CN111635863A - 低温绿球藻的培养液、低温绿球藻的培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于藻类培养技术领域，公开了一种低温绿球藻的培养液、低温绿球藻的培养方法及应用，首先按下述组分配制培养液：自来水中添加无水葡萄糖、氯化铵、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙、硼酸、氯化锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、硝酸钴；然后通过配置的培养液对绿球藻进行培养。本发明培养得到的每毫升藻液中活藻数量多，培养时间短，能在初春低温条件下满足水产养殖动物饵料的需求，并能快速降低水产畜禽养殖水体、湖泊、河流中氨氮、亚硝酸盐、磷的含量，吸附重金属；增加水体溶氧，能快速增强水体自净能力，填补了初春低温微生物净化水质的市场产品的空白。
Description
技术领域
本发明属于藻类培养技术领域，尤其涉及一种低温绿球藻的培养液、低温绿球藻的培养方法及应用。
背景技术
目前，藻类是水体物质循环和能量循环的基础，藻类能在光照的条件下吸收空气中的二氧化碳，利用水体中可溶性的氨氮、亚硝酸盐、磷、重金属进行繁殖代谢，并释放出氧气，降低水体氨氮、亚硝酸盐、磷、重金属的含量，是水体自净的生物基础。同时藻类本身营养丰富，在水产养殖中能为水产动物苗种提供优质的生物饵料，并能降解水体有害的氨氮、亚硝酸盐、重金属，增加水体溶解氧，从而净化水质，促进水产动物摄食和生长。
随着现代水产养殖水平的提高，种苗放养密度加大，在年度水产养殖前期，由于自然养殖水体水温低藻类生长繁殖慢，为养殖水体针对性补充有益的低温绿球藻，可以为种苗补充大量的藻类生物饵料，促进水产动物苗种快速生长，提高养殖效益。
另外随着社会经济发展加快和人民生活水平的提高以及城镇化的快速发展，湖泊、河流和生活污水的富营养化日益严重，生物需氧量、总氮、总磷是水体污染的主要超标指标，而藻类是分解利用和降低水体有机质(生物需氧量)、总氮、总磷的简单快速方法。畜禽养殖废水也是目前水体污染的重要源头，养殖废水的主要污染物是生物需氧量、总氮，而这些污染物也是藻类生长利用的必需营养，主动补充绿球藻来降解水畜禽养殖废水中有害物质的原位原生态修复方式是未来畜禽养殖废水处理的发展方向。
绿球藻是一种淡水的单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、绿球藻科、绿球藻属，目前对绿球藻的研究不多。
绿球藻含高蛋白，营养丰富，是水产养殖动物的优质饵料。绿球藻存在于天然水体，在水温12-15℃开始缓慢生长，是自然水体较低温度下最先开始生长的绿藻。能分解利用水体中的氨氮、亚硝酸盐、磷，吸附水体中的有害重金属，同时利用光合作用增加水体溶解氧，是早春水产养殖中水生动物的优质生物饵料和养殖水体净化器；并能对湖泊、河流、畜禽养殖废水中低温期的氨氮、亚硝酸盐、磷进行快速降解，对水体中金属进行吸附。
目前，对绿球藻高密度快速培养研究很少。按传统普通的培养方式，(由于温度低、藻类生长慢，)培养时间长(15-30天一批)、藻液中活藻数量少、藻体浓度低，藻液内杂菌多，不能满足水产养殖动物优质饵料的需求，以及对低温期养殖水体有害物质氨氮、亚硝酸盐、磷、重金属等降解和吸附的需求；也不能对畜禽养殖废水、湖泊、河流水体进行净化；满足不了藻类促进水体能量循环和物质循环的要求。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：采用普通的培养方式对绿球藻进行培养时，在低温时，藻类繁殖生长速度慢，对水体氨氮、亚硝酸盐、磷、重金属降解较慢，影响水体自净速度。
解决以上问题及缺陷的难度为：由于藻类普通培养的方式，藻种不纯，其中含有杂菌，杂菌容易争夺培养液中的养分，培养周期长，培养好的藻液内活藻浓度低(每毫升藻液含活藻百万个左右)。
解决以上问题及缺陷的意义为：(通过使用本发明培养出大量高含量的适应低温水体生长繁殖的绿球藻，投入水体中增加有益绿球藻含量，)快速降低水产畜禽养殖水体、湖泊、河流中氨氮、亚硝酸盐、磷的含量，吸附重金属；增加水体溶氧，能快速增强水体自净能力，填补初春低温微生物净化水质的市场产品的空白。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种低温绿球藻的培养液、低温绿球藻的培养方法及应用。
本发明是这样实现的，一种低温绿球藻的培养液，每升自来水中添加无水葡萄糖0.05-1g、氯化铵0.1-1g、磷酸氢二钾0.02-0.2g、七水硫酸镁0.01-0.1g、氯化钠0.01-0.1g、硫酸亚铁0.05-0.1g、氯化钙0.01-0.1g、硼酸0.0001-0.001g、氯化锰0.0001-0.001g、硫酸锌0.0001-0.001g、钼酸钠0.0001-0.001g、硫酸铜0.0001-0.001g和硝酸钴0.0001-0.001g。
本发明的另一目的提供一种低温绿球藻的培养方法，包括以下步骤：
步骤一，配制培养液
按下述组分配制培养液：每升自来水中添加无水葡萄糖0.05-1g、氯化铵0.1-1g、磷酸氢二钾0.02-0.2g、七水硫酸镁0.01-0.1g、氯化钠0.01-0.1g、硫酸亚铁0.05-0.1g、氯化钙0.01-0.1g、硼酸0.0001-0.001g、氯化锰0.0001-0.001g、硫酸锌0.0001-0.001g、钼酸钠0.0001-0.001g、硫酸铜0.0001-0.001g、硝酸钴0.0001-0.001g，混合均匀后调节pH＝7.0，即为1L培养液；
步骤二，绿球藻的培养
a取5mL培养液置于玻璃试管中，在118-125℃下高温杀菌12-30min，冷却至室温后，挑取无菌绿球藻藻种10-20株，在无菌条件下接入培养液中，在12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下培养22-26h；
本藻株在12-25℃能快速生长，但在25℃生长最快。本发明的目的是在25℃条件下大量培养藻液，再投放至12-15℃的低温水体繁殖，满足水产养殖动物饵料的需求，并能快速降低水产畜禽养殖水体、湖泊、河流中氨氮、亚硝酸盐、磷的含量，吸附重金属；增加水体溶氧，能快速增强水体自净能力。
b再取200mL培养液置于玻璃三角瓶中，在118-125℃下高温杀菌12-20min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的5mL绿球藻种接入培养液中，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下，通入无菌空气培养22-26h；
c再配制5L培养液置于玻璃瓶中，在118-125℃下高温杀菌25-35min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的200mL绿球藻种接入培养液中，在12-15℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下，通入无菌空气培养16-20h；
d配制800L培养液置于含内置光源发酵罐中，在118-125℃下高温杀菌25-35min，冷却至20℃后，在无菌条件下接入4第步骤c中培养好的5L绿球藻种，搅拌20-30min，混合均匀后，在12-15℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下，通入无菌空气培养22-26h，得到淡绿色的藻液，pH＝7.0-7.5，藻液中有少量藻体沉淀。
本发明的另一目的在于提供一种利所述低温绿球藻的培养液构建的新水产养殖体系。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明是从天然水体富集培养后无菌平板分离获得，不含杂菌，因此生长繁殖(培养)过程不受杂菌干扰，同时培养液中添加了葡萄糖，生长速度比常规培养快。本发明培养出的绿球藻每毫升藻液中含活藻高达一个亿左右、藻体浓度高，每级扩大培养时间只需24-48h左右，能在低温条件下满足水产养殖动物饵料的需求，可用于快速降低水产畜禽养殖水体、湖泊、河流中氨氮、亚硝酸盐、磷的含量，吸附重金属；增加水体溶氧，能快速增强水体自净能力。该应用扩大了绿球藻的应用领域，填补了低温微生物净化水质的市场产品的空白。
本发明中所述绿球藻藻种是从天然水体富集培养后无菌平板分离(自行)获得，经显微镜下形态鉴别分类学上属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、绿球藻科、绿球藻属。
对比的技术效果或者实验效果。
A、15℃培养液温度下与小球藻生长速度对照结果
方案：取池塘水样1升，沸煮冷却，加入尿素0.05克，分装1升三角瓶各500毫升，分别各加入1毫升小球藻液和低温绿球藻液，15℃1000-1500Lux光照下净置培养48小时，检测两种藻类增长速度：
结论：低温绿球藻同等条件下在15℃水温生长繁殖比小球藻快；
B、低温绿球藻在无糖培养液常规带菌培养和含糖培养液无菌生长速度对照：
方案：每升自来水中氯化铵1g、磷酸氢二钾0.02g、七水硫酸镁0.1g、氯化钠0.01g、硫酸亚铁0.05g、氯化钙0.01g、硼酸0.0001g、氯化锰0.0001g、硫酸锌0.0001g、钼酸钠0.0001g、硫酸铜0.0001g、硝酸钴0.0001g的培养液为基准，另以添加葡萄糖0.05-1g/升灭菌后的培养液作对照，各500毫升培养液，同时加入1毫升无菌低温绿球藻藻种，一个做常规光照静置培养，一个做无菌光照静置培养。25℃、1000-1500Lux光照下净置培养48小时，检测两种培养条件绿球藻增长速度：
| 初始含量 | 48小时后含量 | 净增长 | |
| 常规带菌培养 | 10个/毫升 | 33个/毫升 | 2.3倍 |
| 无菌条件培养 | 10个/毫升 | 122个/毫升 | 11.2倍 |
结论：低温绿球藻在同等条件下在含糖培养液无菌培养方式生长繁殖比常规带菌培养方式快很多。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的低温绿球藻的培养方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种低温绿球藻的培养液、低温绿球藻的培养方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供一种低温绿球藻的培养液，每升自来水中添加无水葡萄糖0.05-1g、氯化铵0.1-1g、磷酸氢二钾0.02-0.2g、七水硫酸镁0.01-0.1g、氯化钠0.01-0.1g、硫酸亚铁0.05-0.1g、氯化钙0.01-0.1g、硼酸0.0001-0.001g、氯化锰0.0001-0.001g、硫酸锌0.0001-0.001g、钼酸钠0.0001-0.001g、硫酸铜0.0001-0.001g和硝酸钴0.0001-0.001g。
如图1所示，本发明实施例提供的低温绿球藻的培养方法具体包括：
S101，按下述组分配制培养液：每升自来水中添加无水葡萄糖0.05-1g、氯化铵0.1-1g、磷酸氢二钾0.02-0.2g、七水硫酸镁0.01-0.1g、氯化钠0.01-0.1g、硫酸亚铁0.05-0.1g、氯化钙0.01-0.1g、硼酸0.0001-0.001g、氯化锰0.0001-0.001g、硫酸锌0.0001-0.001g、钼酸钠0.0001-0.001g、硫酸铜0.0001-0.001g、硝酸钴0.0001-0.001g，混合均匀后即为1L培养液。
S102，取5mL培养液置于玻璃试管中，高温杀菌，冷却至室温后，挑取无菌绿球藻藻种10-20株，在无菌条件下接入培养液中，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下进行光照培养，22-26h得到绿球藻种。
S103，再取200mL培养液置于玻璃三角瓶中，高温杀菌，冷却至室温后，在无菌条件下将步骤二中培养好的5mL绿球藻种无菌接入培养液中，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下通入无菌空气进行光照培养，22-26h得到绿球藻液。
S104，再配制5L培养液置于玻璃瓶中，高温杀菌，冷却至室温后，在无菌条件下将步骤三中培养好的200mL绿球藻种接入培养液中，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下通入无菌空气进行光照培养，22-26h得到绿球藻液。
S105，配制800L培养液置于含内置光源发酵罐中，高温杀菌，冷却至20℃后，在无菌条件下接入步骤四中培养好的5L绿球藻种，搅拌20-30min，混合均匀后，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下通入无菌空气进行光照培养，22-26h得到绿球藻液。，pH＝7.0-7.5，藻液中有少量藻体沉淀。
步骤S102进行光照培养的温度为12-25℃。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行说明。
实施例1
本实施例的一种绿球藻的培养方法，包括以下步骤：
①配制培养液
按下述组分配制培养液：每升自来水中添加无水葡萄糖0.05g、氯化铵0.1g、磷酸氢二钾0.02g、七水硫酸镁0.01g、氯化钠0.01g、硫酸亚铁0.05g、氯化钙0.01g、硼酸0.0001g、氯化锰0.0001g、硫酸锌0.0001g、钼酸钠0.0001g、硫酸铜0.0001g、硝酸钴0.0001g，混合均匀后调节pH＝7.0，即为1L培养液；
②绿球藻的培养
a取5mL培养液置于玻璃试管中，在118℃下高温杀菌12min，冷却至室温后，挑取无菌绿球藻藻种10株，在无菌条件下接入培养液中，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下培养22h；
b再取200mL培养液置于玻璃三角瓶中，在118℃下高温杀菌12min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的5mL绿球藻种接入培养液中，通入无菌空气，12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下培养22h；
c再配制5L培养液置于玻璃瓶中，在118℃下高温杀菌25min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的200mL绿球藻种接入培养液中，在12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下通入无菌空气培养22-26h；
d配制800L培养液置于含内置光源发酵罐中，在118℃下高温杀菌25min，冷却至20℃后，在无菌条件下接入步骤c中培养好的5L绿球藻种，搅拌20min，混合均匀后，在12-25℃(优选25℃)、1000-1500Lux光照下通入无菌空气培养22-26h；得到淡绿色的藻液，pH＝7.0-7.5，藻液中有少量藻体沉淀。
实施例2
本实施例的一种绿球藻的培养方法，包括以下步骤：
①配制培养液
按下述组分配制培养液：每升自来水中添加无水葡萄糖0.55g、氯化铵0.5g、磷酸氢二钾0.1g、七水硫酸镁0.05g、氯化钠0.05g、硫酸亚铁0.55g、氯化钙0.05g、硼酸0.0005g、氯化锰0.0005g、硫酸锌0.0005g、钼酸钠0.0005g、硫酸铜0.0005g、硝酸钴0.0005g，混合均匀后调节pH＝7.0，即为1L培养液；
②绿球藻的培养
a取5mL培养液置于玻璃试管中，在121℃下高温杀菌21min，冷却至室温后，挑取无菌绿球藻藻种15株，在无菌条件下接入培养液中，在25℃、1250Lux光照下培养24h；
b再取200mL培养液置于玻璃三角瓶中，在121℃下高温杀菌16min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的5mL绿球藻种接入培养液中，在25℃、1250Lux光照下，通入无菌空气培养24h；
c再配制5L培养液置于玻璃瓶中，在121℃下高温杀菌30min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的200mL绿球藻种接入培养液中，在25℃、1250Lux光照下，通入无菌空气培养18h；
d配制800L培养液置于含内置光源发酵罐中，在121℃下高温杀菌30min，冷却至20℃后，在无菌条件下接入步骤c中培养好的5L绿球藻种，搅拌25min，混合均匀后，在25℃、1250Lux光照下，通入无菌空气培养24h，得到淡绿色的藻液，pH＝7.0-7.5，藻液中有少量藻体沉淀。
实施例3
本实施例的一种绿球藻的培养方法，包括以下步骤：
①配制培养液
按下述组分配制培养液：每升自来水中添加无水葡萄糖1g、氯化铵1g、磷酸氢二钾0.2g、七水硫酸镁0.1g、氯化钠0.1g、硫酸亚铁0.1g、氯化钙0.1g、硼酸0.001g、氯化锰0.001g、硫酸锌0.001g、钼酸钠0.001g、硫酸铜0.001g、硝酸钴0.001g，混合均匀后调节pH＝7.0，即为1L培养液；
②绿球藻的培养
a取5mL培养液置于玻璃试管中，在125℃下高温杀菌30min，冷却至室温后，挑取无菌绿球藻藻种20株，在无菌条件下接入培养液中，在15℃、1500Lux光照下培养26h；
b再取200mL培养液置于玻璃三角瓶中，在125℃下高温杀菌20min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的5mL绿球藻种接入培养液中，在25℃、1500Lux光照下，通入无菌空气培养26h；
c再配制5L培养液置于玻璃瓶中，在125℃下高温杀菌35min，冷却至室温后，在无菌条件下将培养好的200mL绿球藻种接入培养液中，在25℃、1500Lux光照下，通入无菌空气培养20h；
d配制800L培养液置于含内置光源发酵罐中，在125℃下高温杀菌35min，冷却至20℃后，在无菌条件下接入步骤c中培养好的5L绿球藻种，搅拌30min，混合均匀后，在25℃、1500Lux光照下，通入无菌空气培养26h，得到淡绿色的藻液，pH＝7.0-7.5，藻液中有少量藻体沉淀。
实施例4
为了验证极绿球藻在低温条件下对水样中氨氮含量的降解效果，于2020年5月12日湖北省黄石市大冶湖北岸水样4L，测得水体中氨氮含量(折算为氯化铵含量)为125mg/L，此时水体中氨氮含量超高，远远大于三类水质要求，将水样分装至6个500mL透明玻璃三角瓶中，每个三角瓶分别装水样200mL，并分别进行编号#1、#2、#3、#4、#5、#6，#1为对照组，#2中添加普通光合细菌液1mL、#3中添加脱氮菌液1mL、#4中添加1mL实施例1制备的绿球藻藻液1mL、#5中添加1mL实施例2制备的绿球藻藻液1mL、#6中添加1mL实施例3制备的绿球藻种藻液1mL，将6个三角瓶均置于室内窗边光照。
2020年5月15日14时分别对6个三角瓶的水样中氨氮含量进行检测，试验结果见下表1。
表1添加不同的藻液对水样中氨氮含量的影响
从上表1可以看出，普通光合细菌、脱氮菌和绿球藻均能达到降低水体氨氮含量的作用，其中绿球藻在降低水体氨氮含量的效果最明显；脱氮菌次之；普通光合细菌最慢。这是由于细菌降解氨氮的过程是个耗氧过程，需要消耗环境中大量的碳源，是一个能量消耗的过程，由于水体中碳源不足，严重影响了氨氮的降解过程；而绿球藻低温条件下能利用光能和空气中的二氧化碳进行光合作用，迅速吸收利用水体氨氮，从而降低了水体中氨氮的含量。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种低温绿球藻的培养液，其特征在于，所述低温绿球藻的培养液每升自来水中添加无水葡萄糖0.05-1g、氯化铵0.1-1g、磷酸氢二钾0.02-0.2g、七水硫酸镁0.01-0.1g、氯化钠0.01-0.1g、硫酸亚铁0.05-0.1g、氯化钙0.01-0.1g、硼酸0.0001-0.001g、氯化锰0.0001-0.001g、硫酸锌0.0001-0.001g、钼酸钠0.0001-0.001g、硫酸铜0.0001-0.001g和硝酸钴0.0001-0.001g。
2.一种利用权利要求1所述低温绿球藻的培养液的低温绿球藻的培养方法，其特征在于，所述低温绿球藻的培养方法包括以下步骤：
步骤一，按下述组分配制培养液：每升自来水中添加无水葡萄糖0.05-1g、氯化铵0.1-1g、磷酸氢二钾0.02-0.2g、七水硫酸镁0.01-0.1g、氯化钠0.01-0.1g、硫酸亚铁0.05-0.1g、氯化钙0.01-0.1g、硼酸0.0001-0.001g、氯化锰0.0001-0.001g、硫酸锌0.0001-0.001g、钼酸钠0.0001-0.001g、硫酸铜0.0001-0.001g、硝酸钴0.0001-0.001g，混合均匀后为1L培养液；
步骤二，取5mL培养液置于玻璃试管中，高温杀菌，冷却至室温后，挑取无菌绿球藻藻种10-20株，在无菌条件下接入培养液中，12～25℃进行光照培养，得到绿球藻种；
步骤三，再取200mL培养液置于玻璃三角瓶中，高温杀菌，冷却至室温后，在无菌条件下将步骤二中培养好的5mL绿球藻种接入培养液中，通入无菌空气进行25℃光照培养；
步骤四，再配制5L培养液置于玻璃瓶中，高温杀菌，冷却至室温后，在无菌条件下将步骤三中培养好的200mL绿球藻种接入培养液中，通入无菌空气进行25℃光照培养；
步骤五，配制800L培养液置于含内置光源发酵罐中，高温杀菌，冷却至20℃后，在无菌条件下接入步骤四中培养好的5L绿球藻种，搅拌20-30min，混合均匀后，通入无菌空气进行12～25℃光照培养，得到淡绿色的藻液，pH＝7.0-7.5，藻液中有少量藻体沉淀。
3.如权利要求2所述的低温绿球藻的培养方法，其特征在于，步骤一中，混合均匀后调节pH＝7.0。
4.如权利要求2所述的低温绿球藻的培养方法，其特征在于，步骤二中，所述高温杀菌具体为在118-125℃下高温杀菌12-30min，所述光照培养具体为在12～25℃、1000-1500Lux光照下培养22-26h。
5.如权利要求2所述的低温绿球藻的培养方法，其特征在于，步骤三中，所述高温杀菌具体为在118-125℃下高温杀菌12-20min，所述光照培养具体为在12～25℃、1000-1500Lux光照下，通入无菌空气培养22-26h。
6.如权利要求2所述的低温绿球藻的培养方法，其特征在于，步骤四中，所述高温杀菌具体为在118-125℃下高温杀菌25-35min，所述光照培养具体为在12～25℃、1000-1500Lux光照下，通入无菌空气培养16-20h。
7.如权利要求2所述的低温绿球藻的培养方法，其特征在于，步骤五中，所述高温杀菌具体为在118-125℃下高温杀菌25-35min，所述光照培养具体为在12～25℃、1000-1500Lux光照下，通入无菌空气培养22-26h。
8.一种利用权利要求1所述低温绿球藻的培养液构建的方水产养殖体系。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200908 |
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