CN111658669B - 一种外敷组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外敷组合物及其应用，按重量份计，包括1‑10份免疫细胞外泌体提取物、0.1‑5份芦苇提取物、0.5‑5份透明质酸钠、0.1‑2份组氨酸、0.5‑2份柠檬酸盐、1‑5份甘油、1‑10份纳米脂质体和0.05‑0.2份海参皂甙。本发明的外敷组合物可以有效的缓解皮肤过敏症状，甚至达到完全缓解或消除；可以有效缓解痤疮、起痘症状，甚至达到完全缓解或消除；人体对免疫细胞外泌体提取物的排异性低，因此具有更高的安全性；通过对免疫细胞外泌体的合理、有效的应用，提高了资源利用率，防止资源浪费。

Description

一种外敷组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种外敷组合物及其应用。
背景技术
免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调.共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。免疫系统是防卫细菌、病毒等病原体入侵最有效的武器，其中，免疫细胞在免疫系统中扮演重要的角色，在免疫应答方面起着重要的作用。免疫细胞分泌的外泌体主要包括白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、穿孔素和细胞毒因子等生物活性物质，可以有效的消灭清除病原体与异源性物质。
免疫细胞产生的外泌体亲缘性与人体更接近，人体对外泌体的排异性很低，因此相比药物具有更高的安全性。
目前市场上的外敷用药以药物为主。免疫细胞培养，目前主要有两方面的应用，一方面为获取免疫细胞，另一方面从外泌体提取抗体，而其中大量的活性物质因没有找到合理、有效的应用途径，被丢弃掉，造成资源的浪费。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种外敷组合物及其应用，所述外敷组合物应用于缓解皮肤过敏症状，提高免疫细胞外泌体的利用。
本发明公开了一种外敷组合物，按重量份计，包括1-10份免疫细胞外泌体提取物、0.1-5份芦苇提取物、0.5-5份透明质酸钠、0.1-2份组氨酸、0.5-2份柠檬酸盐、1-5份甘油、1-10份纳米脂质体和0.05-0.2份海参皂甙。
优选的，所述外敷组合物包括5份免疫细胞外泌体提取物、2份芦苇提取物、5份透明质酸钠、1份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、1.5份甘油、5份纳米脂质体和0.2份海参皂甙。
优选的，所述外敷组合物包括8份免疫细胞外泌体提取物、1份芦苇提取物、4份透明质酸钠、2份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、2份甘油、5份纳米脂质体和0.1份海参皂甙。
优选的，所述外敷组合物包括10份免疫细胞外泌体提取物、1.5份芦苇提取物、3份透明质酸钠、1份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、1.5份甘油、3份纳米脂质体和0.05份海参皂甙。
优选的，所述外敷组合物包括10份免疫细胞外泌体提取物、1份芦苇提取物、5份透明质酸钠、2份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、2份甘油、5份纳米脂质体和0.2份海参皂甙。
优选的，所述免疫细胞外泌体提取物的制备方法包括：获取淋巴细胞；
培养所获取的淋巴细胞培养并诱导淋巴细胞转化为免疫细胞；获取免疫细胞的外泌液；浓缩所述外泌液；置换外泌液的缓冲液。
优选的，所述免疫细胞外泌体提取物的制备方法包括：获取脐带血或外周血，通过淋巴细胞分离液获取淋巴细胞；将获取的淋巴细胞用X-VIVO培养基重悬，将淋巴细胞的密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml，添加GM-CSF100ng/ml、IFN-γ200ng/ml和TNF-α20ng/ml进行培养，第二天添加IL-1100ng/ml、IL-4 100ng/ml、IL-12 100ng/ml、IL-2 1000UI/ml；第三天到第七天，每天通过添加含有IL-2 1000UI/ml和IL-15 1000UI/ml的X-VIVO培养基将细胞密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml；第七天到第十四天，每天通过添加培养基将细胞密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml；将第十四天的免疫细胞培养液300g-400g离心15分钟-20分钟，取上清液，将上清液在2000g-3000g继续离心40-60min，取上清得到外泌液；将外泌液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液，过滤液经滤膜孔径为30-60nm的超滤装置进行浓缩；超滤装置内加入PBS缓冲液，进次超滤，重复3-5次；用PBS缓冲液洗涤超滤装置的滤膜，取洗涤液。
优选的，所述外敷组合物的制备方法包括：按比例配制各组份；各组份加入水后，搅拌均匀；将混合物在低温低压下蒸发；将低温低压蒸发后的混合物冷冻并冻干。
优选的，混合物低温低压下蒸发的方法：在4-8度、真空度100毫巴的条件下，蒸发20分钟；冻干混合物冷冻并冻干的方法包括：将混合物在液氮下速冻，将冷冻后的混合物在低温冻干箱内冷冻干燥成固体，冷冻干燥的方法包括：低温冻干箱的冷阱温度为-40度，真空度为0.1毫巴，板层温度为-20度，混合物在-110度冻干15分钟后，板层温度由-20度升至8度，继续冻干60分钟。
本发明还提供一种上述外敷组合物的应用，所述外敷组合物应用于皮肤过敏、皮肤痤疮或皮肤起痘的治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供的外敷组合物可以有效的缓解皮肤过敏症状，甚至达到完全缓解或消除；可以有效缓解痤疮、起痘症状，甚至达到完全缓解或消除；
2.人体对免疫细胞外泌体提取物的排异性低，因此比药物具有更高的安全性；
3.通过对免疫细胞外泌体的合理、有效的应用，提高了资源利用率，防止资源浪费；
4.本发明提供的冻干方法利于提高生物活性率、减少冻干时间、节约功耗与成本。
附图说明
图1是外泌体提取物的制备方法流程图；
图2是外敷组合物的制备方法流程图；
图3是细胞培养外泌物的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
一种外敷组合物，按重量份计，包括1-10份免疫细胞外泌体提取物、0.1-5份芦苇提取物、0.5-5份透明质酸钠、0.1-2份组氨酸、0.5-2份柠檬酸盐、1-5份甘油、1-10份纳米脂质体和0.05-0.2份海参皂甙。
其中，免疫细胞外泌体提取物中含有白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、穿孔素可以有效的消灭清除病原体或异源性物质；芦苇提取物保护本发明的有效成分，避免在空气中氧化和失活，并且起到抑菌作用；透明质酸钠在皮肤外表形成薄膜，为有效成分提供附着场所，同时其吸湿性为组合物中的有效成分提供了良好的溶解环境；纳米脂质体提高组织相容性，使有效成分容易渗入皮肤发挥作用，同时纳米脂质体可以包埋有效成分，防止有效成分氧化，起到保护作用；渗入皮肤后，海参皂甙对皮肤的刺激，使皮肤对外泌体提取物的应答更加迅速，从而提高有效成分的功效；柠檬酸盐、组氨酸和甘油在组合物加工或制备过程中为外泌体提取物的活性提供了良好的保护作用。
本发明提供的外敷组合物可以有效的缓解皮肤过敏症状，甚至达到完全缓解或消除；可以有效缓解痤疮、起痘症状，甚至达到完全缓解或消除。人体对免疫细胞外泌体提取物的排异性低，因此具有更高的安全性。通过对免疫细胞外泌体的合理、有效的应用，提高了资源利用率，防止资源浪费。
其中，如图1所示，免疫细胞外泌体提取物的制备方法包括：
步骤101：获取淋巴细胞。先获取脐带血或外周血，通过淋巴细胞分离液获取淋巴细胞。在一个具体的实施例中，获取淋巴细胞的方法：脐带血或外周血按1：1的比例加入到淋巴细胞分离液中，3000r/min慢升慢降离心20min，离心后，取中间白膜层；白膜层用生理盐水洗涤后，3000r/min离心10min，取沉淀，生理盐水再次洗涤沉淀后，1200r/min离心10min，取沉淀，获得淋巴细胞。
步骤102：培养所获取的淋巴细胞并诱导淋巴细胞转化为免疫细胞。通过淋巴细胞增殖培养提高细胞密度，并通过细胞因子的诱导，使淋巴细胞转化为免疫细胞。在一个具体实施例中，将淋巴细胞进行增殖培养并使淋巴细胞转化为免疫细胞的方法：用X-VIVO培养基重悬淋巴细胞，将淋巴细胞的密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml，添加GM-CSF 100ng/ml、IFN-γ200ng/ml和TNF-α20ng/ml进行培养；第二天，添加IL-1 100ng/ml、IL-4 100ng/ml、IL-12 100ng/ml和IL-2 1000UI/ml，其中细胞因子的浓度指在培养液里的终浓度；第三天到第七天，通过添加含有IL-2 1000UI/ml和IL-15 1000UI/ml的X-VIVO培养基将细胞密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml；第七天到第十四天，每天通过添加培养基将细胞密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml。通过添加刺激因子刺激淋巴细胞生长和分化，提高免疫细胞外泌体的分泌量。
步骤103：获取免疫细胞外泌液。免疫细胞在培养过程中，分泌大量的白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和穿孔素等活性成分。在一个具体实施例中，获取免疫细胞外泌液的方法包括：将第十四天的免疫细胞培养液300g-400g离心15分钟-20分钟，取上清液；还可以将上述的上清液在2000g-3000g离心40-60min，取上清得到外泌液，通过离心进一步去除上清液中的杂质。
步骤104：浓缩所述外泌液。活性成分的原始含量低，通过浓缩的方式提高外泌体的浓度。在一个具体实施例中，浓缩所述外泌液的方法包括：将外泌液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液，起到过滤杂质的作用，防止超滤过程中滤膜堵塞；通过超滤装置超滤过滤液，超滤采用的滤膜孔径为30-60nm。
步骤105：置换外泌液的缓冲液。将外沁液的培养液置换为缓冲液。置换外泌液的方法包括：超滤完毕后，加入PBS缓冲液并再次超滤，重复3-5次；用PBS缓冲液洗涤所述滤膜，取洗涤液。将外泌体溶解在洗涤液里。
还可以包括步骤106：将洗涤液干燥成固体或高浓度溶液。可以采用冷冻干燥的方式。
取第3天细胞培养外泌物和第14天细胞培养外泌物进行电泳检测外泌体蛋白，如图3所示，条带1为第14天细胞培养外泌物，条带2为第3天细胞培养外泌物，条带M为参照物，其中第14天的蛋白含量和蛋白种类明显增多。经流式细胞术检测，第14天免疫细胞表面抗体CD4+的含量从38.97％上升到47.49％；外泌液中的IL-17、IFN-gama和IL-4含量明显增多。
如图2所示，本发明的外敷组合物的制备方法包括：
步骤201：按比例配制各组份。其中免疫细胞外泌体提取物的份量指免疫细胞外泌体提取物的固体含量，可以称量免疫细胞外泌体提取物的冻干物，也可以通过测量外泌体提取物的蛋白浓度，以蛋白浓度乘以体积计算质量。
步骤202：各组份加入水后搅拌均匀。在一个具体实施例中，各组分加入水后，在高剪切混合乳化机内乳化，乳化条件为2000rpm、30分钟。
步骤203：将混合物在低温低压下蒸发。将乳化后的混合物冷却至4-8度，在4-8度、真空度100毫巴的条件下，蒸发20分钟。低温低压下，混合物沸腾蒸发，在一个具体实施例中，蒸发80％的水份，既保证了外泌体的活性，同时降低冷冻过程中，水结晶产生的冰晶对有效成分的破坏，从而提高有效成分的利用率。
步骤204：将低温低压蒸发后的混合物冷冻并冻干。具体的，将混合物在液氮下速冻，在1秒内-196度液氮使混合物瞬间冷冻休眠，冷冻的混合物在低温冻干箱内冷冻干燥成固体，冻干条件为-110度，1-4小时。在一个具体实施例中，混合物的冻干方法包括：所述低温冻干箱的冷阱温度为-40度，真空度为0.1毫巴，板层温度：-20度，混合物在-110度冻干15分钟后，板层温度由-20度升至8度，继续冻干60分钟。冷阱用于冷凝冷冻干燥所升华的水蒸汽，混和物的容器放置在板层上，通过板层提高混和物的温度，使水份更易蒸发或升华，从而减少冻干时间、节约功耗和节约成本；蒸发和冻干条件始终维持低温，利于保护有效成份，防止有效成分降解或破坏；与传统冻干条件相比，可以将生物活性利用率提升50％以上。
柠檬酸盐、组氨酸和甘油在冻干过程中为外泌体的活性提供了良好的保护作用。
实施例1
取12.5g免疫细胞外泌体提取物、5g芦苇提取物、12.5g透明质酸钠、2.5g组氨酸、2.25g柠檬酸盐、3.75g甘油、12.5g纳米脂质体和0.5g海参皂甙,加水至500g。经乳化、脱气和搅拌均匀后，每剂取25ml，经冷冻和冻干后，得到固体组合物A。
寻找适用者20名，其中10人为敏感肌肤，有过敏症状；10人为脸上起痘或有痤疮。
实施例2
取20g免疫细胞外泌体提取物、2.5g份芦苇提取物、10g份透明质酸钠、5g组氨酸、2.25g柠檬酸盐、5g甘油、12.5g纳米脂质体和0.25g海参皂甙，加水至500g。经乳化、脱气和搅拌均匀后，每剂取25ml，经冷冻和冻干后，得到固体组合物B。
寻找适用者20名，其中10人为敏感肌肤，有过敏症状；10人为脸上起痘或有痤疮。
实施例3
25g免疫细胞外泌体提取物、3.75g芦苇提取物、7.5g透明质酸钠、2.5g组氨酸、2.25g柠檬酸盐、3.75g甘油、7.5g纳米脂质体和0.125g海参皂甙，加水至500g。经乳化、脱气和搅拌均匀后，每剂取25ml，经冷冻和冻干后，得到固体组合物C。
寻找适用者20名，其中10人为敏感肌肤，有过敏症状；10人为脸上起痘或有痤疮。
实施例4
25g免疫细胞外泌体提取物、2.5g芦苇提取物、12.5g透明质酸钠、5g组氨酸、2.25g柠檬酸盐、5g甘油、12.5g纳米脂质体、0.5g海参皂甙，加水至500g。经乳化、脱气和搅拌均匀后，每剂取25ml，经冷冻和冻干后，得到固体组合物D。
寻找适用者20名，其中10人为敏感肌肤，有过敏症状；10人为脸上起痘或有痤疮。
实施例1-4中的组合物的皮肤测试，适用者每天取1-2剂组合物敷在皮肤上，测试结果如下表：
Figure BDA0002547710060000071
从表中可以得出组合物D的测试总有效率最高，为最优组合物。下面以组合物D进一步测试。
实施例5
刘某在使用本发明组合物D前手面过敏瘙痒，使用组合物D后12小时皮肤过敏瘙痒减轻，24小时后症状情况明显减轻，骚痒症状消失。
实施例6
陈某使用组合物D前皮肤过敏瘙痒红肿，持续每天使用组合物D，7天后症状消失。
实施例7
王某使用组合物D前皮肤过敏起痘皮肤暗淡，持续每天使用组合物D，15天后皮肤过敏起痘症状缓解，皮肤有光泽。
从以上数据得出，本发明可以有效的缓解皮肤过敏症状，甚至达到完全缓解或消除；可以有效缓解痤疮、起痘症状，甚至达到完全缓解或消除。
实施例8
在上述实施例的基础上，扩大了受试人群。其中，皮肤过敏症状受试200人，结果如下表：
Figure BDA0002547710060000081
15天有效率达90％。
其中，皮肤痤疮或起痘受试200人，结果如下表：
Figure BDA0002547710060000082
15天有效率达81％。
因此本发明提供的外敷组合物可以应用于皮肤过敏、皮肤痤疮或皮肤起痘的治疗。
具体应用中，本发明的外敷组合物可以制成外用散剂、软膏剂或贴剂。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种外敷组合物，其特征在于，按重量份计，由以下成分组成：1-10份免疫细胞外泌体提取物、0.1-5份芦苇提取物、0.5-5份透明质酸钠、0.1-2份组氨酸、0.5-2份柠檬酸盐、1-5份甘油、1-10份纳米脂质体和0.05-0.2份海参皂甙。
2.根据权利要求1所述的外敷组合物，其特征在于，由以下成分组成：5份免疫细胞外泌体提取物、2份芦苇提取物、5份透明质酸钠、1份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、1.5份甘油、5份纳米脂质体和0.2份海参皂甙。
3.根据权利要求1所述的外敷组合物，其特征在于，由以下成分组成：8份免疫细胞外泌体提取物、1份芦苇提取物、4份透明质酸钠、2份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、2份甘油、5份纳米脂质体和0.1份海参皂甙。
4.根据权利要求1所述的外敷组合物，其特征在于，由以下成分组成：10份免疫细胞外泌体提取物、1.5份芦苇提取物、3份透明质酸钠、1份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、1.5份甘油、3份纳米脂质体和0.05份海参皂甙。
5.根据权利要求1所述的外敷组合物，其特征在于，由以下成分组成：10份免疫细胞外泌体提取物、1份芦苇提取物、5份透明质酸钠、2份组氨酸、0.9份柠檬酸盐、2份甘油、5份纳米脂质体和0.2份海参皂甙。
6.根据权利要求1-5任一项所述的外敷组合物，其特征在于，所述免疫细胞外泌体提取物的制备方法包括：
获取淋巴细胞；
培养所获取的淋巴细胞并诱导淋巴细胞转化为免疫细胞；
获取免疫细胞的外泌液；
浓缩所述外泌液；
置换外泌液的缓冲液。
7.根据权利要求6所述的外敷组合物，其特征在于，所述免疫细胞外泌体提取物的制备方法包括：
获取脐带血或外周血，通过淋巴细胞分离液获取淋巴细胞；
将获取的淋巴细胞用X-VIVO培养基重悬，将淋巴细胞的密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml，添加GM-CSF 100ng/ml、IFN-γ200ng/ml和TNF-α20ng/ml进行培养，第二天添加IL-1100ng/ml、IL-4 100ng/ml、IL-12 100ng/ml、IL-2 1000UI/ml；
第三天到第七天，每天通过添加含有IL-2 1000UI/ml和IL-15 1000UI/ml的X-VIVO培养基将细胞密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml；
第七天到第十四天，每天通过添加培养基将细胞密度调整至1*106/ml-1.5*106/ml；
将第十四天的免疫细胞培养液300g-400g离心15分钟-20分钟，取上清液，将上清液在2000g-3000g继续离心40-60min，取上清得到外泌液；
将外泌液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液，过滤液经滤膜孔径为30-60nm的超滤装置进行浓缩；
超滤装置内加入PBS缓冲液，进次超滤，重复3-5次；
用PBS缓冲液洗涤所述超滤装置的滤膜，取洗涤液。
8.根据权利要求1-5任一项所述的外敷组合物，其特征在于，所述外敷组合物的制备方法包括：
按比例配制各组份；
各组份加入水后，搅拌均匀；
将混合物在低温低压下蒸发；
将低温低压蒸发后的混合物冷冻并冻干。
9.根据权利要求8所述的外敷组合物，其特征在于，混合物低温低压下蒸发的方法：在4-8度低温、真空度100毫巴的条件下，蒸发20分钟；
冻干混合物冷冻并冻干的方法包括：将混合物在液氮下速冻，将冷冻后的混合物在低温冻干箱内冷冻干燥成固体，冷冻干燥的方法包括：低温冻干箱的冷阱温度为-40度，真空度为0.1毫巴，板层温度为-20度，混合物在-110度冻干15分钟后，板层温度由-20度升至8度，继续冻干60分钟。
10.一种权利要求1-5任一项所述外敷组合物的应用，其特征在于，所述外敷组合物用于制备减轻或缓解皮肤过敏、皮肤痤疮或皮肤起痘的药物。
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