CN111606964A - 一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法 - Google Patents

一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111606964A
CN111606964A CN202010256173.5A CN202010256173A CN111606964A CN 111606964 A CN111606964 A CN 111606964A CN 202010256173 A CN202010256173 A CN 202010256173A CN 111606964 A CN111606964 A CN 111606964A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
hairy
hairy roots
roots
momordica grosvenori
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010256173.5A
Other languages
English (en)
Inventor
张淑丽
朱云美
唐燕萍
陈明
黄清坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Damin Foodstuff Zhangzhou Co ltd
Original Assignee
Damin Foodstuff Zhangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Damin Foodstuff Zhangzhou Co ltd filed Critical Damin Foodstuff Zhangzhou Co ltd
Priority to CN202010256173.5A priority Critical patent/CN111606964A/zh
Publication of CN111606964A publication Critical patent/CN111606964A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J17/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, having an oxygen-containing hetero ring not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J17/005—Glycosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，包括，批量生产罗汉果毛状根，其中，所述的批量生产罗汉果毛状，按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数；从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液；干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷。本发明通过罗汉果毛状根培育工艺与罗汉果苷提取工艺相结合，极大缩短了从罗汉果到罗汉果苷的周期时间，将罗汉果常规种植从种苗培育至采收需要约300天，缩短到罗汉果毛状根50～68天/批的生产周期，极大提高生产效率，同时，在工业生产中可操作性强。

Description

一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法
技术领域
本发明涉及一种罗汉果苷的生产方法，特别是涉及一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法。
背景技术
罗汉果苷是罗汉果的主要有效成分，现代药理学研究表明，罗汉果苷具有止咳祛痰、润肠通便等功效。同时，罗汉果苷是一种低热量高甜度的天然甜味剂，用途非常广泛。
而现有技术中，发明人研究发现现有技术中罗汉果苷制取存在如下问题：
(1)罗汉果苷只从罗汉果果实中提取，罗汉果常规种植从种苗培育至采收需要约300天，鲜果果实中罗汉果苷含量约为0.3～0.4％；干重果实中罗汉果苷含量约为1.5％。
(2)罗汉果本身生长周期长，不利于罗汉果苷的生产效率提高，难以满足市场需求。
通过研究后，发明人提出一种新的罗汉果苷生产方法，可以达到缩短罗汉果苷生产周期的效果。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，利用批量的毛状根生产，进而提取罗汉果苷，颠覆传统的罗汉果苷的生产方法。
本发明的技术方案内容如下：
一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，包括，
批量生产罗汉果毛状根，其中，所述的批量生产罗汉果毛状，按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数；
从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液；
干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷。
进一步的，所述的按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数，在超净工作台完成，包括，培育毛状根种子，以及所述的毛状根种子经过至少两级培养。
进一步的，所述的培育毛状根种子，包括：制备工程菌液；其中，所述的制备工程菌液，在20ml发根农杆菌(YEB)液体培养基中，接种单菌落的发根农杆菌，摇床环境控制28℃，150r/min，4～5小时；当菌液浓度光密度(OD)值达到0.4～0.6，取1ml该菌液，转接到50ml发根农杆菌(YEB)液体培养基中，再次在28℃，110～150r/min的摇床环境12小时培育后，当菌液浓度光密度(OD)值达到0.5～0.7，即制得工程菌液。
进一步的，所述的发根农杆菌，选自发根农杆菌A4、发根农杆菌15834任一种使用。
进一步的，所述的培育毛状根种子，还包括：处理罗汉果无菌外植体；其中，所述的处理罗汉果无菌外植体，取罗汉果外植体经过20天培养成无菌苗，再将无菌苗的根、茎处理成5～10mm段状，无菌苗的叶片处理成50～100mm2叶段，得到无菌外植体。
进一步的，所述的培育毛状根种子，还包括，所述的培育无菌外植体获得批量毛状根种子；其中，所述的培育无菌外植体获得批量毛状根种子，包括：
第一步骤，将无菌外植体接种到工程菌液中，控制摇床30～50r/min，浸染4～8min，取出无菌外植体用无菌滤纸吸干其表面菌液；
第二步骤，将表面菌液干燥后的无菌外植体，接种在不含激素的MS固体培养基，并放在28℃控温培养箱进行无发根农杆菌暗培养，暗培养时间2～5天；其中，所述的无发根农杆菌暗培养是当外植体表面出现发根农杆菌菌落，将无菌外植体取出在无菌水中清洗2～3遍，再接种到新的不含激素的MS固体培养基中进行暗培养；
第三步骤，无菌外植体长出毛状根，待毛状根长10～30mm，剪下毛状根，接种在MS固体培养基进行暗培养；当毛状根长＞100mm，将毛状根剪下，接种在20ml的MS液体培养基中控制摇床环境28℃，100～120r/min，再次暗培养20天，长出批量的白色毛状根即为毛状根种子。
进一步的，所述的毛状根种子经过至少两级培养，包括，一级培养和二级培养；其中，所述的一级培养，将毛状根种子按照2～5g/L的接种量，接种到一级培养基，获得罗汉果毛状根一级种子；所述的二级培养是发酵培养，将罗汉果毛状根一级种子按照5～10g/L的接种量接种到二级培养基进行发酵培养获得罗汉果毛状根。
进一步的，所述的一级培养，控制摇床110r/min，温度25～28℃，避光培养30～40天；所述的一级培养基是30～50ml的培养液，所述的培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖的MS培养液；所述的二级培养，控制摇床110r/min，温度20～28℃，避光培养40～60天，收获罗汉果毛状根；所述的二级培养基是100ml的培养液，所述的培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖以及0.05-0.3mmol/L水杨酸的MS培养液。
进一步的，所述的从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液，将收获的罗汉果毛状根加入到其质量10～15倍的水，煎煮3次，每次20分钟，过滤收集罗汉果苷滤液。
进一步的，所述的干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷，罗汉果苷滤液干燥浓缩1/3～2/3获得罗汉果苷。
本技术方案具有如下技术效果：
1.本发明通过罗汉果毛状根培育工艺与罗汉果苷提取工艺相结合，极大缩短了从罗汉果到罗汉果苷的周期时间，将罗汉果常规种植从种苗培育至采收需要约300天，缩短到罗汉果毛状根50～68天/批的生产周期，极大提高生产效率，同时，在工业生产中可操作性强。
2.本发明通过按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数，适用性较强，能够实现快速生产毛状根，以及及时调整与控制毛状根的生产规模。
3.本发明通过毛状根发酵培养与提取罗汉果苷的生产工艺相结合，所得罗汉果毛状根罗汉果苷的含量是0.8～1.2％。
4.本发明通过罗汉果毛状根生产罗汉果苷工艺，利用培养条件的优化，尤其是在培育过程中控制毛状根生长，促进罗汉果醇的合成，进而使得毛状根能够提取更高比例的罗汉果苷。
5.本发明通过发酵培养毛状根进而提取罗汉果苷，在生产过程中，避免受自然条件影响，不占用土地资源，产品质量可控，且无农药残留，保证提取罗汉果苷的质量、产品、安全等方面的可靠性。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的技术方案内容，以下通过实施应用对本发明的进行说明，需要说明的是，本发明的技术方案及技术特征，在不产生冲突的情况下，是可以相互结合使用的。
本发明之一实施例中，一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，包括，
批量生产罗汉果毛状根，其中，所述的批量生产罗汉果毛状，按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数；
从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液；
干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷。在本实施例中，通过罗汉果毛状根培育工艺与罗汉果苷提取工艺相结合，极大缩短了从罗汉果到罗汉果苷的周期时间，将罗汉果常规种植从种苗培育至采收需要约300天，缩短到罗汉果毛状根50～68天/批的生产周期，极大提高生产效率，同时，在工业生产中可操作性强；按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数，适用性较强，能够实现快速生产毛状根，以及及时调整与控制毛状根的生产规模；利用毛状根发酵培养与提取罗汉果苷的生产工艺相结合，所得罗汉果毛状根罗汉果苷的含量是0.8～1.2％；利用培养条件的优化，尤其是在培育过程中控制毛状根生长，促进罗汉果醇的合成，进而使得毛状根能够提取更高比例的罗汉果苷；通过发酵培养毛状根进而提取罗汉果苷，在生产过程中，避免受自然条件影响，不占用土地资源，产品质量可控，且无农药残留，保证提取罗汉果苷的质量、产品、安全等方面的可靠性。
本发明之一实施例中，所述的按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数，在超净工作台完成，包括，培育毛状根种子，以及所述的毛状根种子经过至少两级培养。在本实例中，毛状根种子的培养设置在超净工作台完成，通过培育毛状根种子，以及至少经过两级培养对毛状根种子进行规模化扩大培植，但不仅限于两级培养，通过对培养级数的增加，可以扩大发酵培养规模，且通过培养级数的增加能够实现发酵培养规模呈线性化趋势递增；因此，通过该技术方案，能够实现对毛状根发酵培养规模的可控性操作。
本发明之一实施例中，所述的培育毛状根种子，包括：制备工程菌液；其中，所述的制备工程菌液，在20ml发根农杆菌(YEB)液体培养基中，接种单菌落的发根农杆菌，摇床环境控制28℃，150r/min，4～5小时；当菌液浓度光密度(OD)值达到0.4～0.6，取1ml该菌液，转接到50ml发根农杆菌(YEB)液体培养基中，再次在28℃，110～150r/min的摇床环境12小时培育后，当菌液浓度光密度(OD)值达到0.5～0.7，即制得工程菌液。在本实施例中，通过工程菌液的制备为培育毛状根种子提供可靠的营养成分以及适合的生长环境，为培育毛状根种子的可控性提供充分保障。
本发明之一实施例中，所述的发根农杆菌，选自发根农杆菌A4、发根农杆菌15834任一种使用。在本实施例中，能够使用发根农杆菌A4、发根农杆菌15834的任一种对毛状根种子进行培育。
本发明之一实施例中，所述的培育毛状根种子，还包括：处理罗汉果无菌外植体；其中，所述的处理罗汉果无菌外植体，取罗汉果外植体经过20天培养成无菌苗，再将无菌苗的根、茎处理成5～10mm段状，无菌苗的叶片处理成50～100mm2叶段，得到无菌外植体。在本实施例中，利用罗汉果无菌外植体作为培育毛状根种子的母株体，根、茎、叶皆可以作为培育母株体，选材范围宽，降低培育毛状根种子的条件；同时，经过预处理后的根、茎、叶，能够控制在培育后最大化获得毛状根种子。
本发明之一实施例中，所述的培育毛状根种子，还包括，所述的培育无菌外植体获得批量毛状根种子；其中，所述的培育无菌外植体获得批量毛状根种子，包括：
第一步骤，将无菌外植体接种到工程菌液中，控制摇床30～50r/min，浸染4～8min，取出无菌外植体用无菌滤纸吸干其表面菌液；
第二步骤，将表面菌液干燥后的无菌外植体，接种在不含激素的MS固体培养基，并放在28℃控温培养箱进行无发根农杆菌暗培养，暗培养时间2～5天；其中，所述的无发根农杆菌暗培养是当外植体表面出现发根农杆菌菌落，将无菌外植体取出在无菌水中清洗2～3遍，再接种到新的不含激素的MS固体培养基中进行暗培养；
第三步骤，无菌外植体长出毛状根，待毛状根长10～30mm，剪下毛状根，接种在MS固体培养基进行暗培养；当毛状根长＞100mm，将毛状根剪下，接种在20ml的MS液体培养基中控制摇床环境28℃，100～120r/min，再次暗培养20天，长出批量的白色毛状根即为毛状根种子。在本实施例中，利用对毛状根种子培育过程的控制菌落对毛状根种子的影响，避免种子在培育过程出现腐烂，甚至是培育失败的现象。
本发明之一实施例中，所述的毛状根种子经过至少两级培养，包括，一级培养和二级培养；其中，所述的一级培养，将毛状根种子按照2～5g/L的接种量，接种到一级培养基，获得罗汉果毛状根一级种子；所述的二级培养是发酵培养，将罗汉果毛状根一级种子按照5～10g/L的接种量接种到二级培养基进行发酵培养获得罗汉果毛状根。在本实施例中，通过两级培养实现对毛状根的批量化培养生产，利用接种量的逐级扩大，进而扩大毛状根的发酵培养规模，最后收获毛状根，实现毛状根在批量化生产过程中的可控性操作。
本发明之一实施例中，所述的一级培养，控制摇床110r/min，温度25～28℃，避光培养30～40天；所述的一级培养基是30～50ml的培养液，所述的培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖的MS培养液；所述的二级培养，控制摇床110r/min，温度20～28℃，避光培养40～60天，收获罗汉果毛状根；所述的二级培养基是100ml的培养液，所述的培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖以及0.05-0.3mmol/L水杨酸的MS培养液。在本实施例中，对二级培养过程中，培养基成分进行控制，以及培养过程中的操作控制，将毛状根的发酵培养向预期方向进行；同时，通过在二级培养过程中，加入葡萄糖，有利于毛状根对糖的利用，促进罗汉果醇的合成，进而使得毛状根具有更高的罗汉果苷含量；水杨酸的添加能够激发毛状根内源激素，进而激活毛状根自身的内源生长激素，促进毛状根种子快速生长。
本发明之一实施例中，所述的从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液，将收获的罗汉果毛状根加入到其质量10～15倍的水，煎煮3次，每次20分钟，过滤收集罗汉果苷滤液。在本实施例中，利用对毛状根的多次煎煮，实现最大化收集罗汉果滤液，避免罗汉果苷残留在毛状根。
本发明之一实施例中，所述的干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷，罗汉果苷滤液干燥浓缩1/3～2/3获得罗汉果苷。在本实施例中，通过对浓缩干燥罗汉果苷滤液的份量控制，避免过度干燥而影响罗汉果苷产品质量。
为了更加详细说明本发明的技术方案内容，以下结合实施例进行说明。需要说明的是本发明的固态MS培养基是在液态MS培养基的组份中加入琼脂粉，凝固而成，液态MS培养基组份详见下表1～4。
实施例1
一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，包括，批量生产罗汉果毛状根，其中，批量生产罗汉果毛状，按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数；从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液；干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷。
按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数，在超净工作台完成，包括，培育毛状根种子，以及毛状根种子经过两级培养。
培育毛状根种子，包括：制备工程菌液；其中，制备工程菌液，在20ml发根农杆菌(YEB)A4(或发根农杆菌15834)液体培养基中，接种单菌落的发根农杆菌，摇床环境控制28℃，150r/min，4～5小时；当菌液浓度光密度(OD)值达到0.4～0.6，取1ml该菌液，转接到50ml发根农杆菌(YEB)A4(或发根农杆菌15834)液体培养基中，再次在28℃，110～150r/min的摇床环境12小时培育后，当菌液浓度光密度(OD)值达到0.5～0.7，即制得工程菌液。
培育毛状根种子，还包括：处理罗汉果无菌外植体；其中，处理罗汉果无菌外植体，取罗汉果外植体经过20天培养成无菌苗，再将无菌苗的根、茎处理成5～10mm段状，无菌苗的叶片处理成50～100mm2叶段，得到无菌外植体。
培育毛状根种子，还包括，培育无菌外植体获得批量毛状根种子；其中，培育无菌外植体获得批量毛状根种子，包括：
第一步骤，将无菌外植体接种到工程菌液中，控制摇床30～50r/min，浸染4～8min，取出无菌外植体用无菌滤纸吸干其表面菌液；
第二步骤，将表面菌液干燥后的无菌外植体，接种在不含激素的MS固体培养基，并放在28℃控温培养箱进行无发根农杆菌暗培养，暗培养时间2～5天；其中，无发根农杆菌暗培养是当外植体表面出现发根农杆菌菌落，将无菌外植体取出在无菌水中清洗2～3遍，再接种到新的不含激素的MS固体培养基中进行暗培养；
第三步骤，无菌外植体长出毛状根，待毛状根长10～30mm，剪下毛状根，接种在MS固体培养基进行暗培养；当毛状根长＞100mm，将毛状根剪下，接种在20ml的MS液体培养基中控制摇床环境28℃，100～120r/min，再次暗培养20天，长出批量的白色毛状根即为毛状根种子。
毛状根种子经过两级培养，包括，一级培养和二级培养，获得罗汉果毛状根。
一级培养，在50ml的锥形瓶中，将毛状根种子按照2～5g/L的接种量，接种到一级培养基，控制摇床110r/min，温度25～28℃，避光培养30～40天，获得罗汉果毛状根一级种子；一级培养基是30～50ml的培养液，培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖的MS培养液，MS培养液组份具体如下表1～4所列的组份进行混合而成。
二级培养是发酵培养，在200ml的锥形瓶中，将罗汉果毛状根一级种子按照5～10g/L的接种量接种到二级培养基，控制摇床110r/min，温度20～28℃，避光培养40～60天，进行发酵培养获得罗汉果毛状根；二级培养基是100ml的培养液，培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖以及0.05～0.3mmol/L水杨酸的MS培养液，MS培养液组份具体如下表1～4所列的组份进行混合而成。收获得到罗汉果毛状根质量见下表5。
Figure BDA0002437407650000071
表1大量元素母液(配1L20倍的母液)
Figure BDA0002437407650000072
表2微量元素母液(配制1L100倍的母液)
Figure BDA0002437407650000073
表3铁盐母液(配1L200倍母液)
Figure BDA0002437407650000081
表4有机物母液(配制1L100倍母液)
从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液，将收获的罗汉果毛状根加入到其质量10～15倍的水，煎煮3次，每次20分钟，过滤收集罗汉果苷滤液。
干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷，罗汉果苷滤液干燥浓缩1/3～2/3获得罗汉果苷，收获到的罗汉果苷质量见下表5。
与上述实施例制备过程相同，在毛状根种子两级培养过程中，仅加入相应组份的葡萄糖作为实施例2；而两级培养过程中不添加葡糖糖和水杨酸组份的作为实施例3。将实施例1～3进行对比后，具有如下参数特征：
项目名称 获得毛状根质量(g) 总生长天数(天) 提取的罗汉果苷质量(g)
实施例1 25.9 60 0.09712
实施例2 18.9 60 0.07088
实施例3 10.6 60 0.03975
表5
上述实施例1～3中，接种量都是8克，本发明的技术方案中，在MS培养基中加入特殊的组份，同时结合毛状根的培育生产方案，提高罗汉果毛状根的产量，进而提高罗汉果苷的产量。

Claims (10)

1.一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：包括，
批量生产罗汉果毛状根，其中，所述的批量生产罗汉果毛状，按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数；
从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液；
干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷。
2.根据权利要求1所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的按照罗汉果毛状根发酵培养规模确定罗汉果毛状根种子的培养级数，在超净工作台完成，包括，培育毛状根种子，以及所述的毛状根种子经过至少两级培养。
3.根据权利要求2所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的培育毛状根种子，包括：制备工程菌液；其中，所述的制备工程菌液，在20ml发根农杆菌(YEB)液体培养基中，接种单菌落的发根农杆菌，摇床环境控制28℃，150r/min，4～5小时；当菌液浓度光密度(OD)值达到0.4～0.6，取1ml该菌液，转接到50ml发根农杆菌(YEB)液体培养基中，再次在28℃，110～150r/min的摇床环境12小时培育后，当菌液浓度光密度(OD)值达到0.5～0.7，即制得工程菌液。
4.根据权利要求3所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的发根农杆菌，选自发根农杆菌A4、发根农杆菌15834任一种使用。
5.根据权利要求3所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的培育毛状根种子，还包括：处理罗汉果无菌外植体；其中，所述的处理罗汉果无菌外植体，取罗汉果外植体经过20天培养成无菌苗，再将无菌苗的根、茎处理成5～10mm段状，无菌苗的叶片处理成50～100mm2叶段，得到无菌外植体。
6.根据权利要求5所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的培育毛状根种子，还包括，所述的培育无菌外植体获得批量毛状根种子；其中，所述的培育无菌外植体获得批量毛状根种子，包括：
第一步骤，将无菌外植体接种到工程菌液中，控制摇床30～50r/min，浸染4～8min，取出无菌外植体用无菌滤纸吸干其表面菌液；
第二步骤，将表面菌液干燥后的无菌外植体，接种在不含激素的MS固体培养基，并放在28℃控温培养箱进行无发根农杆菌暗培养，暗培养时间2～5天；其中，所述的无发根农杆菌暗培养是当外植体表面出现发根农杆菌菌落，将无菌外植体取出在无菌水中清洗2～3遍，再接种到新的不含激素的MS固体培养基中进行暗培养；
第三步骤，无菌外植体长出毛状根，待毛状根长10～30mm，剪下毛状根，接种在MS固体培养基进行暗培养；当毛状根长＞100mm，将毛状根剪下，接种在20ml的MS液体培养基中控制摇床环境28℃，100～120r/min，再次暗培养20天，长出批量的白色毛状根即为毛状根种子。
7.根据权利要求2所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的毛状根种子经过至少两级培养，包括，一级培养和二级培养；其中，所述的一级培养，将毛状根种子按照2～5g/L的接种量，接种到一级培养基，获得罗汉果毛状根一级种子；所述的二级培养是发酵培养，将罗汉果毛状根一级种子按照5～10g/L的接种量接种到二级培养基进行发酵培养获得罗汉果毛状根。
8.根据权利要求7所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的一级培养，控制摇床110r/min，温度25～28℃，避光培养30～40天；所述的一级培养基是30～50ml的培养液，所述的培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖的MS培养液；所述的二级培养，控制摇床110r/min，温度20～28℃，避光培养40～60天，收获罗汉果毛状根；所述的二级培养基是100ml的培养液，所述的培养液是在灭菌放量后添加25～30g/L葡萄糖以及0.05-0.3mmol/L水杨酸的MS培养液。
9.根据权利要求1所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的从罗汉果毛状根提取罗汉果苷滤液，将收获的罗汉果毛状根加入到其质量10～15倍的水，煎煮3次，每次20分钟，过滤收集罗汉果苷滤液。
10.根据权利要求1所述的一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法，其特征在于：所述的干燥浓缩罗汉果苷滤液获得罗汉果苷，罗汉果苷滤液干燥浓缩1/3～2/3获得罗汉果苷。
CN202010256173.5A 2020-04-02 2020-04-02 一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法 Pending CN111606964A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010256173.5A CN111606964A (zh) 2020-04-02 2020-04-02 一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010256173.5A CN111606964A (zh) 2020-04-02 2020-04-02 一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111606964A true CN111606964A (zh) 2020-09-01

Family

ID=72205569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010256173.5A Pending CN111606964A (zh) 2020-04-02 2020-04-02 一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111606964A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101297852A (zh) * 2007-04-30 2008-11-05 周英 从罗汉果植株中提取降血糖和抗糖尿病的活性组合物及其提取方法
CN101869591A (zh) * 2010-06-03 2010-10-27 新疆农业大学 利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101297852A (zh) * 2007-04-30 2008-11-05 周英 从罗汉果植株中提取降血糖和抗糖尿病的活性组合物及其提取方法
CN101869591A (zh) * 2010-06-03 2010-10-27 新疆农业大学 利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
曾黎辉 等: "罗汉果遗传转化受体再生体系的建立及发根农杆菌转化初探", 《中国农学通报》, vol. 21, no. 12, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 403 - 406 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103843662B (zh) 一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法
CN1704469A (zh) 一种中国冬虫夏草真菌的生产方法
CN105850750A (zh) 甜叶菊新品种814011谱星3号及高rm含量甜菊糖苷的制备
AU2020102508A4 (en) A one-step seedling culture medium for in vitro culture of Cyperus esculentus L.
JP2002233258A (ja) 組織培養による人参・樟脳参・山参の不定根の大量増殖方法およびサポニン含量の改善方法
CN109220747A (zh) 一种蕹菜水培方法
CN106278466B (zh) 一种茶树菇栽培基质及其制备与栽培方法
CN102277299B (zh) 一种微生物发酵培养基的制备方法
CN110229757B (zh) 一株有效促进作物生长的桔绿木霉js84及其研制的生物有机肥
CN112772409A (zh) 一种培育玉米新品种的方法
CN112544342A (zh) 一种高效中华鹅膏菌专用培养基及其制备方法与应用
CN109880789B (zh) 一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法
CN111606964A (zh) 一种用罗汉果毛状根生产罗汉果苷的方法
CN110622862A (zh) 一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法
CN112154919B (zh) 一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基及方法
CN114931079A (zh) 内生真菌p-b313在提高石斛耐低磷胁迫中的应用
CN113994866A (zh) 一种人工腐殖质改良水稻育秧土的方法
CN113940271A (zh) 一种抗寒柱花草的选育繁殖方法
CN106256805A (zh) 一种紫鹃茶育苗栽培基质及其制备方法
CN106834145B (zh) 促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法
CN110876322A (zh) 一种高温型口蘑的选育与栽培工艺
CN110839481A (zh) 一种香菇培养基及其制备方法
CN107721536A (zh) 一种促进平菇菌丝生长及出菇的复合原料
CN110218657B (zh) 一株长枝木霉md30及其研制的生物有机肥
CN111471618B (zh) 一种金线莲共生菌的提取及纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200901

RJ01 Rejection of invention patent application after publication