CN111621420B - 一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片 - Google Patents

Abstract

一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，属于生物医学工程以及细胞生物学研究领域。该芯片系统主要由三层芯片构成，第一层芯片包括细胞的进口、细胞的出口、连接细胞培养室的微孔；第二层芯片包括神经元培养室、胶质细胞培养室、培养液的入口、培养液出口、多列微柱及微通道；第三层芯片包括集成的微电极阵列；中间两个神经元培养室通过一排微通道进行连接，其中微通道根据功能分为三部分。本发明具备多细胞共培养能力，并通过中间的微通道实现两侧神经元的突触构建以及两端的类环流通道实现细胞分泌物的物质传递，模拟了人体神经系统；底部的微电极阵列可以检测神经元突触受影响后的细胞及轴突上的电位变化。

Description

一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片

技术领域

本发明属于生物医学工程以及细胞生物学研究领域，具体涉及一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片及神经元间突触的构建。

背景技术

大脑由众多的神经细胞和胶质细胞构成，其中胶质细胞分布在神经元周围，对其生长发育有着重要的作用。神经细胞之间通过轴突、树突形成突触(包括化学突触和电突触)，实现彼此的信息传递，众多的神经细胞构成了庞大的神经网络。因而在突触上的信号转化、传递对于脑内的信号处理至关重要。如图6，经典的突触由突触前膜、突触间隙和突触后膜三部分组成，图5为神经元上电信号传递示意图。

神经胶质细胞在神经元突触形成过程中起重要作用。神经胶质细胞不仅能帮助神经元形成突触，还能帮助神经元维持已建立的突触。研究表明，胶质细胞分泌一些蛋白质、神经营养因子等，可以促进轴突数量的增加。在胶质细胞的存在下，神经元可以成熟并在神经元之间形成功能性突触连接。胶质细胞可以调节神经细胞的兴奋性，调节突触传递，改善突触功能，增强突触功能。

基于印制电路板的微流控工艺与成熟的聚合物微流控制造技术相结合而设计制作的微流控芯片可以实现对细胞的体外长期培养以及实时检测。其高度集成化、体积小、结构简单，消耗小、环保，安全性能较好，分析效率高，当商业采用大批量生产时，能够大大降低材料、生产成本，能够带来巨大的社会效益和经济效益。因而通过微流控芯片离体培养神经元构建突触的研究目前较多，同时也存在对神经元和胶质细胞的共培养实验，但部分实验中神经元间的突触构建杂乱无章，无法引导突起定向生长形成突触；同时也缺乏维持神经元生命活动的单元，即便有也多采取神经元与胶质细胞的无分隔共培养模式，使得神经元与胶质细胞混合在一起，对神经元的单独观察及实验产生不利的影响。因此我们希望能够有序的使神经元形成突触，通过神经元和胶质细胞的分区培养，将胶质细胞的分泌物提供给神经元，实现细胞间非接触物质传递，保障神经元正常的生命活动，提高神经元的存活时间，以此来提升构建的突触模型的使用时间，能够对神经元间的突触进行稳定有效的实验。胶质细胞可为神经元功能的发挥提供良好环境，不仅可以增加成熟突触的数目，还能增强突触的功能，参与对神经元兴奋性及突触传导的调节。

发明内容

本发明提供一种基于印制电路板的微流控工艺与聚合物微流控制造技术的微流控芯片，可模拟各类神经细胞之间突触的构建，以及胶质细胞的分泌物对神经元的促进作用，同时记录神经元电位电流变化，了解突触信号传递机制，可用于神经生理、神经心理、病理、药理，以及临床与健康精准医学的转化和应用定制服务。整个芯片可以实现监测体外神经元的生长发育，在细胞培养、生物检测、药剂实验等领域有广阔的应用前景。

本发明的技术方案如下：

一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，所述微流控芯片包括三层：第一层微流控芯片为细胞及培养液的注入层，包括细胞注入通道，其中通道包括细胞注入口、出口。所述第二层微流控芯片为细胞培养层，用于进行细胞培养及各项实验。第三层芯片为微电极芯片(微电极阵列层)，其上设有微电极阵列，微电极用于神经元的电信号检测，在无检测要求时，第三层芯片也可以更换为相应大小的玻璃片(PDMS等材料也可)，与第一、二层芯片键合，让细胞在其上附着生长。

所述第一层微流控芯片从上到下设有四个平行排布细胞悬浮液通道，四个微通道连接细胞悬浮液的入口和出口，左端临近芯片左边界的位置设有第一神经元细胞入口1-1、第二神经元细胞入口1-2、第一胶质细胞入口1-3、第二胶质细胞入口1-4，右端临近芯片右边界的位置设有第一神经元细胞出口2-1、第二神经元细胞出口2-2、第一胶质细胞出口2-3、第二胶质细胞出口2-4。所述第一胶质细胞入口1-3与第一神经元细胞入口1-1之间设有第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1a、第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3a，第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1a、第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3a之间设有第一层上第一细胞培养室的细胞培养液出口4-3a；所述第一神经元细胞入口1-1、第二神经元细胞入口1-2之间设有第一层上突触区的细胞培养液入口10a、第一层上实验试剂入口11a；所述第二神经元细胞入口1-2、第二胶质细胞入口1-4之间设有第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2a、第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4a，第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2a、第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4a之间设有第一层上第二细胞培养室的细胞培养液出口4-4a。所述第一神经元细胞出口2-1、第二神经元细胞出口2-2之间设有第一层上第一神经元培养室的细胞培养液出口4-1a、第一层上第二神经元培养室的细胞培养液出口4-2a，第一层上第一神经元培养室的细胞培养液出口4-1a、第一层上第二神经元培养室的细胞培养液出口4-2a之间设有第一层上实验试剂出口12a。所述第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1a、第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2a、第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3a、第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4a分别与第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2b、第二层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3b、第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4b相对齐，例如第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1a与第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b对齐。

所述第二层微流控芯片包括两个神经元培养单元、两个细胞培养单元、第二层上突触区的细胞培养液入口10b、第二层上实验试剂入口11b、第二层上实验试剂出口12b，每个单元包括进液口、出液口以及微筛，如图2(a)、图2(b)所示，具体为：

第一神经元培养单元位于芯片中上方，包括第一神经元培养室A、第一神经元培养室圆孔阵列6、两个第一神经元培养室的微筛5-1，第一神经元培养室圆孔阵列6位于第一神经元培养室A内部，第一神经元培养室的微筛5-1设于第一神经元培养室A的出口、入口处，微筛起到减速进液、阻挡细胞的作用，所述第一神经元培养室A的左侧入口通过微通道与第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b连通，右侧出口通过微通道与第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口4-1b连通。

第二神经元培养单元位于芯片中下方，包括第二神经元培养室B、第二神经元培养室圆孔阵列7、两个第二神经元培养室的微筛5-2，第二神经元培养室圆孔阵列7位于第二神经元培养室B内部，第二神经元培养室的微筛5-2设于第二神经元培养室B的出口、入口处，起到减速进液、阻挡细胞的作用；所述第二神经元培养室B的左侧入口通过微通道与第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2b连通，右侧出口通过微通道与第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口4-2b连通。

第一细胞培养单元位于芯片上方(第一神经元培养室A上方)，包括第一细胞培养室C、第一细胞培养室圆孔阵列8、第一细胞培养室的微筛5-3，第一细胞培养室圆孔阵列8位于第一细胞培养室C内，且第一细胞培养室C内设有第一细胞培养室的微筛5-3；第一细胞培养室C出入口均设于左侧，入口通过微通道与第二层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3b连通，出口通过微通道与第二层上第一细胞培养室的细胞培养液出口4-3b连通。

第二细胞培养单元位于芯片下方(第二神经元培养室B下方)，包括第二细胞培养室D、第二细胞培养室圆孔阵列9、第二细胞培养室的微筛5-4，第二细胞培养室圆孔阵列9位于第二细胞培养室D内部，且第二细胞培养室D内设有第二细胞培养室的微筛5-4；第二细胞培养室D出入口均设于左侧，入口通过微通道与第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4b连通，出口通过微通道与第二层上第二细胞培养室的细胞培养液出口4-4b连通。

所述的第一神经元培养室A与第二神经元培养室B之间通过多列微通道连通，微通道与左右边界平行，微通道分为轴突区、突触区、树突区三个部分，轴突区长500μm、宽3-8μm，高100μm；突触区长80μm、高100μm，树突区长70μm、宽3-8μm、高100μm；其中，第一神经元培养室A、第二神经元培养室B用于培养脑神经元，构建突触传递模型；两侧第一细胞培养室C、第二细胞培养室D用于培养神经胶质细胞，通过将其分泌物分别传递到第一神经元培养室A、第二神经元培养室B内来增强神经元的生命活动，且两侧培养的神经元及神经胶质细胞可以有所不同。所述第一神经元培养室A与第一细胞培养室C的培养液流出通道之间设有挡板(挡板用于隔离第二层的环流通道和神经元细胞培养室)，二者通过挡板下的间隙连通，间隙高10μm，以此实现第一神经元培养室A与第一细胞培养室C之间的物质传递。第二神经元培养室B、第二细胞培养室D之间拥有相同的结构。

所述第一神经元培养室A与第二神经元培养室B结构、尺寸相同，其腔室为内接圆半径2500μm的外接六边形的一半，高100μm；第一细胞培养室C、第二细胞培养室D结构、尺寸相同，为半径2800μm的半圆顶部，据顶点1200μm(半圆顶部结构中，直线与弧线之间的最大的距离为1200μm)，高100μm。

所述的第一细胞培养室圆孔阵列8、第一神经元培养室圆孔阵列6、第二神经元培养室圆孔阵列7、第二细胞培养室圆孔阵列9中，每排圆孔阵列均与上下边界平行且均设有多个等间隔排布的圆孔，与第一层芯片上的四个微通道相对应，用于让细胞悬浮液分别流入第二层的第一神经元培养室A、第二神经元培养室B、第一细胞培养室C、第二细胞培养室D。

所述的第二层上第一细胞培养室的培养液入口3-3b、第二层上第一细胞培养室的细胞培养液出口4-3b、第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2b、第二层上第二细胞培养室的细胞培养液出口4-4b、第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4b均设于芯片左边界，第二层上第一细胞培养室的培养液入口3-3b、第二层上第一细胞培养室的细胞培养液出口4-3b、第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b位于芯片上半部分，第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2b、第二层上第二细胞培养室的细胞培养液出口4-4b、第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口3-4b位于芯片下半部分，六个入口与芯片左边界等距，且其连线与芯片左边界平行。所述第二层上突触区的细胞培养液入口10b、第二层上实验试剂入口11b位于芯片中部的左侧，且设于第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b与第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口3-2b之间，第二层上实验试剂出口12b位于芯片中部的右侧，且位于第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口4-1b、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口4-2b之间。所述的第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口4-1b、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口4-2b设于芯片右边界，且与芯片右边界等距。

所述第三层芯片上设有多列电极，其中包括38个工作电极，1个参比电极，电极对应第二层神经元分布位置排列，电极直径10μm。第二层微流控芯片与第三层微电极芯片键合，微电极芯片上的微电极排列与神经元培养室和突触区相对应。若无需检测时，可以直接使用等大小的聚合物PDMS等作为第三层。

进一步的，所述的第一神经元培养室A与第二神经元培养室B与出入口连通的通道宽100μm、高100μm；第一细胞培养室C、第二细胞培养室D与出入口连通的通道宽100μm，高100μm，通道为环形通道。

进一步的，第一层芯片厚度为300μm，第二层芯片厚度为200μm。

一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片上多室的连通方式，说明如下：

所述第一神经元培养室A、第二神经元培养室B通过矩形微通道进行连接。如图2(c)所示，芯片中间的多列微通道按功能分为轴突区i、突触区ii、树突区iii三个部分，轴突区长500μm，宽3-8μm，高100μm；突触区长80μm，高100μm，树突区长70μm，宽3-8μm，高100μm，神经元的轴突一般较长，而树突较短，所以在轴突区i的长微通道内只有轴突可到达突触区ii，树突区iii的短微通道内轴突和树突都可到达突触区ii，轴突、树突沿轴突区i、树突区iii生长，最后在突触区ii相遇形成突触，突触区ii可以由第一层上突触区的细胞培养液入口10a注入有利于形成突触的细胞培养液，以此可以实现构建轴突到树突的定向信号传递模型，另外在稳定后突触区ii也可通过第一层上实验试剂入口11a注入实验试剂进行药物实验。

第一神经元培养室A、第二神经元培养室B用于在中间的突触区构建突触；两边的第一细胞培养室C、第二细胞培养室D用于提供用于增强神经元生命活动的分泌物；微电极芯片用于检测突触受刺激后两边神经元的电位变化；第一神经元培养室A、第二神经元培养室B可以注入不同种神经元，与之对应的第一细胞培养室C、第二细胞培养室D则可注入有益于各自种类神经元的神经胶质细胞。第一细胞培养室C、第二细胞培养室D用于产生细胞分泌物，经过环形通道在挡板底与神经元培养室单元进行传质，从而增强神经元的生命活动，有利于其突起通过轴突区、树突区在突触区形成突触，轴突区微通道全都为轴突，树突区微通道内包含轴突和树突，由此希望构建轴突到树突的定向信号传递；中间的突触区则可通过另外的通道进行药物实验，通道宽100μm，高100μm；之后由第二层芯片下的微电极芯片对两边改变的电信号进行检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明利用多层微流控芯片集成的方法，将多种细胞的培养单元结合，根据突触的构建原理，将不同神经元分开放置于两室，利用微通道引导突起在突触区形成突触，可简便快捷的对突触结构处进行相关实验，同时两端的胶质细胞培养区将有助于增强神经元生命活动的分泌物通过类环形结构传给神经元，可为神经元功能的发挥提供良好环境，不仅可以增加成熟突触的数目，还能增强突触的功能，参与对神经元兴奋性及突触传导的调节。

(2)本发明具备独立的细胞培养腔室，根据需要，在腔室下的第三层微电极芯片上集成微电极阵列，可实现细胞培养过程中的相关电信号检测。

附图说明

图1为本发明的第一层内部结构示意图；

图2(a)为本发明的第二层内部结构示意图；图2(b)为第二层芯片的俯视图；图2(c)为第二层芯片第一神经元培养室A、第二神经元培养室B的局部放大图；图2(d)为第二层芯片第一神经元培养室A、第一细胞培养室C的局部放大图；

图3为本发明的第一、二层芯片贴合后结构示意图；

图4为本发明的第三层微电极阵列芯片的电极布局示意图；

图5为膜上电信号传递图；

图6为突触信号传递图；

图7为第二层芯片上的培养液流动方向。

图中：

1-1第一神经元细胞入口；1-2第二神经元细胞入口；1-3第一胶质细胞入口；1-4第二胶质细胞入口；

2-1第一神经元细胞出口；2-2第二神经元细胞出口；2-3第一胶质细胞出口；2-4第二胶质细胞出口；

3-1a第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口；3-1b第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口；3-2a第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口；3-2b第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口；3-3a第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口；3-3b第二层上第一细胞培养室的细胞培养液入口；3-4a第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口；3-4b第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口；

4-1a第一层上第一神经元培养室的细胞培养液出口；4-1b第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口；4-2a第一层上第二神经元培养室的细胞培养液出口；4-2b第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口；4-3a第一层上第一细胞培养室的细胞培养液出口；4-3b第二层上第一细胞培养室的细胞培养液出口；4-4a第一层上第二细胞培养室的细胞培养液出口；4-4b第二层上第二细胞培养室的细胞培养液出口；

5-1第一神经元培养室的微筛；5-2第二神经元培养室的微筛；5-3第一细胞培养室的微筛；5-4第二细胞培养室的微筛；

6第一神经元培养室圆孔阵列；7第二神经元培养室圆孔阵列；8第一细胞培养室圆孔阵列；9第二细胞培养室圆孔阵列；

10a第一层上突触区的细胞培养液入口；10b第二层上突触区的细胞培养液入口；

11a第一层上实验试剂入口；11b第二层上实验试剂入口；

12a第一层上实验试剂出口；12b第二层上实验试剂出口；

A第一神经元培养室；B第二神经元培养室；C第一细胞培养室；D第二细胞培养室；i轴突区；ii突触区；iii树突区；o培养液流出通道；p挡板；q挡板下间隙。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细说明，但并不因此而限制于本发明。

一种基于微流控技术的多细胞共培养神经环路芯片，芯片由三层构成，主要包括四个细胞培养单元，按功能分为第一神经元培养室A、第二神经元培养室B，第一细胞培养室C、第二细胞培养室D，每个单元包括进液口、出液口以及微筛，如图1所示：在第一神经元培养单元中，神经元细胞悬浮液由位于第一层芯片上的第一神经元细胞入口1-1进入微通道，在到达第一神经元培养室A上方时，可以通过第二神经元培养室圆孔阵列7流入位于第二层芯片的神经元培养室中，并逐渐在第三层芯片上完成贴附，而过量的细胞悬浮液则由第一神经元细胞出口2-1流出，神经元所需的细胞培养液经由第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1a、第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口3-1b注入，培养液在进入第一神经元培养室前会经第一神经元培养室的微筛5-1减速，防止流速过快对神经元造成冲击，随着培养液的注入，在第一层上第一神经元培养室的细胞培养液出口4-1a开始吸出神经元消耗后的培养液，如此可以实现细胞的稳态培养，保证培养液的及时更换，培养液在进入流出通道前会经过阻挡细胞的第一神经元培养室的微筛5-1；在第一细胞培养单元中，胶质细胞悬浮液由位于第一层芯片上的第一胶质细胞入口1-3进入微通道，在到达第一细胞培养室C上方时，可以通过第二细胞培养室圆孔阵列9流入位于第二层芯片的胶质细胞培养室中，并逐渐在第三层芯片上完成贴附，而过量的细胞悬浮液则由第一胶质细胞出口2-3流出，胶质细胞所需的细胞培养液经由第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3a、第二层上第一细胞培养室的细胞培养液入口3-3b注入，培养液在进入第一胶质细胞培养室前会经第一细胞培养室的微筛5-3减速，防止对神经元造成冲击，随着培养液的注入，在第一层上第一细胞培养室的细胞培养液出口4-3a开始吸出神经元消耗后的培养液，培养液在进入流出通道前会经过阻挡细胞的第一细胞培养室的微筛5-3；第二神经元培养单元和第二细胞培养单元操作同上。

如图2(c)所示，其中包括树突区iii、轴突区i、突触区ii：待神经元在第三层芯片上贴附稳定下来后，神经元开始在第一神经元培养室A、第二神经元培养室B之间的多列微通道内构建突触，神经元具有很长的轴突，而树突很短，所以轴突可以穿过轴突区i，而树突只能穿过较短的树突区iii，所以第一神经元培养室A内的神经元的轴突可以穿过轴突区i到达突触区ii，第二神经元培养室B内的神经元的轴突、树突可以穿过树突区i到达突触区ii，而通过从第一层上突触区的细胞培养液入口10a注入有利于形成突触的培养液到突触区ii中，可以更有利于轴突、树突在突触区ii形成突触，待突触建立后，可由第一层上实验试剂入口11a加入实验试剂，实现对突触部位的实验。

以上半部分的第一神经元培养室A与第一细胞培养室C为例，如图2(d)所示，在第一神经元培养室A与第一细胞培养室C的培养液流出通道o通过挡板p下的间隙q相连接，间隙q高10μm，通过间隙q可以实现第一细胞培养室C的细胞分泌物传递到第一神经元培养室A，增强第一神经元培养室A内神经元的生命活动，有利于其突起通过树突区在突触区形成突触；以此实现第一神经元培养室A、第一细胞培养室C的物质传递，第二神经元培养室B、第一细胞培养室C之间拥有相同的结构。第一细胞培养室C由环形通道连接，通道宽100μm，高100μm，细胞培养液进出通道宽100μm，高100μm；所述挡板用于隔离第二层的培养液流出通道o和第一神经元培养室A，挡板长5780μm，宽100μm，高90μm。所述第一神经元培养室A、第二神经元培养室B为内接圆半径2500μm的外接六边形的一半，高100μm；第一细胞培养室C、第二细胞培养室D为半径2800μm的半圆顶部，据顶点1200μm，高100μm。第一细胞培养室C内的胶质细胞在进行正常的生命活动后产生的分泌物可由第一层上第一细胞培养室的细胞培养液出口4-3a吸出，如图2(d)，在到达微通道o处时，可以将分泌物通过挡板p下的间隙q传递到第一神经元培养室中，挡板p可以阻挡第一神经元培养室A内的神经元，底部间隙q只容许培养液通过，能够进行不同细胞的共培养实验，同时也能实现细胞的非接触物质传递，提高神经元的存活时间，增强神经元的生命活动。

如图4所示：所述第三层微电极芯片上的电极对应第二层芯片的结构进行设计，第二层芯片中的细胞培养室内的细胞在第三层芯片上附着生长，如无检测要求，第三层芯片也可以用PDMS等适合细胞生长的材料替换，中间一列电极(8个)位于轴突区，用于检测轴突上的信号，微通道两侧另有6列电极(30个)位于神经元培养室，用于检测胞体上的信号。R为参比电极。

所述芯片在使用时，第一、二层芯片采用PDMS制作，可以采用可逆封装，芯片在封装前，首先用去离子水和甲醇对两层PDMS芯片(需要键合的表面)表面进行反复清洗；然后，用氮气吹干；最后，直接接触粘合即得到一、二层的可逆封装芯片。可逆封装的PDMS微流体芯片最突出的一个特点是芯片可以根据实验需要进行任意拆洗，反复使用。不过需要注意可逆封装的PDMS微流体芯片所能承受的最大压力不超过3.45×10⁴Pa。若需提高芯片封装强度，可以通过改变PDMS盖片与基片中基质/固化剂配比的方法来实现。对于第三层微电极芯片的键合，需要在其键合面涂覆30μm厚的PDMS薄层保护，随后将已经键合的一、二层PDMS微流控芯片与微电极芯片键合，完成密封。在进行细胞实验注入细胞前，需对芯片进行清洗、灭菌、蛋白包被等预处理。

本发明通过建立四个细胞培养室，利用类环形结构收集第一细胞培养室C、第二细胞培养室D的胶质细胞分泌物用于增强第一神经元培养室A、第二神经元培养室B内神经元的生命活动，实现细胞的非接触物质传递，有利于突触的稳定构建，可以作为研究脑神经元突触传递信号的实验平台，方便进行相应的药物筛选和毒性评价。

以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述的微流控芯片包括三层：第一层微流控芯片为细胞及培养液的注入层，包括细胞注入通道；第二层微流控芯片为细胞培养层，用于进行细胞培养及各项实验；第三层芯片为微电极芯片；

所述第一层微流控芯片从上到下设有四个平行排布细胞悬浮液通道，四个微通道连接细胞悬浮液的入口和出口，第一神经元细胞入口(1-1)、第二神经元细胞入口(1-2)、第一胶质细胞入口(1-3)、第二胶质细胞入口(1-4)临近芯片左边界，第一神经元细胞出口(2-1)、第二神经元细胞出口(2-2)、第一胶质细胞出口(2-3)、第二胶质细胞出口(2-4)临近芯片右边界；所述第一神经元细胞入口(1-1)与第一胶质细胞入口(1-3)之间设有第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口(3-1a)、第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口(3-3a)，第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口(3-1a)、第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口(3-3a)之间设有第一层上第一细胞培养室的细胞培养液出口(4-3a)；所述第一神经元细胞入口(1-1)、第二神经元细胞入口(1-2)之间设有第一层上突触区的细胞培养液入口(10a)、第一层上实验试剂入口(11a)；所述第二神经元细胞入口(1-2)、第二胶质细胞入口(1-4)之间设有第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口(3-2a)、第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口(3-4a)，第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口(3-2a)、第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口(3-4a)之间设有第一层上第二细胞培养室的细胞培养液出口(4-4a)；所述第一神经元细胞出口(2-1)、第二神经元细胞出口(2-2)之间设有第一层上第一神经元培养室的细胞培养液出口(4-1a)、第一层上第二神经元培养室的细胞培养液出口(4-2a)，第一层上第一神经元培养室的细胞培养液出口(4-1a)、第一层上第二神经元培养室的细胞培养液出口(4-2a)之间设有第一层上实验试剂出口(12a)；所述第一层上第一神经元培养室的细胞培养液入口(3-1a)、第一层上第二神经元培养室的细胞培养液入口(3-2a)、第一层上第一细胞培养室的细胞培养液入口(3-3a)、第一层上第二细胞培养室的细胞培养液入口(3-4a)分别与第二层芯片上的第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口(3-1b)、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口(3-2b)、第二层上第一细胞培养室的细胞培养液入口(3-3b)、第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口(3-4b)相对齐；

所述第二层微流控芯片包括两个神经元培养单元、两个细胞培养单元、第二层上突触区的细胞培养液入口(10b)、第二层上实验试剂入口(11b)、第二层上实验试剂出口(12b)，具体为：

第一神经元培养单元位于芯片中上方，包括第一神经元培养室A、第一神经元培养室圆孔阵列(6)、两个第一神经元培养室的微筛(5-1)，第一神经元培养室圆孔阵列(6)位于第一神经元培养室A内部，第一神经元培养室的微筛(5-1)设于第一神经元培养室A的出口、入口处，所述第一神经元培养室A的左侧入口通过微通道与第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口(3-1b)连通，右侧出口通过微通道与第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口(4-1b)连通；

第二神经元培养单元位于芯片中下方，包括第二神经元培养室B、第二神经元培养室圆孔阵列(7)、两个第二神经元培养室的微筛(5-2)，第二神经元培养室圆孔阵列(7)位于第二神经元培养室B内部，第二神经元培养室的微筛(5-2)设于第二神经元培养室B的出口、入口处；所述第二神经元培养室B的左侧入口通过微通道与第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口(3-2b)连通，右侧出口通过微通道与第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口(4-2b)连通；

第一细胞培养单元位于芯片上方，包括第一细胞培养室C、第一细胞培养室圆孔阵列(8)、第一细胞培养室的微筛(5-3)，第一细胞培养室圆孔阵列(8)位于第一细胞培养室C内部，且第一细胞培养室C内设有第一细胞培养室的微筛(5-3)；第一细胞培养室C出入口均设于左侧，入口通过微通道与第二层上第一细胞培养室的细胞培养液入口(3-3b)连通，出口通过微通道与第二层上第一细胞培养室的细胞培养液出口(4-3b)连通；

第二细胞培养单元位于芯片下方，包括第二细胞培养室D、第二细胞培养室圆孔阵列(9)、第二细胞培养室的微筛(5-4)，第二细胞培养室圆孔阵列(9)位于第二细胞培养室D内部，且第二细胞培养室D内设有第二细胞培养室的微筛(5-4)；第二细胞培养室D出入口均设于左侧，入口通过微通道与第二层上第二细胞培养室的细胞培养液入口(3-4b)连通，出口通过微通道与第二层上第二细胞培养室的细胞培养液出口(4-4b)连通；

所述第二层上突触区的细胞培养液入口(10b)、第二层上实验试剂入口(11b)位于芯片中部的左侧，且设于第二层上第一神经元培养室的细胞培养液入口(3-1b)与第二层上第二神经元培养室的细胞培养液入口(3-2b)之间，第二层上实验试剂出口(12b)位于芯片中部的右侧，且位于第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口(4-1b)、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口(4-2b)之间；所述的第二层上第一神经元培养室的细胞培养液出口(4-1b)、第二层上第二神经元培养室的细胞培养液出口(4-2b)设于芯片右边界，且与芯片右边界等距；

所述的第一神经元培养室A与第二神经元培养室B之间通过多列微通道连通，微通道与左右边界平行，微通道分为轴突区、突触区、树突区三个部分；所述第一神经元培养室A与第一细胞培养室C的培养液流出通道之间设有微坝，二者通过微坝下的间隙连通，间隙高10μm，以此实现第一神经元培养室A与第一细胞培养室C之间的物质传递；第二神经元培养室B、第二细胞培养室D之间拥有相同的结构；第一神经元培养室A、第二神经元培养室B用于培养脑神经元，构建突触传递模型，第一细胞培养室C、第二细胞培养室D用于培养神经胶质细胞，通过将其分泌物分别传递到第一神经元培养室A、第二神经元培养室B内来增强神经元的生命活动

所述的第一神经元培养室圆孔阵列(6)、第二神经元培养室圆孔阵列(7)、第一细胞培养室圆孔阵列(8)、第二细胞培养室圆孔阵列(9)中，每排圆孔阵列均与上下边界平行且均设有多个等间隔排布的圆孔，四排圆孔阵列与第一层芯片上的四个微通道相对应，用于让细胞悬浮液分别流入第二层的第一神经元培养室A、第二神经元培养室B、第一细胞培养室C、第二细胞培养室D；

所述第三层芯片上设有多列微电极阵列，用于神经元的电信号检测，包括38个工作电极，1个参比电极，电极对应第二层神经元分布位置排列，电极直径10μm；第二层微流控芯片与第三层微电极芯片键合，微电极芯片上的微电极排列与神经元培养室和突触区相对应，让细胞在其上附着生长；若无需检测时，直接使用等大小的聚合物PDMS层作为第三层。

2.根据权利要求1所述的一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述的第一神经元培养室A与第二神经元培养室B与出入口连通的通道宽100μm、高100μm。

3.根据权利要求1所述的一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，第一细胞培养室C、第二细胞培养室D与出入口连通的通道宽100μm，高100μm，通道为环形通道。

4.根据权利要求1所述的一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，第一层芯片厚度为300μm，第二层芯片厚度为200μm。

5.根据权利要求1所述的一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述的轴突区长500μm、宽3-8μm，高100μm；突触区长80μm、高100μm，树突区长70μm、宽3-8μm、高100μm。

6.根据权利要求1所述的一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述第一神经元培养室A与第二神经元培养室B结构、尺寸相同，其腔室为内接圆半径2500μm的外接六边形的一半，高100μm。

7.根据权利要求1所述的一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述第一细胞培养室C、第二细胞培养室D结构、尺寸相同，为半径2800μm的半圆顶部，距顶点1200μm，高100μm。

Images