CN111603554A - 一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法及应用，包括以下步骤：1)获得离体肿瘤组织并分离提取出原代肿瘤细胞,2)将所述步骤1)得到的原代肿瘤细胞收集后进行放疗处理,3)将步骤2)得到的放疗后的细胞进行破碎、梯度离心，收集携带放疗诱导产生的新抗原的肿瘤细胞细胞膜，即为抗肿瘤疫苗抗原原料。本发明提供的抗肿瘤疫苗抗原原料可用于制备抗肿瘤疫苗,使用放疗后产生的抗原用于疫苗抗原，可提升肿瘤疫苗的治疗效果,突破常规肿瘤疫苗的局限性。
Description
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤疫苗制备技术领域，具体涉及一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法及应用。
背景技术：
在免疫治疗领域，以疫苗为基础的治疗方法是一种效果显著的治疗手段，因为疫苗疗法可以诱导和扩增针对抗原的免疫细胞，细菌类和病毒类疫苗已经拯救了数千万人类的性命。然而，肿瘤疫苗的研发和治疗效果并没有达到理想中的预期，原因是因为不同个体内的肿瘤细胞具有不同的抗原蛋白表达谱，而不同个体的免疫细胞也具有不同的免疫细胞应答谱，因此在疫苗的设计过程中抗原的选择方案难以统一，并且肿瘤细胞具有免疫逃逸能力，一旦个体的肿瘤细胞下调或沉默疫苗相关抗原，则会导致已经设计好的肿瘤疫苗很难再次发挥作用，因此，如何设计理想的肿瘤疫苗显得尤为重要。
专利号为ZL200910204848.5的专利通过裂解耐受性肿瘤细胞得到肿瘤细胞抗原组合物，将树突状细胞与耐受性肿瘤细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗癌树突状细胞，由于肿瘤细胞经过了射线照射和/或化疗药物的筛选，由此得到的肿瘤细胞产生了与肿瘤细胞不同的变化(比如特异表达了许多不同于肿瘤细胞的蛋白)，更接近接受过放疗和/或化疗的癌症内的肿瘤细胞，因此，由该耐受性肿瘤细胞得到的抗原组合物制备的药物，能够在体内和体外杀死引起癌症复发的肿瘤细胞。但是这种方式只能用于已发癌症的治疗中，可以防止癌症复发，无法用于癌症的预防免疫治疗，且耐受性肿瘤细胞抗原组合物的提取和筛选操作比较复杂，在应用上存在较多局限性。
肿瘤疫苗在设计过程中主要分为四个要素，分别是抗原、制剂、佐剂和递送载体，抗原选择是最关键的一环。在放疗过程中，经过X射线照射后的肿瘤细胞会发生DNA断裂，一部分肿瘤细胞会发生单链断裂或间隔一定距离的双链DNA断裂，这些断裂的DNA很容易以对侧的互补链为模板使损伤得到修复，在这期间，如果产生错误和失败的修复就会造成DNA突变从而导致新抗原的形成，还有一部分肿瘤细胞的DNA断裂会发生在对侧互补碱基或仅仅间隔几个碱基对的位置上，这种双链的断裂不仅会导致DNA突变，还会导致细胞以凋亡，坏死或自噬等方式死亡，在濒临死亡的细胞中，由钙网蛋白和二硫化物异构酶组成的内质网蛋白复合物会向细胞膜表面转移，这些内质网蛋白复合物会募集巨噬细胞和树突细胞向其周边聚集并对其吞噬，与此同时，放疗后的肿瘤细胞表面还会过表达大量的MHC I和抗原肽的复合物，这些抗原肽绝大部分都是放疗产生的新抗原，将此类新抗原应用于抗肿瘤疫苗中可提升肿瘤疫苗的抗肿瘤效果，并突破常规肿瘤疫苗易产生免疫逃逸的局限性。
发明内容：
(一)解决的技术问题
本发明旨在提供一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法及应用，用于抗肿瘤疫苗的制造，解决现有技术中肿瘤细胞抗原组合物的提取和制备较为复杂，存在易发生免疫逃逸的局限性的问题。
(二)技术方案：
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，包括以下步骤：
1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
2)将所述步骤1)得到的所述原代肿瘤细胞进行放疗处理，收集放疗后肿瘤细胞；
3)将所述步骤2)中收集到的放疗后的所述肿瘤细胞进行破碎、梯度离心，即得到抗肿瘤疫苗抗原原料。
所述步骤3)中进行破碎的方式包括冻融细胞破碎法、低渗张力溶液细胞破碎法和超声细胞破碎法。所述梯度离心包括第一离心和第二离心，其中第一离心转速为500-2000g，时间为20分钟，获得上清，再将所得上清进行第二离心，第二离心的转速为12000-120000g，时间为60分钟，去上清后得沉淀即为所述抗肿瘤疫苗抗原原料。
所述步骤2)中采用X线放疗，X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV，收集放疗后所述肿瘤细胞时间为1-8天。
所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。
所述肿瘤细胞系包括人源性和鼠源性的细胞系，人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100,人肺癌细胞系A549、H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系HONE1，小鼠黑色素瘤细胞系B16，小鼠肺癌细胞系Lewis细胞。
所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。
所述抗肿瘤疫苗抗原原料为卸载新抗原蛋白的磷脂结构，所述抗肿瘤疫苗抗原原料的携载蛋白量不低于将未经放疗的所述原代肿瘤细胞进行破碎、梯度离心后所得到抗原原料的携载蛋白量。
所述抗肿瘤疫苗抗原原料在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
(三)有益效果：
相对于现有技术，本发明产生的有益效果是：通过对离体肿瘤细胞进行培养获得的原代肿瘤细胞进行放疗处理后，将收集到的放疗后的肿瘤细胞进行破碎、梯度离心，得到抗肿瘤疫苗抗原原料，由于抗肿瘤疫苗抗原原料来源于放疗处理后的肿瘤细胞，具有强烈的免疫刺激性，可以有效的在体内外促进骨髓来源树突细胞成熟，可皮下接种，也可以静脉全身接种，其免疫刺激原理主要涉及MHC I和CRT蛋白的高表达，所获得的抗肿瘤疫苗抗原原料生物安全性和生物相容性好，可以联合载药纳米粒子制备纳米抗肿瘤疫苗，提取和制备过程简单，不易发生免疫逃逸。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例二中经受不同放疗剂量的肿瘤细胞CRT表达和MHCI表达的对照图；
图2是本发明实施例二中抗肿瘤疫苗抗原原料表面CRT和MHC I的表达实验定量对照图；
图3是本发明实施例三中抗肿瘤疫苗抗原原料针对骨髓来源树突细胞的刺激效应实验对照图；
图4是本发明实施例三中抗肿瘤疫苗抗原原料针对骨髓来源树突细胞的刺激效应实验定量对照图；
图5是本发明实施例四中接种抗肿瘤疫苗抗原原料的小鼠免疫评价实验对照图；
图6是本发明实施例四中接种抗肿瘤疫苗抗原原料的小鼠免疫评价实验对照图；
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
放疗可以直接导致肿瘤细胞以凋亡，坏死和自噬等方式死亡，这些死亡方式，都会促进肿瘤细胞释放肿瘤特异性抗原，增加免疫细胞发现癌细胞的机会。在濒临死亡的细胞中，由钙网蛋白和二硫化物异构酶组成的内质网蛋白复合物向细胞膜表面迁移，募集巨噬细胞和DC细胞向其周边聚集并对其进行吞噬，钙网蛋白促进APC内部炎症因子如IL-6及TNF-a的产生，放疗杀伤的肿瘤细胞会释放损伤相关模式分子(DAMPs)，包括三磷酸腺苷ATP和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)，这类分子通过信号传导通路，促进DC成熟，使其具有更有效抗原提呈能力，放疗还可以直接破坏细胞的DNA，让肿瘤细胞产生新抗原，这也会引发免疫应答，放疗也可以上调肿瘤MHC I的表达，从而能够更好地呈递肿瘤特异性抗原，增强肿瘤对细胞毒性T细胞的可见性。收集放疗后携载MHC I等蛋白的磷脂碎片，会成为新抗原肿瘤疫苗制备的最佳原料，实现抗肿瘤预防和治疗的目的。
实施例一：抗肿瘤疫苗抗原原料的制备以及保存方法
在10mm×10mm的培养皿中用10％FBS(胎牛血清)的培养基培养肿瘤细胞，待皿中细胞达到约5×106个时，使用X射线以20GY的剂量进行照射，照射后的第3天收集培养皿内的细胞，破碎细胞后采用梯度离心法进行离心，首先以2000g离心20min后取上清，再将上清14000g离心60min，弃上清，所得沉淀即是肿瘤疫苗抗原原料。
将所获得的沉淀用生理盐水洗涤两遍，以1mlPBS(磷酸缓冲盐)溶液重悬后4℃保存，取100μl液体离心后，加入适量蛋白裂解液，0℃充分裂解30min后，12000g离心30min，取上清加入BCA定量液进行蛋白定量，多余的抗肿瘤疫苗抗原原料冻干保存在-70℃冰箱中。
实施例二：抗肿瘤疫苗抗原原料表面MHC I和CRT的表达实验。
实验步骤：
(1)鼠源性肺腺癌细胞Lewis接受X射线8Gy、20Gy、8*3Gy照射；
(2)加入胰蛋白消化酶将各分组细胞消化成单细胞悬液收集至EP管；
(3)放入低速离心机以1000rpm/5min速度进行离心，离心完毕后弃上清，加入1mLPBS缓冲液，混匀后再次以1000rpm/5min速度离心3次，弃上清，用200μL PBS缓冲液重悬，加入流式管中并做好标记；
(4)在各个流式管中分别加入1μ抗体(CRT:FITC，MHC-I:FITC)4℃避光孵育20min；
(5)加入1mL PBS缓冲液，混匀后以1000rpm/5min速度离心3次，弃上清，加入200μ的PBS重悬，上机检测。
实验结论：20Gy放疗剂量更适用于制备肿瘤疫苗原料。
实施例三：抗肿瘤疫苗抗原原料针对骨髓来源树突细胞的刺激效应实验。
实验步骤：
(1)鼠源性肺腺癌细胞Lewis铺至6孔板，并接受8Gy、20Gy、8*3Gy照射；
(2)提取对照组以及各放疗组细胞，使用超声手段破碎细胞，然后以2000rpm/10min速度进行离心，弃沉淀取上清后，以10000rpm离心60min获取沉淀即为肿瘤细胞膜；
(3)提取小鼠骨髓来源的单核细胞并用GM-CSF分化诱导形成DC细胞；
(4)将每100万肿瘤细胞所提取的肿瘤细胞膜加至50万DC细胞中共培养6h后收集DC细胞至干净EP管中；
(5)放入低速离心机以1000rpm/5min速度进行离心，离心完毕后弃上清，加入1mLPBS缓冲液，混匀后以1000rpm/5min速度离心3次，弃上清，用200μL PBS缓冲液重悬，加入流式管中并做好标记；
(6)在各个流式管中分别加入混合抗体(CD11c:FITC，MHC-II:PE，CD80:APC，CD86:APC-cy7)4℃避光孵育20min；
(7)加入1mL PBS缓冲液，混匀后以1000rpm/5min速度离心3次，弃上清，加入200μ的PBS重悬，上机检测。
实验结论：20Gy放疗剂量提取肿瘤疫苗原料可以成功刺激骨髓来源树突细胞成熟。
实施例四：接种抗肿瘤疫苗抗原原料的小鼠免疫评价实验。
实验步骤：
(1)鼠源性肺腺癌细胞接受20Gy放疗，24h后提取对照组与放疗组肿瘤细胞膜；
(2)利用BCA检测提取的各族肿瘤细胞膜总蛋白含量；
(3)根据BCA结果，按照10μg/只剂量，将所需量的细胞膜溶解至PBS中；
(4)向小鼠尾静脉注射包含细胞膜的PBS溶液；
(5)注射24小时后取出小鼠脾脏，研磨提取单细胞悬液，首先标记僵尸染料，后PBS重悬洗涤，离心取沉淀细胞，加入混合抗体(CD3:FITC，CD4:PE，CD8:BV510，CD69：APC)4℃避光孵育20min；
(6)加入1mL PBS缓冲液，混匀后以1000rpm/5min速度离心3次，弃上清，加入200μ的PBS重悬，上机检测。
实验结论：抗肿瘤疫苗抗原原料可以成功激活小鼠免疫响应。
综上所述，本发明提供的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，用于抗肿瘤疫苗的制造，解决现有技术中肿瘤细胞抗原组合物的提取和制备较为复杂，存在易发生免疫逃逸的局限性的问题。
上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
2)将所述步骤1)得到的所述原代肿瘤细胞进行放疗处理，收集放疗后肿瘤细胞；
3)将所述步骤2)中收集到的放疗后的所述肿瘤细胞进行破碎、梯度离心，即得到抗肿瘤疫苗抗原原料。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中进行破碎的方式包括冻融细胞破碎法、低渗张力溶液细胞破碎法和超声细胞破碎法。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中采用X线放疗，X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV，收集放疗后所述肿瘤细胞时间为1-8天。
4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于：所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于：所述肿瘤细胞系包括人源性和鼠源性的细胞系，人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100,人肺癌细胞系A549、H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系HONE1，小鼠黑色素瘤细胞系B16，小鼠肺癌细胞系Lewis细胞。
6.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于：所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。
7.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，其特征在于：所述抗肿瘤疫苗抗原原料为卸载新抗原蛋白的磷脂结构，所述抗肿瘤疫苗抗原原料的携载蛋白量不低于将未经放疗的所述原代肿瘤细胞进行破碎、梯度离心后所得到抗原原料的携载蛋白量。
8.权利要求1所述的一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法所制备的所述抗肿瘤疫苗抗原原料在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
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