分子印迹聚合物。该印迹聚合物与目标物结合后,荧光染料罗丹明B的荧光强度发生变化而MIL‑101的荧光几乎不变,基于此构建比率型荧光检测体系。该方法结合金属有机骨架材料,分子印迹技术和荧光比率型检测的优点,检测灵敏度高,检出限低,选择性好,背景信号低,印迹因子高达5.72,在病毒检测方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学检测技术领域,具体涉及一种检测乙型肝炎病毒(HBV) 的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法及应用。
背景技术
相较于小分子检测而言,选择性和灵敏度不足是大分子检测领域经常遇到的问题,多年来科研人员发展了多种策略解决该问题并取得了一定的成果。包括分子印迹识别策略[Liang-hui Luo,Feng Zhang,Chun-yan Chen,Chang-qun Cai. AnalyticalChemistry.2019,91(24),15748-15756.],DNA或RNA适配体识别策略 [Jae Kwon,YeonjuLee,Taek Lee,Jae-Hyuk Ahn.Analytical Chemistry.2020,92(7), 5524-5531.],与传统的抗体识别策略相比,分子印迹技术和适配体技术均具备易于体外合成,选择性强,灵敏度高,成本低的优点,且可以实现对小分子或大分子的检测分析。因此,本发明将病毒适配体作为功能单体引入分子印迹传感器,分子印迹和适配体的组合提供双重识别效果,提高大分子病毒检测的选择性和灵敏度。
传统的分子印迹技术多使用Fe3O4、量子点为印迹载体,虽然具备足够的磁性或光稳定性,但其相对较小的比表面积会限制大分子病毒的印迹效率。作为一类常用的载体材料,金属有机骨架材料(MOFs)同时具备高比表面积和高稳定性,以其作为印迹载体,有助于提高印迹因子和灵敏度。周晶晶等人通过优化碱辅助的原位水热合成法制备高质量的氨基功能化MOF材料MIL-101-NH2,其具备高比表面积和纳米级孔洞,对气体分子CO2和N2有良好地吸附能力[周晶晶,刘开宇,孔春龙,陈亮.过程工程学报.2013年第13卷第1期.]。此外,氨基化MOF材料MIL-101-NH2除均匀的多孔结构、易于修饰组装外,还具有理想的荧光特性。Hua-Qing Yi等人提出利用其稳定的荧光特性结合荧光染料构建比率型荧光检测体系用于检测有机溶剂中的水分子,极大地降低了检测背景信号,提高了检测灵敏度[Hua-QingYin,Ji-Chun Yang,Xue-Bo Yin.Analytical Chemistry. 2017,89,13434-13440.]。
本发明选择MOF材料MIL-101为印迹载体和荧光参比信号,外加荧光染料罗丹明B作为变化信号,首次构建了MOF材料与比率荧光检测相结合的传感体系,并应用于大分子病毒的高灵敏和特异性检测。结合适体与分子印迹腔的双重识别作用,极大的提高了该传感器的检测性能。结果表明,本发明构建的传感器具有高选择性、高灵敏度、低检测限、宽线性等优点,对于病毒的高特异性识别和分析检测具有重要的意义和实际应用价值,且该方法也可以推广至其它物质的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测HBV的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法,并将所述传感器应用于HBV的特异性识别与检测。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种高特异性检测HBV分子印迹比率型荧光传感器的制备及应用,其特征在于,该方法具有以下工艺步骤:
(1)金属有机骨架材料MIL-101的制备及修饰:
将Cr(NO)3·9H2O、NH2BDC和NaOH加入水中混合搅拌,转移至聚四氟乙烯反应器中反应得到绿色悬浮液,即为氨基修饰的金属有机骨架材料(MIL-101- NH2)。随后将得到的粗产物用DMF洗涤除去未反应的杂质,并使用溶剂热处理法进行纯化。最后加入活化的目标病毒适体,基于适体上羧基与有机骨架上氨基的酰胺作用,将适体修饰在金属有机骨架上得到有机骨架-适体材料(MIL-101- Apt)。
(2)病毒双重识别分子印迹比率型荧光传感器的制备及应用:
将荧光染料单体罗丹明B、模板病毒HBV、功能单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、交联剂四乙氧基硅烷(TEOS)等物质分别加入MIL-101-Apt进行印迹,再以醋酸洗脱模板,最终得到具有适体和印迹腔双重识别的分子印迹聚合物。该印迹聚合物与目标物结合后,荧光染料罗丹明B的荧光强度发生变化而载体MIL-101的荧光强度不发生变化,基于此应用于对目标病毒的比率型检测。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)以MIL-101金属有机骨架材料为印迹载体,引入适体并通过酰胺键将其修饰在MIL-101材料表面,并作为功能单体进行分子印迹,最终形成适体-MIP 双重识别体系。其同时具备MIL-101材料高比表面积、高稳定性和分子印迹技术高特异性优点;
(2)印迹过程加入荧光染料罗丹明B,在MIP与目标物结合后,印迹腔内的荧光染料荧光强度发生变化,而MIL-101的荧光几乎不变,基于此实现荧光信号的比率变化,降低检测的背景信号;
(3)实验结果表明,所述病毒分子印迹荧光传感器对HBV具有很高的特异性识别能力以及很低的检测限,应用于检测时其检测过程对操作人员的专业要求不高,具有临床治疗与诊断病毒性疾病的潜在能力。
附图说明
[图1]MIP传感器的结构和荧光检测原理图。
[图2]MIL-101(a),MIP(b),NIP(c)粒子的傅里叶变换红外光谱图。
[图3]MIL-101(a),MIP(b),NIP(c)粒子的扫描电镜图。
[图4]MIL-101(a),MIP和NIP(b)粒子的X射线衍射图。
[图5]MIL-101(A),MIP(B)粒子的N2吸附-解吸实验图。
[图6]MIL-101(a),MIP(b),NIP(c)的热重分析图。
[图7]适体用量(a),四乙氧基硅烷用量(b),pH(c),MIP浓度(d),孵育温度 (e),孵育时间(f)优化图。
[图8]不同浓度HBV荧光检测荧光光谱及线性关系图
[图9]MIP的选择性(a)和竞争性(b)考察图。
[图10]稀释人血清样中HBV加标回收结果图。
[图11]G-MIPs/R-MIPs的重现性(a)和稳定性(b)考察图。
具体实施方案
在此,将结合附图及实施例,对本发明的具体实施方案作进一步的详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不限制本发明的应用范围及扩展。
实施例1:一种双重识别检测HBV的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法。
(1)MIL-101-NH2的制备:将800mg(2mmol)Cr(NO)3·9H2O、360mg(2 mmol)NH2BDC和159.02mg NaOH加入15mL水中搅拌1小时,然后将溶液转移到聚四氟乙烯基反应器中,在150℃下反应12小时。反应后,将反应器取出并自然冷却至室温,得到绿色悬浮液。
(2)MIL-101-NH2的纯化:首先用DMF溶剂清洗得到的MIL-101-NH2粗产物,去除未反应的大多数杂质。随后采用溶剂热处理方法进一步洗涤出去印迹孔中的少量杂质:将产物分散在25mL的乙醇中并置于烤箱中,在90℃下反应6 小时后取出,即得到纯MIL-101-NH2。
(3)MIL-101-Apt的制备:首先使用EDC/NHS(4:1)溶液活化适体:在250 μL 1μMHBV适体中加入1M EDC和0.25M NHS各125μL,并在室温下振荡1 小时。随后将100mg MIL-101-NH2分散在4.5mL的PBS缓冲液中(pH=7.4),然后添加上述HBV适体在37℃振荡过夜。最后将所得的MOFs-Apt材料用PBS 溶液洗涤3次以上以除去未结合的适体,直到上清液中检测不到适体的紫外吸收。
(4)印迹聚合物(MIPs)的制备:首先,将0.0048g罗丹明B和EDC/NHS(4: 1)溶于4mL超纯水中超声15s,然后在37℃振荡1h以活化罗丹明B。将30 mg MIL-101-Apt和0.4mL HBV在37℃下孵育1h,随后将其分散在10mL超纯水中并强烈搅拌,加入10μL APTES,降低转速,反应0.5h后加入上述活化的罗丹明B,反应5h后,添加TEOS和NH3·H2O各20μL聚合12h得到含模板病毒的印迹聚合物,并用超纯水洗涤该产物多次以除去未反应的单体和病毒。最后,用0.1M HAc(含10%SDS)多次洗涤除去模板病毒,直到洗脱液检测不到HBV 的紫外吸收。根据相同的方法制备非印迹聚合物(NIPs),但不添加模板。
(5)所述病毒分子印迹荧光传感器的制备:通过超声将MIP分散在PBS溶液中,取200μL于比色皿中检测该溶液的荧光。随后,将不同浓度的HBV溶液加入到上述溶液中,恒温振荡一段时间后,取200μL溶液于比色皿中检测荧光,并记录添加病毒前后在相同发射下的荧光强度差ΔF。采用RF-5301PC荧光分光光度计检测荧光,构建成一种分子印迹比率型荧光传感器。检测条件:激发波长:290nm和550nm,发射波长:460nm和570nm,激发狭缝:5.0nm,发射狭缝:5.0 nm。
实施例2:所述分子印迹比率型荧光传感器及中间产物的形貌和结构表征。
利用傅里叶变换红外光谱仪、扫描电镜、X射线衍射仪(XRD)、热重分析仪及N2吸附-解吸实验对制备的所有材料进行了结构和形貌的表征。
图2为MIL-101,MIL-Apt、MIP和NIP的红外光谱图。2976和2365cm-1处是苯环的C-H伸缩振动峰,1600cm-1处是氨基N-H弯曲变形振动峰,1498 和1431cm-1处是MIL-101-NH2骨架中的-(OCO)-的拉伸缩振动峰,1340和1258 cm-1处是氨基苯环上C-N伸缩振动峰,表明MIL-101-NH2材料制备成功,形成 NH2BDC骨架。1600cm-1处的是适体C=O的伸缩振动峰,1290cm-1处是酰胺结构的吸收峰,结果表明适体成功修饰在MIL-101上,形成MIL-Apt。1038cm-1处是O-Si-O的伸缩振动峰,表明印迹成功,得到MIP。NIPs与MIPs相比没有明显的差异,表明印迹过程对颗粒的组成几乎没有影响。
图3为MIL-101、MIP和NIP粒子的扫描电镜图。从图中可以看出MIL-101 粒子表面光滑,均匀且高度分散,尺寸约为87nm。MIP微粒主要呈现八面体形状,尺寸约120nm,印迹层厚度约16.5nm,表明成功地进行了印迹。另外,MIP 和NIP的形态和粒径没有很大的差异,证明印迹和洗脱过程对整个颗粒结构几乎没有影响。
图4是MIL-101、MIP和NIP粒子的XRD分析图,在2θ为2°-20°处观察到 MIL-101的主要特征峰,与文献报道的MIL-101-NH2的模拟XRD图谱相似,表明该材料制备成功。此外,由于印迹层的覆盖,所有峰的强度发生显著下降,表明成功地在材料上进行了印迹。
图5是MIL-101和MIP的N2吸附-解吸实验结果图,计算得到MIL-101和 MIP的表面积分别为1783.8427m2/g和398.2413m2/g,表明在MIL-101上进行印迹之后,材料仍具备较大的表面积。
图6是MIL-101、MIP和NIP的热重分析图,3-100℃的失重对应MIL-101 材料中游离水的损失,100-350℃的失重对应MIP-101材料中配位水的损失及骨架结构的分解,350℃时MIL-101的重量损失达36%。MIP和NIP的失重趋势与MIL-101相似,但重量损失较小,350℃时约23%。结果表明合成的MIL-101 和MIP具有令人满意的热稳定性。
实施例3:所述分子印迹比率型荧光传感器的应用。
本实施例的实验条件为:适体用量为250μL,单体TEOS用量为40μL,MIP 浓度为0.8mg/L,pH为7.4,吸附时间为20min,温度为25℃。具体实施方案为:取特定浓度的HBV加入到0.8mg/L的MIP溶液中,将整个体系的pH调节为 7.4,在25℃下振荡吸附20min后,测其荧光强度。
(1)MIL-101-MIP比率型荧光传感器对不同浓度HBV的检测
按上述实验步骤,以本发明所述的比率型荧光传感器对不同浓度的HBV溶液进行检测分析,结果如图8所示,MIP在570nm处的荧光强度发生变化,而在460nm处的荧光强度保持不变,根据两个荧光信号的比率关系,所制备的传感器对HBV的分析浓度范围为10-3500pM,检测限为1.8pM。结果表明该传感器中将多孔MIL-101载体结合分子印迹对病毒进行荧光比率型检测的方式具有良好的检测效果,灵敏度高,线性范围宽,检测限低,特异性好。
(2)MIL-101-MIP比率型荧光传感器检测HBV的选择性和竞争性实验
选择了相同浓度的HBV,HAV,肠病毒71型疫苗(EV71),日本脑炎病毒(JEV),狂犬病毒(RV)作为目标物来考察所述比率型荧光传感器对HBV的选择性吸附与检测能力。重复三次实验,取平均值。实验结果如图9(a)所示,添加HBV后,MIP 在570nm处观察到最高的荧光猝灭效率,而加入其它四种病毒后,荧光强度变化很小,表明该传感器对HBV的吸附能力明显强于对其它病毒的吸附能力。竞争性实验结果如图9(b)所示,在HBV存在下,荧光在570nm处明显猝灭,而加入其它各病毒后,荧光强度没有明显变化,表明本发明所述的传感器对目标物具有良好的识别和抗干扰能力。
(3)MIL-101-MIP比率型荧光传感器对HBV的加标回收
采用了加标回收的方法来评估前面所述的方法对实际样品的分析能力。取五份用磷酸盐缓冲溶液稀释的人血清样品(稀释100倍,pH=7.4),分别向其中加入浓度为20,700,1500,2000,2800pM的HBV溶液,用本发明制备的荧光传感器分别测定在460nm和570nm处的荧光强度。实验结果如图10所示,回收率在86.75~100.89%之间。结果表明,所制备的传感器具有一定的实际应用潜力。
(4)MIL-101-MIP别比率型荧光传感器的重现性和稳定性考察
用单个传感器循环测定相同浓度的HBV,以评估传感器的稳定性,如图11(a) 所示,结果表明,MIP荧光比率略有下降但总体相对稳定,在六次循环之后与原始比率相比仍保持初始强度的80%。通过在七个不同的传感器上独立检测相同浓度的HBV来评估重现性,如图11(b)所示,七个传感器的检测结果基本上恒定不变。以上结果表明,本发明所述的分子印迹比率型荧光传感器的稳定性和重现性均令人满意。
Claims (2)
1.一种双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器的制备方法,其特征在于:以金属有机骨架材料MIL-101为载体,病毒适体作为功能单体之一进行分子印迹,形成适体-分子印迹聚合物双重识别体系,印迹过程中加入了荧光染料罗丹明B,在分子印迹聚合物与目标物结合后,印迹腔内的荧光染料荧光强度发生变化,而MIL-101材料的荧光强度几乎不变,基于此构建了所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器;
所述制备方法包括如下步骤:
1)MIL-101-NH2的制备及纯化:将800mg Cr(NO)3·9H2O、360mg NH2BDC和159.02mg NaOH加入15mL水中搅拌1小时,然后将溶液转移到聚四氟乙烯基反应器中,150℃下反应12小时,随后自然冷却至室温得到绿色悬浮液,用DMF溶剂清洗该绿色悬浮液进行粗提纯,再将粗提纯产物分散在25mL的乙醇中并置于烤箱中,在90℃下反应6小时后取出,即得到纯MIL-101-NH2;
2)MIL-101-Apt的制备:首先,在250μL 1μM HBV适体中加入1M EDC和0.25M NHS各125μL,室温下振荡1小时得到活化的HBV适体,然后将100mg MIL-101-NH2分散在4.5mL的pH=7.4,的PBS缓冲液中,添加上述活化的HBV适体在37℃振荡过夜,最后将所得的MIL-101-Apt材料用PBS溶液洗涤3次以上以除去未结合的适体,直到上清液中检测不到适体的紫外吸收;
3)印迹聚合物(MIP)的制备:首先,将0.0048g罗丹明B与EDC/NHS,以4:1形式混合,溶于4mL超纯水中超声15s,然后在37℃振荡1h以活化罗丹明B,然后将30mg MIL-101-Apt和0.4mL模板病毒HBV在37℃下孵育1h,随后将其分散在10mL超纯水中并在强烈搅拌下加入10μL APTES,降低转速反应0.5h后加入上述活化的罗丹明B,反应5h后,添加交联剂TEOS和NH3·H2O各20μL聚合12h得到含HBV的印迹聚合物,用超纯水洗涤该产物多次以除去未反应的单体和病毒,最后,用0.1M含10%SDS的HAc多次洗涤除去模板病毒,直到洗脱液检测不到HBV的紫外吸收,根据相同的方法制备非印迹聚合物(NIP),但不添加模板病毒;
4)所述分子印迹比率型荧光传感器的制备:通过超声将MIP分散在PBS缓冲液中,取200μL于比色皿中检测该溶液的荧光,随后加入不同浓度的HBV溶液,恒温振荡一段时间后,取200μL溶液于比色皿中检测荧光,并记录添加病毒前后在相同发射下的荧光强度差ΔF,采用RF-5301PC荧光分光光度计检测荧光,构建成一种分子印迹比率型荧光传感器;
所述分子印迹比率型荧光传感器的检测条件为:激发波长290nm和550nm,发射波长460nm和570nm,激发狭缝:5.0nm,发射狭缝:5.0nm。
2.根据权利要求1所述制备方法制备得到的双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器的应用,其特征在于:用所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器对不同浓度HBV溶液进行分析,以评估其对目标病毒的检测范围和检测限;或用所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器检测相同浓度的不同病毒,以评估其对目标病毒的选择性识别与检测能力;或将所述双重识别检测乙型肝炎病毒的分子印迹比率型荧光传感器用于人血清中HBV加标回收,以评估其对HBV的实际分析能力。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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