CN111617145A

CN111617145A - 一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111617145A
Application number: CN202010440502.1A
Authority: CN
Inventors: 萧文鸾; 梁丽娴; 刘良; 姜志宏
Original assignee: Tianzeda Health Industry Co ltd
Current assignee: Tianzeda Health Industry Co ltd
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2040-05-22
Also published as: CN111617145B

Abstract

本发明属于医药领域，具体公开了一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物，所述组合物包含槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中的至少两种。所述组合物可有效提高宿主肠道内紧密连接蛋白的表达，促进N钙粘蛋白向E钙粘蛋白转换，上调E钙粘蛋白水平，下调N钙粘蛋白的水平，提高了肠道上皮的完整性并进一步发挥抗癌与抗炎的作用，维护宿主肠道健康；本发明所述组合物所含的提取物源于安全性高的中药材，其副作用小、安全性高。本发明也公开了所述组合物的制备方法，以及将所述组合物应用于药物或饲料中。

Description

一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物及其制备方法与应用。

背景技术

宿主肠道健康依赖于肠道上皮结构的完整性，紧密连接蛋白(包括闭合蛋白，闭锁小带蛋白-1)在肠道上皮结构完整性中起到细胞与细胞间紧密连接作用。闭合蛋白是一种重要的跨膜整合蛋白，闭合蛋白的C端控制细胞内运输，可与闭锁小带蛋白-1(ZO-1)结合，闭锁小带蛋白-1是一种连接跨膜紧密连接蛋白和肌动蛋白骨架的蛋白。闭合蛋白和闭锁小带蛋白-1可以形成一种复合体结构，病原体必须克服这种结构才能成功入侵。一方面上皮细胞通过紧密连接蛋白连接在一起，以防止小分子渗入细胞，调节上皮的通透性。另一方面，大量研究证实，紧密连接蛋白在癌症的转移中也起到至关重要的作用，例如大肠癌患者肠上皮的紧密连接蛋白丢失会加速肿瘤转移。肠道紧密连接蛋白的丢失与多种疾病相关，如肠道炎症，腹泻，克罗恩病(Crohn’s disease)，肿瘤转移等。此外，在日常摄入的食物,经过消化活动产生大量饮食抗原，健康的紧密连接蛋白也为肠道上皮层持续性接触大量的饮食抗原提供了物理屏障和饮食耐受性。因此，通过提高或恢复紧密连接蛋白在肠道的表达水平来纠正肠道屏障功能，改善肠道功能，对维护宿主健康和预防疾病有重要作用。

钙粘蛋白是一类重要的细胞粘附分子，E钙粘蛋白被认为是一种抑癌分子，其抑癌作用是通过加强细胞间黏附和抑制细胞增殖来发挥的，而N钙粘蛋白在细胞质中高表达可以导致大量癌基因作用明显增强。E钙粘蛋白的下调以及N钙粘蛋白的上调转换会使肿瘤更加易于转移。另有研究显示，提高血液中丙酸盐或丁酸盐等成分，可以有效提高肠道上皮细胞紧密连接蛋白的表达。

但是目前，能够提高肠道上皮紧密连接蛋白的表达，促进N钙粘蛋白向E钙粘蛋白的转换，且副作用小、安全性高的药物很少。

因此，亟需提供一种能够提高细胞紧密连接蛋白的表达，促进N钙粘蛋白向E钙粘蛋白转换，且副作用小、安全性高的组合物。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物，能够提高紧密连接蛋白的表达，促进N钙粘蛋白向E钙粘蛋白转换，且副作用小、安全性高。

一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物，包含槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中的至少两种。

优选的，所述组合物，包含槐花提取物，还包括金银花提取物或/和栀子提取物。

优选的，按重量百分数计，所述槐花提取物的质量为所述组合物的质量的30-70％。

若含，则所述槐花提取物、金银花提取物和栀子提取物分别独立采用水或/和醇浸提得到。

优选的，所述槐花提取物、金银花提取物和栀子提取物分别独立采用乙醇水溶液浸提得到；进一步优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分量为50％-95％。

优选的，所述槐花提取物的制备方法如下：称取槐花，粉碎，用乙醇水溶液提取，过滤，得浸提液；除去乙醇后，用大孔树脂吸附，洗脱，收集洗脱液，去洗脱液中的乙醇，即得所述槐花提取物。

所述金银花提取物的制备方法如下：称取金银花，粉碎，用乙醇水溶液提取，过滤，得浸提液；除去乙醇后，用大孔树脂吸附，洗脱，收集，去乙醇，即得所述槐花提取物。

所述栀子提取物的制备方法如下：称取栀子，粉碎，用乙醇水溶液提取，过滤，得浸提液；除去乙醇后，用大孔树脂吸附，洗脱，收集，去乙醇，即得所述槐花提取物。

优选的，在制备槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中，所述乙醇水溶液的重量为药材的重量的2-15倍。

优选的，在制备槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中，所述提取过程为提取2-4次，每次提取1-3小时。

优选的，在制备槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中，所述大孔树脂为D101大孔树脂。

一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物的制备方法，包括以下步骤：

称取所述槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中的至少两种，混合，即制得所述含槐花的组合物。

所述组合物在制备饲料或药物中的应用。

一种药物，所述药物含有本发明所述的组合物及在药学上可接受的辅料。

在所述组合物中，包含槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中的至少两种，其中槐花提取物中含有芦丁和槲皮素，金银花提取物中含有绿原酸和木犀草素，栀子提取物中含有栀子苷。其主要成分可以协同增效，提高闭合蛋白的表达水平，促进E-钙粘蛋白向N-钙粘蛋白转换，上调E钙粘蛋白水平，下调N钙粘蛋白水平，而任何单一提取物无法达到上述效果。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述组合物可有效提高宿主肠道内紧密连接蛋白的表达，促进N钙粘蛋白向E钙粘蛋白转换，上调E钙粘蛋白水平，下调N钙粘蛋白的水平，提高了肠道上皮的完整性并进一步发挥抗癌与抗炎的作用，维护宿主肠道健康。

(2)本发明所述组合物所含的提取物源于安全性高的中药材，其副作用小、安全性高。

附图说明

图1为实施例1、实施例2中小鼠肠道紧密连接蛋白免疫荧光测试图；

图2为实施例1、实施例2中经qRT-PCR测定的小鼠肠道内闭合蛋白和闭锁小带蛋白-1的倍数变化图；

图3为实施例1、实施例2中小鼠肠道内钙粘蛋白表达的免疫组织化学测试图；

图4为实施例1、实施例2中小鼠肠道内钙粘蛋白表达的蛋白质印迹法测试及光密度学分析图；

图5为实施例1、实施例2中小鼠血液中丁酸和异丁酸的变化图；

图中，数据统计学差异以*表示，*表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

分别称取槐花、金银花各50g，粉碎后，过60目筛，分别用500g 85％乙醇水溶液提取3次，过滤，得浸提液；除去浸提液的乙醇后，再用D101大孔树脂进行吸附，吸附后采用85％乙醇水溶液洗脱大孔树脂，收集洗脱液，去洗脱液中的乙醇，分别得槐花和金银花提取物。

将槐花提取物和金银花提取物按1:1的比例混合均匀，即得组合物A。

实施例2

分别称取槐花、栀子各50g，粉碎后，过60目筛，分别用500g 85％乙醇水溶液提取3次，过滤，得浸提液；除去浸提液的乙醇后，再用D101大孔树脂进行吸附，吸附后采用85％乙醇水溶液洗脱大孔树脂，收集洗脱液，去洗脱液中的乙醇，分别得槐花和栀子提取物。

将槐花提取物和栀子提取物按1:1的比例混合均匀，即得组合物B。

实施例3

分别称取金银花、栀子各50g，粉碎后，过60目筛，分别用500g 85％乙醇水溶液提取3次，过滤，得浸提液；除去浸提液的乙醇后，再用D101大孔树脂进行吸附，吸附后采用85％乙醇水溶液洗脱大孔树脂，收集洗脱液，去洗脱液中的乙醇，分别得金银花和栀子提取物。

将金银花提取物和栀子提取物按1:1的比例混合均匀，即得组合物C。

实施例4

分别称取槐花40g、金银花30g、栀子各30g，粉碎后，过60目筛，分别用500g 85％乙醇水溶液提取3次，过滤，得浸提液；除去浸提液的乙醇后，再用大孔树脂进行吸附，吸附后采用85％乙醇水溶液进行洗脱大孔树脂，收集洗脱液，去洗脱液中的乙醇，分别得槐花、金银花和栀子提取物。

将槐花提取物、金银花提取物和栀子提取物按1:1:1的比例混合均匀，即得组合物D。

产品效果测试

选择实施例1、实施例2制得的组合物，测试其对小鼠肠道紧密连接蛋白的增强作用。

采用6-8周龄的自发性肠癌(Apc^min/+)小鼠为研究对象，设置2个实验组，实验组1给予实施例1制备的组合物(含金银花和槐花提取物，用SL组表示)，给予量为1g/kg(即每kg体重的小鼠给予SL组的量为1g)；实验组2给予实施例2制备的组合物(含槐花和栀子的提取物，用FSP组表示)，给予量为1g/kg(即每kg体重的小鼠给予FSP组的量为1g)，连续灌胃4周。在实验第4周结束后，将小鼠麻醉处理后，采集小鼠血清，并分别刮取小鼠肠道内黏膜层，采用RNA提取试剂盒提取小鼠肠道内黏膜层的RNA，并采用qRT-PCR(实时荧光定量PCR)法对目的基因进行检测。采用免疫荧光染色法对小鼠肠道内紧密连接蛋白进行染色。采用免疫组织化学法对小鼠肠道内钙粘蛋白进行染色分析。采用Western blot(蛋白质印迹法)对肠道内目的蛋白进行检测。采用UPLC-TOF-MS(超高压液相色谱-飞行时间质谱仪)对小鼠血清中丁酸与异丁酸的含量进行测定。另设置1个空白组，用Ctrl表示，空白组给小鼠灌胃水，给予量为1g/kg，其他实验条件与实验组1-2相同。

将实施例1和实施例2的组合物灌胃小鼠后，对小鼠肠道紧密连接蛋白表达的进行免疫荧光测试，如图1所示，图中第1列分别为空白组、SL组和FSP组的细胞核的免疫荧光测试图，第2列分别为空白组、SL组和FSP组闭合蛋白的免疫荧光影像图，第3列分别为空白组、SL组和FSP组的闭合小带-1的免疫荧光影像图，第4列分别为为各实验组和对照组的细胞核，闭合蛋白，及闭锁小带蛋白-1免疫荧光影像的重叠合并图。结果显示，与空白组(Ctrl)进行比较，经过SL和FSP对Apc^min/+小鼠进行治疗后，可以有效提高肠道内紧密连接蛋白的表达。

将实施例1和实施例2的组合物灌胃小鼠后，测试其对小鼠肠道内紧密连接蛋白的含量的影响。如图2中a所示，采用qRT-PCR(实时荧光定量PCR)法对編碼闭合蛋白和闭锁小带蛋白-1的RNA进行测定，得闭合蛋白和闭锁小带蛋白-1倍数变化，与空白组进行比较，经过实施例1和实施例2的组合物治疗后，显著提高了上述紧密连接蛋白的含量水平，其中SL组提高了183.4％，FSP组提高了157.3％。

如图2中b所示，经过实施例1和实施例2的组合物治疗后，显著提高了闭锁小带蛋白-1的含量，其中SL组提高了376.3％，FSP组提高了274.3％。

将实施例1和实施例2的组合物灌胃小鼠后，测试其对小鼠肠道内钙粘蛋白的表达的影响。如图3所示，在采用免疫组织化学染色法对钙粘蛋白E和钙粘蛋白N进行染色后，与空白组进行比较，经过SL以及FSP治疗后，显著提高了E钙粘蛋白在小鼠肠道内的表达以及降低了N钙粘蛋白在小鼠肠道内的表达。

采用蛋白质印迹法对钙粘蛋白E和钙粘蛋白N进行测定，测试结果见图4中a。如图4中b所示，用灰度值测试蛋白质印迹法中钙粘蛋白E的具体倍数变化，与空白组进行比较，经过SL以及FSP治疗后，显著提高了E钙粘蛋白在小鼠肠道内的表达，其中SL提高了160.6％，FSP组提高了112.4％。

由图4中c可知，用灰度值测试蛋白质印迹法中钙粘蛋白N的具体倍数变化，与空白组进行比较，经过SL以及FSP治疗后，显著降低了N钙粘蛋白在小鼠肠道内的表达，其中SL降低了32.2％，FSP组降低了48.6％。

将实施例1和实施例2的组合物灌胃小鼠后，测试其对小鼠血液中丁酸和异丁酸的变化情况。如图5中a和b可知，与空白组进行比较，经过SL以及FSP治疗后，可明显提高丁酸及异丁酸在小鼠血液中的含量，其中SL组，丁酸提高了11.7％，异丁酸提高了25.2％；FSP组，丁酸提高了25.1％，异丁酸提高了48.2％。

Claims

1.一种提高细胞紧密连接蛋白表达的组合物，其特征在于，所述组合物包含槐花提取物、金银花提取物或栀子提取物中的至少两种。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物，包含槐花提取物，还包括金银花提取物或/和栀子提取物。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，按重量百分数计，所述槐花提取物的质量为所述组合物的质量的30-70％。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，若含，则所述槐花提取物、金银花提取物和栀子提取物分别独立采用水或/和醇浸提得到。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述槐花提取物、金银花提取物和栀子提取物分别独立采用乙醇水溶液浸提得到。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分数为50％-95％。

7.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述槐花提取物的制备方法如下：称取药材，粉碎，用乙醇水溶液提取，过滤，得浸提液；除去乙醇后，用大孔树脂吸附，洗脱，收集洗脱液，除去洗脱液中的乙醇，即得所述槐花提取物。

8.权利要求1-7中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.权利要求1-7中任一项所述的组合物在制备药物或饲料中的应用。

10.一种药物，其特征在于，所述药物含权利要求1-7中任一项所述的组合物及在药学上可接受的辅料。