CN111624085A - 一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡，该稀释装置包括稀释液加样瓶；所述稀释液加样瓶包括上下设置的第一稀释空腔和第二稀释空腔，该两个稀释空腔之间以一斜板相隔，所述第一稀释空腔的顶部设有供样本采集管插入的加样孔，所述斜板高端一侧设有一上下贯通的凹槽，所述凹槽位于所述加样孔的正下方；所述第二稀释空腔的底部设有出液口。该样本稀释装置可以将样本中抗体进行梯度高倍数稀释，避免抗体过量导致倒钩现象，适用于对大批新型冠状病毒样本的快速筛查检测；试剂卡既可以进行病毒感染患者血液中的IgM、IgG抗体的分型检测，又可以进行血液中新型冠状病毒的总抗体的检测，可提高早期感染患者检出率。

Description

一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，尤其是涉及一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡。

背景技术

在新冠病毒的早期诊断方面，目前广泛采用的是核酸类检测试剂盒，即检测病原体的核酸序列，核酸检测能够起到关键的初筛和确诊作用，但是核酸检测的阳性率和假阴性率却存在一定问题，且该方法对场地及检测人员的要求高，因此加快推进现场快速检测产品的研发和应用，从血液抗体检测入手，建立快速初筛试剂盒，尽快将核酸检测与抗体检测相结合，对提供现场批量筛查，提高鉴别诊断率具有重大意义。

微流控免疫荧光技术是结合免疫学反应原理与微流控芯片结合的一项用于体外快速诊断试剂的新型技术。该技术以其灵敏度高、分析速度快、精密度高，抗干扰能力强等特点非常适用于即时、现场分析。

该微流控芯片主要依靠抗原抗体结合进行检测，且该抗原和抗体的结合的特点具有比例性，即指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，并进行有效检测，当二者浓度不适配，则容易出现倒钩现象,造成假阴性。为使得抗原抗体浓度适配，需要对样本进行数倍的稀释。传统稀释方法步骤繁琐，多步人工稀释放大误差，且样本暴露时间长，增加传染风险。

另外，目前常用的抗体检测方法多为间接法检测血液中的IgG或IgM或将IgG/IgM进行联测，针对新型冠状病毒的临床特点，采用IgG/IgM进行联合分型检测可动态监测患者感染的过程。该方法对于早期感染患者（血液中的IgG或IgM偏低），仍然存在漏检或非特异性反应的情况。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡，该稀释装置可以将样本中抗体通过便捷的梯度高倍数稀释，避免抗体过量导致倒钩现象；且对检测人员及场所要求低，满足POCT检测的需求，适用于对大批新型冠状病毒样本的快速筛查检测；该试剂卡既可以进行病毒感染患者血液中的IgM、IgG抗体的分型检测，又可以进行血液中新型冠状病毒的总抗体的检测，可提高早期感染患者检出率。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，包括稀释液加样瓶；所述稀释液加样瓶包括上下设置的第一稀释空腔和第二稀释空腔，该两个稀释空腔之间以一斜板相隔，所述第一稀释空腔的顶部设有供样本采集管插入的加样孔，所述斜板高端一侧设有一上下贯通的凹槽，所述凹槽位于所述加样孔的正下方；所述第二稀释空腔的底部设有出液口；所述加样孔的顶部、凹槽的底部及出液口的底部均塑封有封口膜。

进一步，所述样本采集管包括气囊和吸管，所述吸管底部为尖凸结构。

进一步，所述吸管上在其长度方向设有两个卡扣，所述加样孔边沿处设有用以卡住所述卡扣的卡槽，所述卡槽与卡扣的结构相适配。

进一步，当位于下部的卡扣与卡槽相配合时，所述吸管的底端位于第一稀释空腔内；当位于上部的卡扣与卡槽想配合时，所述吸管的底端位于第二稀释空腔内。

进一步，所述第二稀释空腔的下部为倒锥形结构。

进一步，所述出液口为相对于该倒锥形结构向下突出的管状结构，该管状结构的顶部或内部设有过滤件。

进一步，所述过滤件为过滤网或过滤棉塞。

进一步，所述气囊与第一卡扣之间卡接有手柄。

进一步，所述封口膜为易刺破的铝膜、塑料膜或橡胶膜。

本发明还在于公开一种与上述稀释装置配合使用的试剂卡，试剂卡的加样部设有用以戳破所述封口膜刺凸结构，该试剂卡的检测区包括包被有抗新型冠状病毒IgM抗体的检测位点、包被有抗新型冠状病毒IgG抗体的检测位点、包被有特异性识别新型冠状病毒总抗体的抗原的检测位点。

进一步，所述试剂卡为微流控芯片。

相对于现有技术，本发明至少具有以下优势：

（1）该稀释装置可以将新型冠状病毒样本中抗体通过便捷的梯度高倍数稀释，避免抗体过量导致倒钩现象；且对检测人员及场所要求低，检测速度快，重复性好，满足POCT现场需求，适用于对大批新型冠状病毒样本的快速筛查检测；

（2）相对传统试剂盒的一步稀释法，该稀释装置可通过少量稀释液达到较大倍数稀释，降低大量稀释液的运输成本；

（3）本稀释装置可以通过一步取样达到梯度稀释的目的，与多步取样稀释法相比，降低过程取样造成的误差；

（4）样本采集管可实现便捷、安全取样；稀释装置及检测试剂盒均为封闭性，降低感染风险；

（5）本发明采用双抗原夹心法，既可以进行病毒感染患者血液中的IgM、IgG抗体的分型检测，又可以进行血液中新型冠状病毒的总抗体的检测，该总抗体包括IgM和IgG的总抗体，可提高早期感染患者检出率，增强检测的灵敏度及特异性，可作为新型冠状病毒的流行病学调查和临床诊断的确认和补充，对漏检及非特异性反应的鉴别诊断具有重要意义。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例中稀释液加样瓶与样本采集管配合使用状态结构示意图，第一卡扣与卡槽配合的状态；

图2为实施例中稀释液加样瓶与样本采集管配合使用状态结构示意图，第二卡扣与卡槽配合的状态；

图3为实施例中稀释液加样瓶的结构示意图；

图4为图3的局部放大结构示意图；

图5为实施例中样本采集管的结构示意图；

图6为实施例中新型冠状病毒检测用试剂卡的结构示意图；

图7为实施例中新型冠状病毒检测用试剂卡的缓冲区、荧光偶连标记区、检测区的位置关系示意图。

附图标记说明：1、稀释液加样瓶；11、第一稀释空腔；111、加样孔；112、卡槽；12、第二稀释空腔；121、出液口；122、过滤件；13、斜板；131、凹槽；2、样本采集管；21、气囊；22、吸管；221、第一卡扣；222、第二卡扣；223、手柄；3、试剂卡；31、底片；32、盖片；33、进液孔；34、微通道；35、废液槽；351、通孔；36、上凹槽；37、刺凸结构；38、缓冲区；39、荧光偶连标记区；310、检测区；310a、检测位点T1；310b、检测位点T2；310c、检测位点T3；310d、质控位点C。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

在一些实施例中，一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，包括稀释液加样瓶1；所述稀释液加样瓶1包括上下设置的第一稀释空腔11和第二稀释空腔12，该两个稀释空腔之间以一斜板13相隔，所述第一稀释空腔11的顶部设有供样本采集管2插入的加样孔111，所述斜板13上设有一上下贯通的凹槽131，所述凹槽131位于所述加样孔111的正下方；所述第二稀释空腔12的底部设有出液口121；所述加样孔111的顶部、凹槽131的底部及出液口121的底部均塑封有封口膜。

具体地，上下两个空腔中均装有稀释液450-500μl，斜板13与稀释液加样瓶1管壁呈倾斜35-45度，斜板13的斜上顶端设有竖向凹槽131结构，凹槽131中可以储存液体5-10ul；使用过程中，样本采集管2先行刺破加样孔111顶部的封口膜，进入第一稀释空腔11内进行第一次稀释，摇匀后，倾斜稀释液加样瓶1，凹槽131内装满一次稀释液；样本采集管2继而刺破凹槽131底部的封口膜，进入第二稀释空腔12内，凹槽131中的储存液体掉入第二空腔，进行二次稀释；由此实现对于样本的快速稀释。

在一些实施例中，所述样本采集管2为定量吸管22，包括气囊21和吸管22，所述吸管22底部为尖凸结构，所述气囊21与所述吸管22为一体式连接或分体式连接均可，当为一体式连接时，气囊21与吸管22均为塑料材质；当为分体式连接时，气囊21为由橡胶或乳胶类材料制成，吸管22为塑料材质制成，气囊21套设于吸管22的顶部；

操作时，可根据实际需要选定不同型号的定量吸管22，优选5-40μl。为达到定量吸液的目的，气囊21可以为定量气囊21，或者是吸管22上设有刻度线。

在一些实施例中，所述吸管22上在其长度方向设有两个卡扣，所述加样孔111处设有用以卡住所述卡扣的卡槽112，所述卡槽112与卡扣的结构相适配；具体地，该两个卡扣分别为上下设置的第一卡扣221和第二卡扣222，该两个卡扣均由若干位于同一水平面上的楔形凸起组成。当第二卡扣222与卡槽112配合时，吸管22插入第一稀释空腔11内，其底端位于凹槽131上方或位于凹槽131内，但是并不刺破凹槽131底部的封口膜；当第一卡扣221与卡槽112配合时，吸管22刺破凹槽131底面的封口膜进入第二稀释空腔12内。

进一步地，所述加样孔111的孔壁为相对稀释液加样瓶1顶面向上突出的环岛结构，该环岛结构顶部设有封口膜，该环岛结构内设有与所述卡扣适配的卡槽112。

在一些实施例中，所述第二稀释空腔12的下部为倒锥形结构，所述出液口121为相对于该倒锥形结构向下突出的管状结构，该管状结构的顶部或内部设有用于过滤样本杂质的过滤件122，以免加样后堵塞试剂卡通道；所述过滤件122为过滤网或过滤棉塞。

在一些实施例中，所述气囊21与第一卡扣221之间卡接有手柄223，因吸管22较细较滑，操作人员将吸管22插入稀释液加样瓶1时，难以寻找着力点，该手柄223的设置即增加了操作人员将吸管22插入稀释液加样瓶1时的着力点，便于操作人员操作。

在一些实施例中，所述封口膜为易刺破的铝膜、塑料膜或橡胶膜等。

在一些实施例中，该稀释装置的使用过程如下，样本采集管2采集血液样本10-50ul，利用样本采集管2底端的尖凸结构刺破稀释液加样瓶1环岛结构上覆盖的铝膜，样本采集管2插入第一稀释腔体内450-490μl的稀释液；当样本采集管2的第二卡扣222与进样口处的卡槽112结合时，吸管22与第一稀释空腔11连接成密闭腔体，挤压气囊21将血液样本加入稀释液内，轻轻晃动后，完成样本的首次10-50倍稀释；将稀释液加样瓶1向斜板13高端方向90度倾斜一次，至斜板13的凹槽131储满5-50 ul液体；

继续向下推样本采集管2，刺破斜板13上凹槽131底部的铝膜，凹槽131液体掉入第二稀释空腔的450-495μl的稀释液中；当样本采集管2的第一卡扣221与进样口处的卡槽112结合时，样本采集管与斜板结合，样本采集管2与第二稀释空腔12形成相对密闭的腔体，轻轻晃动后，完成样本的再次10-100倍稀释，稀释液加样瓶1出液口121的铝膜由试剂卡加样部设置的刺凸结构37戳破,由此实现对试剂卡的进样。

在一些实施例中，与上述样本稀释装置相适配的新型冠状病毒检测用试剂卡3包括固定连接的底片31和盖片32，底片31和盖片32可由亚克力、PMDA、透明树脂中的一种构成。

所述盖片32呈长方形，盖片32的下表面设有依次相连通的加样部、微通道34、废液槽35，所述废液槽35用以接收反应后多余的样本。废液槽35容积30-60μL，所述废液槽35顶部开设有连通废液槽35与外界的通孔351。样本从进液孔33到流入废液槽35，完成免疫反应所需最长时间为4min。

所述加样部包括开设于盖片32上表面的上凹槽36、开设于盖片32下表面的下凹槽、连通上凹槽36与下凹槽的进液孔道，所述上凹槽36的底部固设有刺凸结构37，所述刺凸结构37呈上小下大的圆台状，刺凸结构37的中心开设有贯穿刺凸结构37的进液孔33，所述进液孔33与进液孔道的中轴线重合，所述刺凸结构37底部直径与出液口121的内径一致，均为1-2mm。刺凸结构37用以加入样本的同时还可刺破稀释液加样瓶1的出液口121下端的铝膜。上凹槽36可防止样本溢出。

所述底片31呈长方形，表面光滑，底片31的上表面沿底片31的长度方向依次设有缓冲区38、荧光偶连标记区39和检测区310，所述缓冲区38位于所述进液孔33的正下方。

所述缓冲区，由含0.01%-0.05%TritonX-100的磷酸盐缓冲液，PH7.0-7.6，干燥固定于底片的一端，呈规则圆斑，加入样本后起到缓冲作用。

荧光偶连标记区，是在基片上干燥固定有特异性识别新型冠状病毒抗体的荧光偶联复合物。整体呈规则圆斑。所述荧光偶联复合物是通过荧光微球-特异性标签抗体-含标签肽段的特异性抗原1偶联形式进行的。所述荧光微球可通过表面活化的羧基端共价偶联抗体的FC端。所述荧光微球在与样本混合后，携目标抗体流动至检测区被特异性捕获且固定，通过聚集放大信号值。

所述特异性识别抗原1包括：新型冠状病毒N蛋白，S1蛋白，S-RBD蛋白，S2蛋白或S蛋白全长（S1+S2蛋白）。

所述特异性识别抗原1所含的标签肽段包括：His标签、Fc标签、Flag标签、HA标签等。

所述特异性标签抗体为抗肽段标签的单抗或多抗。

所述荧光微球：为填充荧光染料且粒径均匀的微球溶液，微球直径为100-500 nm，微球浓度2-4mg/ml。荧光微球通过活化表面羧基基团与抗体FC端的氨基共价结合。

采用上述技术方案，荧光微球首先与特异性标签抗体进行标记偶联，形成偶联溶液后加入适量比例的含标签肽段的特异性抗原1，这时标签肽段与特异性标签抗体配对偶联，特异性抗原1间接偶联至荧光微球。当样本中存在新型冠状病毒抗体时，荧光偶联复合物可特异性识别样本中新型冠状病毒总抗体，形成荧光微球-特异性标签抗体-含标签肽段的特异性抗原1-新型冠状病毒总抗体的复合物。

该试剂卡的检测区是依次固定包被在底片上的系列点阵区，包括检测位点T1、检测位点T2、检测位点T3和质控位点C（参比线），呈规则圆斑于微通道内依次排列。

所述检测位点T1,包被有抗新型冠状病毒IgM的特异性抗体。所述抗体可以为鼠源、兔源、羊源、鸡源的抗IgM单抗或多抗。所述抗体包被前与生物素进行偶联，形成生物素化抗新型冠状病毒IgM抗体。

所述检测位点T2,包被有抗新型冠状病毒IgG的特异性抗体。所述抗体可以为鼠源、兔源、羊源、鸡源的抗IgG单抗或多抗。所述抗体包被前与生物素进行偶联，形成生物素化抗新型冠状病毒IgG抗体。

所述检测位点T3,包被有特异性识别新型冠状病毒总抗体的抗原2。所述抗原2可以为新型冠状病毒N蛋白，S1蛋白，S-RBD蛋白，S2蛋白或S蛋白全长（S1+S2蛋白）。所述抗原2首先与生物素进行偶联，形成生物素-抗原2。其中，所述抗原2与抗原1为配对抗原，可识别新型冠状病毒总抗体的不同表位。

所述质控位点C,包被有与荧光偶联复合物配对的特异性新型冠状病毒抗体。所述抗体包被前与生物素进行偶联，形成生物素化新型冠状病毒抗体。所述新型冠状病毒抗体包括特异性识别新型冠状病毒N蛋白，S1蛋白，S-RBD蛋白，S2蛋白或S蛋白全长（S1+S2蛋白）的单抗或多抗。所述质控位点C通过结合荧光偶联标记区多余的荧光偶连复合物，不仅可以质控试剂检测的有效性，同时还能够作为内参，利用T/C的比值作为判断检测结果的依据，有效减少系统内自身误差，提高精密度及准确度。所述质控位点C与荧光标记区的偶联是通过生物素化特异性新型冠状病毒抗体-含标签肽段的特异性识别抗原-特异性标签抗体-荧光微球进行的。

在一些实施例中，以新型冠状病毒样本检测为例说明本发明稀释装置的使用效果。

1、材料

由上述的新型冠状病毒检测用试剂卡进行检测；

特异性识别新型冠状病毒总抗体的抗原，购自深圳市菲鹏生物股份有限公司；

核酸试剂：上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）；

荧光免疫分析仪（FREND system），韩国NanoEntek公司生产并提供。

2、方法

本专利稀释方法:利用上述样本采集管取样本50μl，刺穿稀释液加样瓶的加样孔的封口膜，下压至第二卡扣与卡槽相结合后，然后挤压气囊至样本加入第一稀释空腔450μl的稀释液，轻轻晃动后，将稀释液加样瓶向斜板高端方向90度倾斜一次，至斜板的凹槽储满液体，完成样本的首次10倍稀释，继续向下推样本采集管，刺破斜板上凹槽底部的铝膜，凹槽内5μl液体掉入第二稀释空腔的495μl，当样本采集管的第一卡扣与进样口处的卡槽结合时，样本采集管与斜板结合，样本采集管与第二稀释空腔形成相对密闭的腔体，轻轻晃动后，完成样本的再次100倍稀释，即样本经由两次稀释后完成1000倍稀释；稀释液加样瓶出液口的铝膜由试剂卡加样端设置的刺凸结构戳破,并与试剂卡加样端连接，由此实现对试剂卡的进样，4min后于判读仪上读取结果。分别检测5例由核酸试剂检测为阳性的早期（0-7天）新型冠状病毒患者的血液样本（S1-S5），验证试剂卡的灵敏度；分别检测5份阳性样本（S6-S10）及5份阴性样本（N1-N5），验证结果的准确度。

传统稀释方法:取两个离心管，分别加入450μl、495ul的稀释液标记为1和2，利用移液枪定量取样本50μl后加入其中一支离心管做标记为1离心管，震荡混匀后，从1离心管中取5μl液体加入另一支离心管标记为2离心管，再震荡混匀后，定量取2离心管中液体加入试剂卡中，4min后于判读仪上读取结果。分别检测5份阳性样本（S6-S10）及5份阴性样本（N1-N5），验证结果的准确度。

3、结果

表1 试剂卡对早期新冠患者的检测结果

检测结果显示，在早期检测结果中，3例患者的IgM与IgG均为阴性时，总抗体检测为阳性，5例患者的总抗体检测均为阳性，说明对新型冠状病毒感染患者同时进行IgM、IgG抗体分型检测及总抗体检测，可提高早期感染患者检出率，增强检测的灵敏度及特异性。

表2 不同稀释方法的结果对比

实验结果显示，本稀释装置稀释与传统方法梯度稀释的检测结果一致，5份临床阳性样本检测结果均为阳性,5份临床阴性样本检测结果均为阴性,符合试剂盒准确度要求；且对每个样本的检测时间由原来的8分钟降低至5分钟，大大提高了对新型冠状病毒样本的检测效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，包括稀释液加样瓶；所述稀释液加样瓶包括上下设置的第一稀释空腔和第二稀释空腔，该两个稀释空腔之间以一斜板相隔，所述第一稀释空腔的顶部设有供样本采集管插入的加样孔，所述斜板高端一侧设有一上下贯通的凹槽，所述凹槽位于所述加样孔的正下方；所述第二稀释空腔的底部设有出液口；所述加样孔的顶部、凹槽的底部及出液口的底部均塑封有封口膜。

2.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，所述样本采集管包括气囊和吸管，所述吸管底部为尖凸结构。

3.根据权利要求2所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，所述吸管上在其长度方向设有两个卡扣，所述加样孔边沿处设有用以卡住所述卡扣的卡槽，所述卡槽与卡扣的结构相适配。

4.根据权利要求3所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，当位于下部的卡扣与卡槽相配合时，所述吸管的底端位于第一稀释空腔内；当位于上部的卡扣与卡槽想配合时，所述吸管的底端位于第二稀释空腔内。

5.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，所述第二稀释空腔的下部为倒锥形结构。

6.根据权利要求5所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，所述出液口为相对于该倒锥形结构向下突出的管状结构，该管状结构的顶部或内部设有过滤件。

7.根据权利要求6所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，所述过滤件为过滤网或过滤棉塞。

8.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置，其特征在于，气囊与第一卡扣之间卡接有手柄。

9.与权利要求1-8所述的样本稀释装置配合使用的试剂卡，其特征在于，试剂卡的加样部设有用以戳破所述封口膜刺凸结构，所述试剂卡的检测区包括包被有抗新型冠状病毒IgM抗体的检测位点、包被有抗新型冠状病毒IgG抗体的检测位点、包被有特异性识别新型冠状病毒总抗体的抗原的检测位点。

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