CN111659158A - 一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，包括：步骤1，配制蓝色葡聚糖溶液；步骤2，准备待分离的外泌体样品；步骤3，将配制好的蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品进行均匀混合；步骤4，将混合后样品进行柱洗脱，从洗脱开始出现蓝色时进行外泌体收集直至蓝色消失为止，即可实现对外泌体的收集；所述蓝色葡聚糖为水溶性蓝色葡聚糖；所述蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品是按照体积比为1:1进行混合的。本发明解决了在没有色谱仪的情况下可以用丙烯葡聚糖凝胶分离柱来准确洗脱收集外泌体。

Description

一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法
技术领域
本发明涉及排阻色谱法提取外泌体技术领域，尤其涉及一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法。
背景技术
外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30～100nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。
外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。
近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。
其中排阻色谱法(SEC)是一种简单、温和、有效的去除样品来源中的小分子污染物的方法，得到了广泛的应用。
发明人发现，外泌体总是在选定的凝集基质柱的不同体积中被洗脱，但是不同长度、直径、基质成分或不同收集洗脱参数的分离柱可能导致结果差异和变化，使他们很难在已经发表的结果中进行联系和分析理解。因此，尚缺乏一种可靠、可重复性的SEC测定标准。
发明内容
为了解决上述相关领域中不足，本发明提供一种用于排阻色谱法提取外泌体的分子标记方法。
本发明的一种用于排阻色谱法提取外泌体的分子标记方法是通过以下技术方案实现的：
一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，包括：
步骤1，配制蓝色葡聚糖溶液；
步骤2，准备待分离的外泌体样品；
步骤3，将配制好的蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品进行均匀混合；
步骤4，将混合后样品进行柱洗脱，从洗脱开始出现蓝色时进行外泌体收集直至蓝色消失为止，即可实现对外泌体的收集。
进一步地，步骤1中所述蓝色葡聚糖为水溶性蓝色葡聚糖。
进一步地，所述蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品是按照体积比为1:1进行混合的。
进一步地，所述蓝色葡聚糖溶液是通过用0.1mMPBS将水溶性蓝色葡聚糖配制成浓度为1mg/mL的溶液。
进一步地，所述待分离的外泌体样品包括血清样本和细胞培养上清。
进一步地，当所述待分离的外泌体样品为血清样本时，将所述血清标本与所述蓝色葡聚糖溶液按1:1的体积比混合。
进一步地，所述待分离的外泌体样品为细胞培养上清时，取所述蓝色葡聚糖溶液60倍体积量的细胞培养上清用浓缩离心管浓缩到与所述蓝色葡聚糖溶液体积量相同后再与所述蓝色葡聚糖溶液按1:1的体积比混合。
进一步地，所述柱洗脱是通过Sephacryl S-300(丙烯葡聚糖凝胶 S-300)或Sephacryl S-200(丙烯葡聚糖凝胶S-200)进行的。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明用可溶性的蓝色葡聚糖作为颜色标记来定位Sephacryl S-300or S-200柱分离外泌体，外泌体组分可以通过蓝色葡聚糖进行监测出峰时间，因为是可溶性蓝色分子，从洗脱开始出现蓝色时进行外泌体收集可以准确定位外泌体的出峰位置。经过实验验证，适用于所有标本，从而解决了在没有色谱仪的情况下可以用葡聚糖分离柱来准确洗脱收集外泌体。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为实施例1分别用S-200和S-300洗脱和纳米颗粒跟踪分析的结果图；其中，图1a:S-200分离柱洗脱后的高效液相色谱结果图；图1b：S-300分离柱洗脱后的高效液相色谱结果图；图1c：将S-200 分离柱洗脱收集的不同出峰位置的样品用纳米颗粒跟踪分析仪器分析显示；图1d：将S-300分离柱洗脱收集的不同出峰位置的样品用纳米颗粒跟踪分析仪器分析显示；
图2为实施例1中分别用S-200和S-300洗脱和western blot验证的结果；其中，图2a:S-200分离柱洗脱后的高效液相色谱结果图；图2b：S-300分离柱洗脱后的高效液相色谱结果图；图2c左：将S-200 分离柱洗脱收集到的P1和P2溶液进行western blot鉴定；图2c右：将S-300分离柱洗脱收集到的P1和P2溶液进行western blot鉴定；
图3为实施例1中样品与蓝色葡聚糖混合的洗脱及western blot 鉴定；
图4为实施例1-4不同样品用蓝色葡聚糖作为外泌体出峰位置分子标志的出峰图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明中未详细说明的结构或工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本技术领域的技术人员应当知晓。
一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，包括：
步骤1，配制蓝色葡聚糖溶液；
步骤2，准备待分离的外泌体样品；
步骤3，将配制好的蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品进行均匀混合；
步骤4，将混合后样品进行柱洗脱，从洗脱开始出现蓝色时进行外泌体收集直至蓝色消失为止，即可实现对外泌体的收集。
进一步地，步骤1中所述蓝色葡聚糖为水溶性蓝色葡聚糖。
进一步地，所述蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品是按照体积比为1:1进行混合的。
进一步地，所述蓝色葡聚糖溶液是通过用0.1mMPBS将水溶性蓝色葡聚糖配制成浓度为1mg/mL的溶液。
进一步地，所述待分离的外泌体样品包括血清样本和细胞培养上清。
进一步地，当所述待分离的外泌体样品为血清样本时，将所述血清标本与所述蓝色葡聚糖溶液按1:1的体积比混合。
进一步地，所述待分离的外泌体样品为细胞培养上清时，取所述蓝色葡聚糖溶液60倍体积量的细胞培养上清用浓缩离心管浓缩到与所述蓝色葡聚糖溶液体积量相同后再与所述蓝色葡聚糖溶液按1:1的体积比混合混合。
进一步地，所述柱洗脱是通过Sephacryl S-300(丙烯葡聚糖凝胶 S-300)或Sephacryl S-200(丙烯葡聚糖凝胶S-200)进行的。
实施例1
本实施例提供一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法。
按照上述方法进行测定。
本实施例用神经母细胞瘤(SupB15)培养上清120mL浓缩到2mL 后，分别用S-200和S-300两种分离柱进行上样洗脱，得到的为实线出峰图，再用2mL(浓度1mg/mL)的可溶性蓝色葡聚糖，分别用S-200 和S-300两种分离柱进行上样洗脱得到的虚线出峰图，将两个出峰图合并(如图1a，b)，将不同峰P1和P2收集的外泌体用纳米颗粒跟踪分析仪器NanoparticleTracking Analysis，NTA)分析显示，具有外泌体大小的颗粒集中在与蓝色葡聚糖重合的小峰中(如图1c，d)。
如图2所示，对于收集到的P1和P2溶液进行western blot鉴定，显示具有外泌体特性的成分主要集中在P1，即与蓝色葡聚糖重合的小峰中。
如图3所示，将2mL神经母细胞瘤(SupB15)培养上清浓缩样品与2mL的蓝色葡聚糖溶液(1mg/mL)混合后再用Sephacryl S-200 柱洗脱分离外泌体，western blot验证在重合小峰处的外泌体保持其活性不变。由于样品和blue-dextran混合在P1处就只有一个融合的峰，没法显示各自的峰。
实施例2
本实施例提供一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法。
按照上述方法进行测定。
如图4a所示，本实施例将NK细胞培养上清120mL浓缩到2mL 后，用S-300分离柱进行洗脱分离得到实线出峰图。再用2mL(浓度 1mg/mL)的可溶性蓝色葡聚糖溶液，用S-300分离柱进行洗脱得到的虚线出峰图，并将两个出峰图合并，均能有效重合。线条表示用纳米颗粒跟踪分析仪器显示具有外泌体大小的颗粒集中的位置。
实施例3
本实施例提供一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法。
按照上述方法进行测定。
如图4b所示，本实施例将神经母细胞瘤SupB15培养上清120mL 浓缩到2mL后，用S-300分离柱进行洗脱分离得到实线出峰图。再用2mL(浓度1mg/mL)的可溶性蓝色葡聚糖溶液，用S-300分离柱进行洗脱得到的虚线出峰图，并将两个出峰图合并，均能有效重合。线条表示用纳米颗粒跟踪分析仪器显示具有外泌体大小的颗粒集中的位置。
实施例4
本实施例提供一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法。
按照上述方法进行测定。
如图4c所示，本实施例将人血清2mL，用S-300分离柱进行洗脱分离得到实线出峰图。再用2mL(浓度1mg/mL)的可溶性蓝色葡聚糖溶液，用S-300分离柱进行洗脱得到的虚线出峰图，并将两个出峰图合并，均能有效重合。线条表示用纳米颗粒跟踪分析仪器显示具有外泌体大小的颗粒集中的位置。
实施例5
本实施例提供一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法。
按照上述方法进行测定。
如图4d所示，本实施例将白血病细胞Kasumi-1培养上清120mL 浓缩到2mL后，用S-300分离柱进行洗脱分离得到实线出峰图。再用2mL(浓度1mg/mL)的可溶性蓝色葡聚糖溶液，用S-300分离柱进行洗脱得到的虚线出峰图，并将两个出峰图合并，均能有效重合。线条表示用纳米颗粒跟踪分析仪器显示具有外泌体大小的颗粒集中的位置。
需要说明的是：
1.本发明所使用的人血清样本是抽取健康自愿者外周血后分离而得的；
2.本发明所使用的其他样品均是将相应细胞常规进行细胞培养5 天，收集上清前2天，换成exosome free(不含外泌体)血清培养液培养2天后收集细胞培养液上清，普通滤器过滤除去细胞残渣后再根据上述方法制得的；
3.其他样品(除人血清样本外)所使用的细胞株均来源于南加州大学Saban研究所Ambrose Y.Jong实验室；
4.本发明并未具体说明制备方法的实验材料和仪器，均是直接购买而得未经处理的，属于现有技术。

Claims (8)

1.一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，包括：
步骤1，配制蓝色葡聚糖溶液；
步骤2，准备待分离的外泌体样品；
步骤3，将配制好的蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品进行均匀混合；
步骤4，将混合后样品进行柱洗脱，从洗脱开始出现蓝色时进行外泌体收集直至蓝色消失为止，即可实现对外泌体的收集。
2.如权利要求1所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，步骤1中所述蓝色葡聚糖为水溶性蓝色葡聚糖。
3.如权利要求1所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，所述蓝色葡聚糖溶液与待分离的外泌体样品是按照体积比为1:1进行混合的。
4.如权利要求2所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，所述蓝色葡聚糖溶液是通过用0.1mM PBS将水溶性蓝色葡聚糖配制成浓度为1mg/mL的溶液。
5.如权利要求1所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，所述待分离的外泌体样品包括血清样本和细胞培养上清。
6.如权利要求5所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，当所述待分离的外泌体样品为血清样本时，将所述血清样本与所述蓝色葡聚糖溶液直接按1:1的体积比混合。
7.如权利要求5所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，所述待分离的外泌体样品为细胞培养上清时，取所述蓝色葡聚糖溶液60倍体积量的细胞培养上清用浓缩离心管浓缩到与所述蓝色葡聚糖溶液体积量相同后再与所述蓝色葡聚糖溶液按1:1的体积比混合。
8.如权利要求1所述的一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法，其特征在于，所述柱洗脱是通过Sephacryl S-300(丙烯葡聚糖凝胶S-300)或Sephacryl S-200(丙烯葡聚糖凝胶S-200)进行的。
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