CN111182918A - 用于激活免疫细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于激活对象的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使来自对象的免疫细胞穿过包含肿瘤细胞的免疫调节室，从而激活所述免疫细胞，并将激活的免疫细胞返回至所述对象。在一些实施方案中，所述方法还包括分离样品的含有免疫细胞的部分并使所述含有免疫细胞的部分穿过免疫调节室。本文还提供了治疗癌症的方法和诱导针对肿瘤的免疫应答的方法。

Description

用于激活免疫细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月4日提交的美国临时申请第62/541,402号的优先权，出于所有目的，将其公开内容通过引用整体并入本文中。

发明背景

免疫肿瘤学是癌症治疗前沿中快速发展的领域。与直接靶向恶性细胞的癌症疗法相反，免疫肿瘤学疗法激活身体的免疫系统以靶向和攻击肿瘤。已经开发了几种免疫肿瘤学方法，其包括免疫检查点抑制剂、疫苗接种、酶抑制、体外T细胞操作、肿瘤细胞死亡的诱导和双特异性T细胞接合剂。

检查点抑制剂(如CTLA-4、PD-1和PDL-1抑制剂)通常是阻断肿瘤细胞与使T细胞失活的受体结合的单克隆抗体。肿瘤细胞与肿瘤特异性免疫细胞之间的这种相互作用的破坏防止免疫细胞失活。靶向肿瘤细胞和免疫细胞相互作用需要在肿瘤微环境中存在浸润性淋巴细胞。

针对癌症的治疗性疫苗接种诱导和/或挽救针对肿瘤抗原的免疫应答，所述肿瘤抗原由肿瘤细胞表达或由抗原呈递细胞(APC)呈递。这种方法对于具有突变肽或异常的翻译后修饰的高度诱变的肿瘤通常是有效的。

酶抑制剂利用了以下事实：已确定代谢某些氨基酸在对癌症的免疫应答的调节中是关键的。吲哚胺-吡咯2,3-脱氧酶(IDO)已经显示诱导调节性T细胞(Treg)来抑制肿瘤微环境中的免疫应答。因此，正在探索IDO抑制作为免疫肿瘤学治疗选择。

患者T细胞的体外操作可被用于直接攻击肿瘤。过继细胞转移是这些方法中最古老的方法，并且涉及从身体去除T细胞，然后将其扩增和遗传修饰以产生具有特异性针对肿瘤相关抗原(TAA)的嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)，然后重新引入患者体内。预期基于CAR T细胞的免疫肿瘤学策略在治疗血液学肿瘤中是高度有效的，但是它们在处理实体肿瘤中的作用已经令人失望。

通过溶瘤病毒、局部放射疗法或化学疗法诱导肿瘤细胞死亡导致具有引起进一步肿瘤细胞杀伤的免疫应答的潜能的细胞毒性。双特异性T细胞接合剂是修饰的抗体，其作用是通过表面受体连接T细胞和肿瘤细胞，从而强制产生免疫识别。

上述疗法单独或组合的完全治疗潜力尚未实现。值得注意的是，尽管检查点抑制剂已经产生了对一些癌症显著的临床应答，但是大多数癌症患者对治疗没有应答，或者应答持续时间相对较短。考虑到免疫肿瘤学疗法仍然是非常新的和未被证实的，或者仅在患者的子集中成功，本领域仍然需要能够激活免疫细胞以治疗癌症和其它疾病的新的治疗方法。本发明满足了这种需要，并且还提供了相关的优点。

发明简述

在一个方面，本发明提供了用于激活对象的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)从所述对象中分离所述免疫细胞，

(b)使分离的免疫细胞穿过免疫调节室，从而使所述分离的免疫细胞暴露于肿瘤细胞并激活所述免疫细胞，其中所述免疫调节室包括固体支撑物和被限制在所述免疫调节室内的固体支撑物上的所述肿瘤细胞，和

(c)将激活的免疫细胞返回所述对象。

在一些实施方案中，所述方法是离体进行的。在其它实施方案中，所述方法增加所述对象的自体免疫应答。在一些其它实施方案中，所述方法减少或消除所述对象的全身治疗的副作用。在一些实施方案中，所述免疫细胞是白细胞或外周血单个核细胞(PBMC)。

在一些实施方案中，所述免疫调节室还包括被限制在所述固体支撑物上的基质细胞和/或基质成分。在其它实施方案中，所述免疫细胞包含在获自所述对象的全血样品中。在具体的实施方案中，使所述全血样品穿过所述免疫调节室。

在一些实施方案中，从所述全血样品中分离含有免疫细胞的部分，并且使所述全血样品的含有免疫细胞的部分通所述过免疫调节室。在一些情况下，使用过滤方法分离所述全血样品的含有免疫细胞的部分。在其它情况下，使用单采血液成分术分离所述全血样品的含有免疫细胞的部分。在一些实施方案中，通过使所述全血样品穿过与所述免疫调节室流体连通的分离装置来分离所述全血样品的含有免疫细胞的部分。在具体的实施方案中，在将所述全血样品的含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分返回所述对象之前，从所述全血样品的含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分中去除免疫抑制因子和/或对所述对象具有副作用的因子。

在一些实施方案中，所述免疫调节室还包括入口和/或出口。在具体的实施方案中，所述入口和/或所述出口与所述对象的血管系统、腹膜腔、胸膜腔或脑脊髓液(CSF)流体连通。在一些情况下，所述入口和/或出口与所述对象的静脉系统流体连通。在其它情况下，所述入口和/或出口与所述对象的动脉系统流体连通。

在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。在其它实施方案中，所述肿瘤细胞包含肿瘤细胞裂解物。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞包含多种肿瘤细胞。在其它实施方案中，所述肿瘤细胞获自活组织检查切片、细针抽吸物(FNA)、手术切除物、血液样品、胸腔积液样品、腹膜积液样品、CSF样品、或它们的组合。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞包含自体肿瘤细胞和/或自体肿瘤细胞裂解物。在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞包含同种异体肿瘤细胞和/或同种异体肿瘤细胞裂解物。

在一些实施方案中，在所述免疫细胞穿过所述免疫调节室之前，将肿瘤细胞引入免疫调节室中。在其它实施方案中，在所述免疫细胞穿过所述免疫调节室的同时或之后，将所述肿瘤细胞引入所述免疫调节室中。在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞包含在全血样品或其含有免疫细胞的部分中，并且当所述血液样品或其含有免疫细胞的部分穿过所述免疫调节室时，所述肿瘤细胞被限制在所述免疫调节室内的固体支撑物上。

在一些实施方案中，所述肿瘤和/或基质细胞被捕获部分限制在所述固体支撑物上。在具体的实施方案中，所述捕获部分还促进肿瘤和/或基质细胞的增殖。在一些实施方案中，所述捕获部分选自抗体、细胞粘附分子及它们的组合。在一些情况下，所述抗体是与以下结合的抗体：上皮细胞粘附分子(EpCAM)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA-125)、MUC1、CD44、HER2、HER3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、c-Met、EGFR、PD-L1、或它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞粘附分子选自：选择素、整合素、血管细胞粘附分子1(VCAM1)及它们的组合。在一些情况下，所述选择素选自E-选择素、L-选择素及它们的组合。

在一些实施方案中，所述免疫调节室还包含促免疫原性因子。在具体的实施方案中，所述促免疫原性因子是免疫刺激因子、抗免疫抑制因子、或它们的组合。在一些情况下，所述免疫刺激因子选自：白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素22(IL-22)、C-X-C趋化因子受体3(CXCR3)、干扰素γ(INFγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及它们的组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激因子是IL-2。在一些实施方案中，所述抗免疫抑制因子选自免疫检查点抑制剂、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂及它们的组合。在一些情况下，所述免疫检查点抑制剂抑制程序性细胞死亡1配体1(PDL1)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、T细胞免疫球蛋白3(TIM3)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、或它们的组合。

在一些实施方案中，所述免疫调节室还包含对象特异性突变肽。在一些情况下，所述对象特异性突变肽选自包含激活突变的EGFRvIII肽、p95HER2肽、EGFR肽及它们的组合。

在一些实施方案中，所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物连接。在其它实施方案中，所述固体支撑物包括所述免疫调节室的内表面或与所述免疫调节室的内表面接触的支撑结构，并且任选地还包含磁性组分。在具体的实施方案中，所述支撑结构包含基质。

在一些实施方案中，所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物共价连接。在其它实施方案中，所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物磁性连接。在一些实施方案中，所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽包含磁性颗粒。在具体的实施方案中，所述固体支撑物包含磁性组分，并且所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变的肽与所述磁性组分磁性连接。在其它实施方案中，在所述免疫调节室外部的电磁场被用于将所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物磁性连接。

在一些实施方案中，通过暴露于溶瘤病毒、放射物和/或化疗剂来诱导肿瘤细胞经历细胞凋亡。在其它实施方案中，所述对象被施用嵌合抗原受体T细胞。

在一些实施方案中，所述免疫调节室还包括流量调节器。在其它实施例中，所述免疫调节室还包括泵。在一些实施方案中，所述流量调节器和/或所述泵被用于调节所述免疫细胞穿过所述免疫调节室的速率。在具体的实施方案中，通过使用所述流量调节器和/或所述泵来调节穿过所述免疫调节室的全血的流速和/或通过调节穿过所述免疫调节室的红血细胞的数量或密度来控制所述免疫调节室内的氧气的可用性。

在一些实施方案中，使用多个免疫调节室。在具体的实施方案中，所述多个免疫调节室各自彼此流体连通。在一些实施方案中，所述多个免疫调节室中的每一个包含不同的肿瘤细胞。在一些实施方案中，用第二免疫调节室替换第一免疫调节室。在其它实施方案中，在所述免疫细胞已经穿过所述免疫调节室之后，从所述免疫调节室去除所述肿瘤细胞，并检测所述肿瘤细胞中一种或多种生物标志物的存在或水平。在一些情况下，所述一种或多种生物标志物的存在或水平被用于向所述对象提供诊断和/或选择用于所述对象的疾病的治疗。

在另一个方面，本发明提供了治疗对象的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括根据本发明的方法激活免疫细胞。在具体的实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症选自：肺癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤及它们的组合。

在另一个方面，本发明提供了用于在对象中诱导针对肿瘤的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法包括根据本发明的方法激活免疫细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤包含所述免疫调节室内的所述固体支撑物上所限制的相同类型的肿瘤细胞。在具体的实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤来自选自：肺癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤及它们的组合。

从以下详细描述和附图，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图简述

图1显示了本发明的某些实施方案的示意图。在一个实施方案中，从对象获得全血，穿过免疫调节室，并被返回对象。在第二个实施方案中，从对象获得全血并过滤，并将含有免疫细胞的部分穿过免疫调节室。将含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分返回对象。当含有免疫细胞的部分和含有非免疫细胞的部分都被返回对象时，它们可以被独立地返回对象，或组合并返回对象。在第三个实施方案中，从对象获得全血并进行单采血液成分术，以及含有免疫细胞的部分穿过免疫调节室。含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分被返回对象。当含有免疫细胞的部分和含有非免疫细胞的部分都被返回对象时，它们可以被独立地返回，或被组合并返回对象。

图2显示了免疫调节室的外观图。在所描绘的实施方案中，血液通过入口进入免疫调节室，穿过该室，并通过出口离开。电磁垫被用于产生磁场以将捕获部分与固体支撑物连接或将肿瘤细胞或其它成分限制在免疫调解室内。

图3描绘了根据本发明的方法的靶向肿瘤的免疫细胞的激活。白细胞从对象中分离并穿过免疫调节室，其中白细胞暴露于被捕获部分所限制的肿瘤细胞，所述捕获部分包含肿瘤抗原特异性抗体和磁性颗粒。当白细胞穿过免疫调节室时，一些肿瘤抗原特异性白细胞被激活。激活的和未激活的肿瘤抗原特异性白细胞都被返回对象。

图4A和4B描绘了可用于本发明方法的免疫调节室。附图描绘了位于免疫调节室内的支撑结构(例如，包含基质)。图4A描绘了将肿瘤细胞、基质细胞和/或基质成分注射到免疫调节室中，其中它们被限制在支撑结构内。从淋巴结获得的细胞(例如，从对象的淋巴结获得的免疫细胞)也可以被注射到免疫调节室中并被限制在支撑结构内。图4B描绘了流入免疫调节室的血液在流出该室之前与支撑结构接触。任选地，免疫调节室可以包括电磁垫或位于电磁垫上。支持结构尤其可用于自体免疫细胞疗法，以及以及不断发展的疾病的全面实时概况分析(例如，用于临床肿瘤学)。作为非限制性实例，支持结构能够使实时肿瘤细胞捕获、连续肿瘤细胞概况分析、免疫细胞概况分析和肿瘤特异性免疫细胞激活成为可能。

图5显示了实施例1中所描述的人源化小鼠模型研究的示意图。通过将CD34⁺细胞注射到免疫缺陷小鼠中产生人源化的小鼠(阴影的)。随后，用患者来源的肿瘤异种移植物皮下接种人源化的小鼠。一旦肿瘤达到适当的大小，就获得细针抽吸物样品并将其引入免疫调节室中。外周血单个核细胞(PBMC)也获自人源化的小鼠并通过循环泵穿过免疫调节室，在那里它们暴露于肿瘤细胞并被激活。

图6显示了实施例1中所描述的人源化小鼠研究的后期阶段的示意图。取出通过穿过免疫调节室已经被激活的免疫细胞并注射到人源化的小鼠肿瘤模型中，以及监测肿瘤大小的变化。

图7显示了实施例2中所描述的体外研究的示意图。从癌症患者获得细针抽吸物(FNA)样品，并将其引入第一免疫调节室中，所述第一免疫调节室被插入循环网络中。还从患者获得核心活组织检查切片，并将其引入第二免疫调节室中。PBMC获自对象并将其引入到循环网络中，在那里它们通过循环泵穿过第一免疫调节室。

图8显示了实施例2中所描述的体外研究的后期阶段的示意图。一旦第二免疫调节室中的肿瘤细胞集落达到适当的大小，第二免疫调节室就被连接到循环网络。已经通过穿过第一免疫调节室被激活的免疫细胞暴露于第二免疫调节室中的肿瘤细胞集落，并监测这些激活的免疫细胞对肿瘤细胞集落的作用。

图9显示了实施例3中所描述的体外自体免疫细胞激活实验的示意图。

图10显示了在IL-2存在下生长的共培养物中观察到的肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用。在第1天和第7天通过光学显微镜和荧光显微镜分析在有IL-2的情况下生长的Pan02-H2bGFP肿瘤细胞与RFP免疫细胞的共培养物。显示了在600×放大率下拍摄的代表性的明场图像、荧光图像和复合的图像。箭头指向表达RFP的免疫细胞。实线箭头和虚线箭头分别指向与免疫细胞相互作用以及不与免疫细胞相互作用的GFP标记的肿瘤细胞。免疫细胞展现出全细胞RFP表达，而肿瘤细胞展现出核GFP表达。

图11显示了在存在或不存在IL-2的情况下生长的肿瘤和免疫细胞共培养物。如左图所示的，在具有或不具有IL-2的情况下，GFP标记的鼠黑素瘤细胞与同源RFP免疫细胞共培养。通过荧光显微镜观察共培养物直到第4天并分析。显示了在第2天和第3天获得的代表性荧光图像。框包围表达RFP的免疫细胞(IC)和表达GFP的肿瘤细胞(TC)之间的相互作用。免疫细胞和肿瘤细胞分别展示了RFP和GFP的全细胞表达。

图12显示了实施例4中所描述的体外免疫细胞激活实验的示意图。在右上角显示了

组织培养装置。

图13显示了在200×放大率下拍摄的免疫调节室培养物的代表性荧光图像。免疫细胞和肿瘤细胞分别展示了RFP和GFP的全细胞表达。框突出了免疫细胞和肿瘤细胞的相互作用。

图14显示了实施例5中所描述的自体免疫细胞疗法的体内模型的示意图。

图15显示了从在第6天处死的动物的外周血(下图)分离的PBMC的全身成像(上图)和细胞计数分析(处死每个实验组的一只小鼠)。细胞计数数据显示与前向散射(y轴)有关的RFP荧光(x轴)。RFP阳性和RFP阴性免疫细胞群分别由实线和虚线环绕。对于第1组，箭头指向存在于具有GFP胰腺肿瘤模型的小鼠的腹膜腔中的可见肿瘤。荧光肿瘤细胞和/或肿瘤细胞碎片在膀胱(虚线箭头)中是可见的，并且沿着肠壁在整个内脏空间中(由虚线环绕)是可见的。对于第2组，在注射Pan02-H2bGFP细胞的小鼠的腹膜腔中不存在可见的肿瘤。此外，荧光扫描没有观察到GFP肿瘤细胞的证据。对于第3组，箭头指向存在于具有GFP胰腺肿瘤模型的小鼠的腹膜腔中的可见肿瘤。荧光肿瘤细胞和/或肿瘤细胞碎片在膀胱(虚线箭头)中是可见的；然而，GFP荧光弱于对照小鼠。

图16A-图16G显示了从在第17天处死的动物的外周血中分离的组织和PBMC的全身成像和细胞计数分析。图16A显示了第1组小鼠的明场(左)和荧光(右)图像。箭头指向存在于具有GFP胰腺肿瘤模型的小鼠的腹膜腔中的可见肿瘤。荧光肿瘤细胞沿着肠壁在整个内脏空间(由虚线环绕)中是可见的。图16B显示了获得的可疑肿瘤样品(左边)以及网膜(右边)的图像。图16C显示了存在于可疑肿瘤样品(左)和网膜(中间)中的细胞以及从该小鼠收集的PBMC(右)的细胞计数分析。图16D显示了第2组小鼠的明场(左)和荧光(右)图像。在注射Pan02-H2bGFP细胞的小鼠的腹膜腔中不存在可见的肿瘤。荧光扫描没有观察到GFP肿瘤细胞的证据。图16E显示了获得的可疑肿瘤样品(左)以及网膜(右)的图像。图16F显示了存在于可疑肿瘤样品(左)和网膜(中间)中的细胞以及从该小鼠收集的PBMC(右)的细胞计数分析。图16G显示了第3组小鼠的明场(左)和荧光(右)图像。箭头指向存在于具有GFP胰腺肿瘤模型的小鼠的腹膜腔中的可见肿瘤。荧光肿瘤细胞沿着肠壁在整个内脏空间(由虚线环绕)中是可见的。该小鼠在检查前死亡并且没有进行进一步的细胞计数分析。

发明详述

I.引言

本发明部分地基于开发的方法，所述方法能够调节免疫通路以在患有由免疫功能失调引起的疾病的对象中恢复良好平衡的免疫停滞，从而解决肿瘤学和其它医学领域中未满足的临床需要。根据本发明的方法，从对象(例如，患者)获得(例如，分离)免疫细胞(例如，存在于血液样品中)，使其穿过免疫调节室，从而被激活，并且随后被返回到对象。免疫调节室能够寄宿免疫细胞穿过免疫调节室时所暴露的患病细胞(例如肿瘤细胞、基质细胞)、组织或细胞材料，从而激活免疫细胞。任选地，本发明的方法还包括通过用单采血液成分术法或过滤法处理样品来分离样品的一部分(例如，全血样品)，然后使样品的含有免疫细胞的部分穿过免疫调节室(图1)。含有免疫细胞的部分的分离可以例如在连接到免疫调节室和/或对象的分离装置中进行。

在一些实施方案中，免疫调节室模拟淋巴结，其中在将激活的免疫细胞(例如，白细胞)静脉内再循环回对象(例如，癌症患者)之前，发生肿瘤特异性免疫细胞激活。通过肿瘤特异性免疫细胞的离体激活来治疗癌症患者的这种方法的新方法的优点在于，它能够最大化患者中的肿瘤特异性自体免疫应答，同时最小化在全身治疗中经常观察到的副作用。富集免疫细胞群和最大化肿瘤特异性免疫应答是特别重要的，因为绝大多数免疫细胞不是肿瘤特异性的。

在一些实施方案中，免疫调节室还模拟肿瘤微环境，因为分离的肿瘤细胞被限制在免疫调节室内。本发明的一个特别的优点是免疫细胞经常由于基质屏障而不能接近肿瘤细胞，但是这些屏障在免疫调节室中被去除。受限制的肿瘤细胞被抑制循环回到对象的循环中，但是激活的免疫细胞(例如，白细胞)可以循环回到对象中用于全身治疗作用。促免疫原性因子可增大免疫调节室内的局部环境以增强肿瘤特异性免疫应答和/或逆转对免疫抑制的肿瘤特异性免疫细胞的抑制作用。

根据本发明的方法，肿瘤细胞被捕获在免疫调节室中(例如，通过循环肿瘤细胞的免疫磁性富集)或被引入免疫调节室中(例如，通过注射肿瘤细胞或含有肿瘤细胞的样本，如细针抽吸物、核心活组织检查样本、多个或腹膜积液样品)。免疫调节室可以提供浅的深度三维结构(如琼脂糖凝胶或基质胶(Matrigel))，其也可以包括磁性颗粒和/或用特异性针对肿瘤细胞的捕获抗体(例如，抗EpCAM抗体)或用促进特异性免疫细胞-肿瘤细胞相互作用的细胞粘附因子修饰(图2-图4)。固定的刺激细胞因子也可以存在于免疫调节室中，提供有效的肿瘤抗原特异性免疫细胞(即白细胞)的激活。这种方法提供了以下优点：刺激细胞因子的作用可以被限制于预期的靶标(即免疫细胞)，同时避免了当此类药剂被系统地引入对象时发生的副作用。

本发明可被用于治疗和/或诊断应用。对于治疗应用，免疫调节室可以被用于本发明的方法，例如，来捕获肿瘤细胞内容物和/或基质细胞内容物，以及促进癌症特异性免疫细胞激活。对于诊断应用，免疫调节室可以被用于本发明的方法中使用，例如连续捕获循环肿瘤细胞(CTCs)以及促进肿瘤应答的实时观察，这进而允许实时治疗反馈、剂量优化和/或治疗调节。

II.定义

如本文中所使用的，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。

如本文中所使用的术语“一个/种(a/an)”或“所述(the)”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有多于一个成员的方面。例如，单数形式“一个/种(a/an)”或“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类的细胞，并且提及“药剂”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种药剂，等等。

如本文所使用的术语“约”和“大约”通常意指在给定测量值的性质或精度的情况下所测量的量的可接受的误差程度。典型的示例性误差程度在给定值或值范围的20％内，优选在10％内，更优选在5％内。任何提及的“约X”特别地表示至少值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”旨在教导和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。

术语“激活免疫细胞”是指在免疫细胞内诱导、触发或增强一种或多种生物通路和/或功能，使得免疫细胞识别抗原(例如肿瘤抗原)或引发针对抗原的直接或间接应答的能力增加。在一些实施方案中，免疫细胞激活在对象中诱导免疫应答(例如，针对肿瘤)。

术语“免疫应答”是指在对象中由抗原(例如肿瘤细胞抗原)诱导、触发或增强的任何应答。该术语包括免疫细胞(例如，B细胞和T细胞)的发育、成熟、分化和激活，以及针对抗原的抗体的产生。该术语还包括增加或降低参与调节免疫功能的细胞因子的表达或活性。

术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于啮齿动物(例如小鼠、大鼠)、猿猴、人、农场动物、运动动物和宠物。

术语“癌症”旨在包括以异常细胞的不受控制的生长为特征的一类疾病的任何成员。该术语包括所有已知的癌症和赘生性病况(无论其特征是恶性的、良性的、复发的、软组织还是实体)，以及所有阶段和等级的癌症(包括晚期癌症、转移前癌症和转移后癌症)。本文描述了适于根据本发明的方法治疗的癌症的非限制性实例。

在癌症的背景中，术语“阶段”是指癌症程度的分类。当癌症分期时所考虑的因素包括但不限于肿瘤大小、附近组织的肿瘤侵袭、以及肿瘤是否已经转移到其它部位。用于区分一个阶段与另一个阶段的具体标准和参数可以根据癌症的类型而变化。癌症分期被用于例如帮助确定预后和/或鉴定最合适的治疗选择。

癌症分期系统的一个非限制性实例被称为“TNM”系统。在TNM系统中，“T”是指主要肿瘤的大小和程度，“N”是指癌症已经扩散到的附近淋巴结的数目，并且“M”是指癌症是否已经转移。“TX”表示不能测量主要肿瘤，“T0”表示不能发现主要肿瘤，以及“T1”、“T2”、“T3”和“T4”表示主要肿瘤的大小和/或程度，其中较大的数目对应于较大的肿瘤和/或已生长到附近组织中的肿瘤。“NX”表示不能测量的附近淋巴结中的癌症，“N0”表示在附近淋巴结中不存在癌症，并且“N1”、“N2”、“N3”和“N4”表示癌症已经扩散到的淋巴结的数目和位置，其中较大的数目对应于含有癌症的较大数目的淋巴结。“MX”表示不能测量的转移，“M0”表示未发生转移，并且“M1”表示癌症已经转移到身体的其它部分。

在癌症分期系统的另一个非限制性实例中，癌症被分类或分级为具有五个阶段中的一个：“第0阶段”、“第I阶段”、“第II阶段”、“第III阶段”和“第IV阶段”。第0阶段表示存在异常细胞，但没有扩散到附近的组织。这也通常称为原位癌(CIS)。CIS不是癌症，但随后可发展成癌症。第I、II和III阶段表示存在癌症。较高的数目对应于较大肿瘤大小和/或已经扩散到附近组织的肿瘤。第IV阶段表示癌症已经转移。本领域技术人员将熟悉不同的癌症分期系统并且能够容易地应用和/或解释它们。

术语“活组织检查”是指为了诊断或预后评估而移出组织样品的过程，并且是组织样本本身。本领域已知的任何活组织检查技术可被应用于本发明的方法和组合物。所应用的活组织检查技术通常将取决于待评估的组织类型和肿瘤的大小和类型(即，实体的或悬浮的(即，血液，胸腔穿刺术抽吸物或腹水))，以及其它因素。代表性的活组织检查技术包括切除活组织检查、切开活组织检查、针刺活组织检查(例如，核心针刺活组织检查、细针抽吸活组织检查等)、手术活组织检查和骨髓活组织检查。例如在哈里森的内科医学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)，Kasper等人编辑，第16版，2005，第70章以及整个V部分中讨论了活组织检查技术。本领域技术人员将理解，可进行活组织检查技术以鉴定给定组织样品中的癌和/或癌前细胞。

术语“治疗”是指获得有益或期望结果的方法，所述结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处意指在治疗中对一种或多种疾病、病况或症状的任何治疗上相关的改善或效果。治疗性益处还可以意指实现治疗下的一种或多种疾病、病况或症状的治愈。

术语“疫苗”是指生物组合物，当向对象施用时，其具有产生对对象的特定病原体或疾病的获得性免疫力的能力。通常，向对象施用与目的病原体或疾病相关的一种或多种抗原或抗原片段。疫苗可以包括，例如，灭活或减毒的生物体(例如细菌或病毒)、细胞、从细胞表达或在细胞上表达的蛋白质(例如细胞表面蛋白质)、由生物体产生的蛋白质(例如毒素)、或生物体的部分(例如病毒包膜蛋白质)。在一些情况下，细胞被工程化以表达蛋白质，使得当作为疫苗施用时，它们增强对象获得对特定细胞类型的免疫力的能力(例如，增强对象获得对癌细胞的免疫力的能力)。

术语“存活期”是指在诊断疾病和/或开始或完成疾病(例如癌症)的特定疗程后的时间长度。术语“总存活期”包括描述在诊断患有疾病(例如癌症)或治疗疾病(例如癌症)后存活限定时间段的患者的临床终点。术语“无疾病存活期”包括治疗特定疾病(例如，癌症)后的时间长度，在此期间患者存活而没有疾病病征(例如，没有已知的复发)。在某些实施方案中，无疾病存活期是被用于评估特定疗法的功效的临床参数，其通常以1或5年的单位测量。术语“无进展存活期”包括在治疗特定疾病(例如，癌症)期间和之后的时间长度，其中患者伴随疾病而没有该疾病的额外症状。在一些实施方案中，存活期被表示为中值或平均值。

术语“外周血单个核细胞(PBMC)”是指具有圆核的任何外周血。PBMC包括淋巴细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)和单核细胞。PBMC可以从全血中提取，例如，通过使用多糖Ficoll，然后梯度离心。离心后，在血浆的顶层和多形核细胞和红细胞的底部级分之间发现PBMC。

术语“淋巴细胞”是指包括T淋巴细胞(也被称为“T细胞”)、B淋巴细胞(也被称为“B细胞”)、树突细胞和自然杀伤(NK)细胞的白血细胞亚型。

T淋巴细胞在胸腺中成熟并在细胞介导的免疫力中起重要作用。T淋巴细胞与其它类型的淋巴细胞的区别在于存在于细胞表面上的T细胞受体的存在。T淋巴细胞被细分为几种类型，包括效应T细胞、辅助T细胞、细胞毒性(杀伤)T细胞、记忆细胞、调节性(抑制性)T细胞和自然杀伤T细胞。效应T细胞是指包括几种T淋巴细胞类型(包括辅助细胞、杀伤细胞和调节性细胞)的广义范畴，并且通常是应答刺激的细胞。辅助T细胞(也被称为CD4⁺T细胞)辅助其它类型的白血细胞发挥作用，如辅助B细胞成熟成血浆和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。通过在抗原呈递细胞(APC)的表面上呈递抗原来激活辅助T细胞。细胞毒性(杀伤)T细胞(也被称为CD8⁺T细胞)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且与移植排斥有关。记忆T细胞识别外来入侵者(如细菌和病毒，还有肿瘤细胞)。在记忆T细胞遇到并应答它们的同源抗原后，在第二次遇到后，这些细胞能够复制并引发更强和快速的免疫应答。调节性(抑制性)T细胞(Treg)对于维持免疫耐受性是关键的；它们的主要作用是在免疫反应即将结束时下调T淋巴细胞介导的免疫力，并抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T淋巴细胞。桥接适应性免疫系统和先天性免疫系统的自然杀伤T细胞，识别由CD1d分子呈递的抗原并执行如细胞因子产生和细胞溶解分子释放的功能。

B淋巴细胞分泌抗体并在适应性免疫系统的体液免疫成分中起作用。此外，B淋巴细胞可作为抗原呈递细胞并分泌细胞因子。在骨髓中成熟的B淋巴细胞与其它类型的淋巴细胞的区别在于在细胞表面上存在B细胞受体。B淋巴细胞的激活可以是T淋巴细胞依赖性的或T淋巴细胞非依赖性的。B淋巴细胞被细分为几种类型，包括浆母细胞、浆细胞、淋巴浆细胞样细胞、记忆B细胞、滤泡B细胞、边缘区B细胞、B-1细胞、B-2细胞和调节性B(Breg)细胞。

作为先天性免疫系统的一部分的NK细胞在防御肿瘤细胞和病毒感染的细胞，通过识别主要组织相容性复合体I类分子的细胞表面变化区分这些细胞与正常细胞中起主要作用。NK细胞被细胞因子的干扰素家族激活，并且一旦被激活就释放破坏改变的或感染的细胞的细胞毒性分子。

“白细胞介素”是在先天性免疫系统功能和适应性免疫系统功能中起重要作用的一组细胞因子。一些白细胞介素促进B淋巴细胞、T淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。许多白细胞介素由辅助CD4 T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生。白细胞介素可以增强或抑制免疫功能，这取决于特定的白细胞介素。

可用于本发明方法的白细胞介素(IL)的非限制性实例包括IL-2(其靶向激活的T细胞和B细胞、NK细胞、巨噬细胞和少突胶质细胞)、IL-4(其靶向激活的B细胞、T细胞和内皮细胞)、IL-5(其靶向B细胞和嗜酸性粒细胞)、IL-6(其中靶向激活的B细胞、浆细胞、造血细胞和T细胞等)、IL-12(其中靶向激活的T细胞和NK细胞)、IL-17(其中靶向上皮细胞和内皮细胞等)和IL-22。

“白细胞介素2”或“IL-2”与IL-2受体(例如，由淋巴细胞表达)结合并调节白血细胞(例如，白细胞、淋巴细胞)的活性，在自身与非自身免疫识别中起重要作用，并参与对抗微生物传染剂的应答。IL-2促进T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞，并且也促进未成熟T细胞分化为调节性T细胞。在癌症治疗的背景下，IL-2可以增加免疫细胞激活和随后的免疫细胞介导的肿瘤细胞生长抑制。人IL-2氨基酸序列的非限制性实例在NCBI参考序列编号NP_000577下列出。

“白细胞介素4”或“IL-4”诱导天然辅助T细胞(Th0细胞)分化为Th2细胞。随后，当被IL-4激活时，Th2细胞在正反馈环中产生额外的IL-4。IL-4还起到刺激激活的B和T细胞增殖，使B细胞分化成浆细胞，诱导B细胞类转换为IgE以及上调MHC II类产生的作用。IL-4还降低Th1细胞、巨噬细胞、干扰素-γ和树突细胞IL-12的产生。人IL-4氨基酸序列的非限制性实例在NCBI参考序列编号NP_000580、NP_758858和NP_001341919下列出。

“白细胞介素5”或“IL-5”由Th2细胞和肥大细胞产生，并起刺激B细胞生长和增加免疫球蛋白分泌的作用。人IL-5氨基酸序列的非限制性实例在NCBI参考序列编号NP_000870下列出。

“白细胞介素6”或“IL-6”由巨噬细胞、Th2细胞、B细胞、星形胶质细胞和内皮细胞产生。IL-6可作为促炎细胞因子。人IL-6氨基酸序列的非限制性实例在NCBI参考序列编号NP_000591和NP_001305024下列出。

术语“肿瘤坏死因子-α”或“TNFα”是指由人的TNFA基因编码的细胞因子。TNFα由激活的巨噬细胞、CD4⁺T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和神经元产生。TNFα参与诸如诱导细胞凋亡和炎症以及抑制肿瘤发生和病毒复制的过程。人TNFα氨基酸序列的非限制性实例在NCBI参考序列号NP_000585下列出。

术语“干扰素-γ”或“IFNγ”是指是II型干扰素的成员并且由IFNG基因编码的细胞因子。IFNγ在先天性免疫和适应性免疫中起重要作用。具体地，IFNγ激活巨噬细胞并诱导II类MHC分子的表达。IFNγ由自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、CD4⁺Th1细胞、CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞和非细胞毒性先天性淋巴样细胞产生。人IFN-γ氨基酸序列的非限制性实例在NCBI参考序列编号NP_000610下列出。

III.实施方案的描述

在一个方面，本发明提供了用于激活对象的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使来自对象的免疫细胞穿过免疫调节室，从而使所述免疫细胞暴露于肿瘤细胞并激活所述免疫细胞，其中所述免疫调节室包括固体支撑物和被限制在所述免疫调节室内的固体支撑物上的所述肿瘤细胞，和(b)将激活的免疫细胞返回至所述对象。在一些实施方案中，免疫细胞从对象中分离(例如，在免疫细胞穿过免疫调节室之前)。

在一些实施方案中，所述方法是离体进行的。在其它实施方案中，所述方法增加对象的自体免疫应答。在一些其它实施方案中，所述方法减少或消除对象的全身治疗的副作用。在一些实施方案中，被激活的免疫细胞是一种细胞类型。在其它情况下，被激活的免疫细胞是多种细胞类型的。在一些实施方案中，被激活的免疫细胞选自白细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、淋巴细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞、NK细胞)、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞及它们的组合。在具体的实施方案中，通过检测生物标志物的存在或水平来测量免疫细胞的激活。

在一些实施方案中，免疫调节室还包括被限制在固体支撑物上的基质细胞和/或基质成分。在其它实施方案中，免疫细胞包含在获自对象的全血样品中。在具体的实施方案中，使全血样品穿过免疫调节室。

在一些实施方案中，免疫调节室还包括入口和/或出口。在具体的实施方案中，入口和/或出口与对象的血管系统、腹膜腔、胸膜腔或脑脊髓液(CSF)流体连通。在一些情况下，入口和/或出口与对象的静脉系统流体连通。在其它情况下，入口和/或出口与对象的动脉系统流体连通。在具体的实施方案中，免疫调节室经由放置在对象中的动静脉分流器连接到对象的血管系统(例如，与之流体连通放置)。

在一些实施方案中，从全血样品中分离含有免疫细胞的部分，并使全血样品的含有免疫细胞的部分穿过免疫调节室。在一些情况下，使用过滤方法分离全血样品的含有免疫细胞的部分。在其它情况下，使用单采血液成分术(例如，白细胞单采血液成分术)分离全血样品的含有免疫细胞的部分。在一些实施方案中，通过使全血样品穿过与免疫调节室流体连通的分离装置来分离全血样品的含有免疫细胞的部分。在具体的实施方案中，分离装置被连接到对象和免疫调节室(例如，与之流体连通)，并且分离装置位于对象和免疫调节室之间(例如，隔离装置连接到免疫调节室的入口)。在其它实施方案中，过滤装置连接到免疫调节室的出口。在其它实施方案中，过滤装置连接到免疫调节室的入口和出口。在一些实施方案中，将全血样品的含有非免疫细胞的部分(例如，血浆、RBC、血小板)返回对象。

在一些实施方案中，免疫调节室包含已经从淋巴结(例如，来自对象的淋巴结)分离并随后引入免疫调节室中的免疫细胞。

在具体的实施方案中，在全血样品的含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分返回对象之前，从全血样品的含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分中去除免疫抑制因子和/或对对象具有副作用的因子。作为非限制性实例，可以在血浆被返回对象之前从血浆中去除抗炎因子(例如，IL4、IL10、IL13)。作为另一个非限制性实例，在血液样品或其部分被返回对象之前，可以从血液样品或其部分中去除并隔离(例如，在与免疫调节室分开的室中)Treg(例如，CD25⁺细胞)。

在一些实施方案中，肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。在其它实施方案中，肿瘤细胞包含肿瘤细胞裂解物。在一些实施方案中，肿瘤细胞包含多种肿瘤细胞。

在一些实施方案中，肿瘤细胞和/或基质材料(例如，基质细胞、基质成分)作为样品获自对象。样品可以是获自患者的任何生物样本。样品包括但不限于全血、血浆、血清、红血细胞、白血细胞(例如，外周血单个核细胞)、导管灌洗液、腹水、胸膜流出物、乳头抽吸物、淋巴(例如淋巴结的散播性肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿液、粪便(即排泄物)、痰、支气管灌洗液、泪液、细针抽吸物(例如，通过随机乳晕细针抽吸物收获的)、任何其它体液、组织样品(例如，肿瘤组织)诸如肿瘤的活组织检查(例如，针刺活组织检查)或淋巴结(例如，前哨淋巴结活组织检查)、组织样品(例如，肿瘤组织)诸如肿瘤的手术切除物及其细胞提取物。在具体的实施方案中，(例如，当样品包括粪便或排泄物样品时)，对样品进行处理(例如，灭菌或消毒)以减少或消除微生物污染。在一些实施方案中，样品是全血或其部分成分，如血浆、血清或细胞沉淀。在其它实施方案中，通过使用本领域已知的任何技术从全血或其细胞级分中分离实体瘤的循环细胞来获得样品。在具体的实施方案中，样品是从冷冻组织制备的肿瘤裂解物或提取物。在具体的实施方案中，肿瘤细胞获自活组织检查切片、细针抽吸物(FNA)、手术切除物、血液样品、胸腔积液样品、腹膜积液样品、CSF样品、或它们的组合。在一些实施方案中，肿瘤细胞包含自体肿瘤细胞和/或自体肿瘤细胞裂解物。在其它实施方案中，肿瘤细胞包含同种异体肿瘤细胞和/或同种异体肿瘤细胞裂解物。

在一些实施方案中，在免疫细胞穿过免疫调节室之前将肿瘤细胞引入免疫调节室中。作为非限制性实例，肿瘤细胞可以在免疫细胞穿过免疫调节室之前约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个小时或更多个小时，或者在免疫细胞穿过免疫调节室之前约1、2、3、4、5、6、7天或更多天，引入免疫调节室中。在其它实施方案中，肿瘤细胞在免疫细胞穿过免疫调节室的同时或之后被引入免疫调节室中。在具体的实施方案中，肿瘤细胞包含在全血样品或其含有免疫细胞的部分中，并且当血液样品或其含有免疫细胞的部分穿过免疫调节室时被限制在免疫调节室内的固体支撑物上。

在一些实施方案中，肿瘤和/或基质细胞被捕获部分限制在固体支撑物上。在具体的实施方案中，捕获部分还促进肿瘤和/或基质细胞的增殖。在一些实施方案中，选择捕获部分以捕获特异性肿瘤细胞和/或基质细胞。选择性肿瘤和/或基质细胞捕获可用于例如随后的生物标志物物分析以用于诊断目的和用于指导治疗(例如，确定是否应该改变、中断和/或开始治疗)。

在一些实施方案中，捕获部分选自抗体、细胞粘附分子及它们的组合。在一些情况下，抗体是是与以下结合的抗体：上皮细胞粘附分子(EpCAM)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA-125)、MUC1、CD44、HER2、HER3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、PD-L1、c-Met、EGFR、或它们的组合。在一些实施方案中，细胞粘附分子选自：选择素、整合素、血管细胞粘附分子1(VCAM1)及它们的组合。在一些情况下，选择素选自E-选择素、L-选择素及它们的组合。

本发明的方法是有利的，因为免疫细胞可以接近肿瘤细胞的通道，而不必“浸润”肿瘤微环境。可以利用这一优点，例如，提高本文所述的免疫检查点和其它免疫肿瘤学疗法的功效。在一些实施方案中，免疫调节室还包含促免疫原性因子。在具体的实施方案中，促免疫原性因子是免疫刺激因子、抗免疫抑制因子或它们的组合。在一些情况下，免疫刺激因子选自：白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素22(IL-22)、C-X-C趋化因子受体3(CXCR3)、干扰素γ(INFγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及它们的组合。在一些实施方案中，抗免疫抑制因子选自免疫检查点抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂及它们的组合。在一些情况下，免疫检查点抑制剂抑制程序性细胞死亡1配体1(PDL1)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、T细胞免疫球蛋白3(TIM3)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、或它们的组合。本发明的方法提供了通过选择性地从MDSC捕获肿瘤细胞并通过产生抑制Treg活性的超免疫激活环境来最小化由骨髓样来源的抑制细胞(MDSC)以及其它细胞类型所产生的酶的作用的优点。

程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和蛋白死亡配体1(PDL1)是免疫检查点抑制剂的常见靶标，因为PD1和PDL1之间的相互作用的破坏增强免疫细胞对抗外来细胞(如癌细胞)的活性。PD1抑制剂的实例包括派姆单抗和纳武单抗。PDL1抑制剂的实例是阿特珠单抗。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)是另一个靶标并且是下调免疫细胞应答的受体。因此，抑制CTLA4的药物可以增加免疫功能。此类药物的实例是伊匹木单抗，它是结合并抑制CTLA4的单克隆抗体。

在一些实施方案中，免疫调节室还包含对象特异性突变肽。在一些情况下，对象特异性突变的肽选自：包含激活突变的EGFRvIII肽、p95HER2肽、EGFR肽及它们的组合。

在一些实施方案中，捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与固体支撑物连接。在其它实施方案中，固体支撑物包括免疫调节室的内表面或与免疫调节室的内表面接触的支撑结构，并且任选地进还包含磁性组分。在具体的实施方案中，支撑结构包含基质。合适的基质的实例包括但不限于琼脂糖凝胶、基质胶、胶原凝胶、水凝胶和肌凝胶(myogel)。水凝胶的强度可以通过在聚合过程中改变性质(如pH和温度)来调节。在一些实施方案中，固体支撑物可以包括微流体装置。肿瘤细胞和/或材料可以被限制在微流体通道内，并且经受经过被限制的细胞的恒定定向流动(例如血液或介质)。该流动提供剪切应力，其可以与通道材料、机械性质和基质丰度的变化相结合以精确地改变其中细胞生长的微环境。

在一些实施方案中，捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与固体支撑物共价连接。在其它实施方案中，捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与固体支撑物磁性连接。在一些实施方案中，捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽包含磁性颗粒。在具体的实施方案中，固体支撑物包含磁性组分，并且捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与磁性组分磁性连接。在其它实施方案中，在免疫调节室外部的电磁场被用于将捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与固体支撑物磁性连接。

在一些实施方案中，通过暴露于溶瘤病毒、放射物和/或化学治疗剂来诱导肿瘤细胞经历细胞凋亡。在其它实施方案中，对象被施用嵌合抗原受体T细胞(CAR T-细胞)。本发明方法的优点是CAR T细胞，其通常在体内对实体肿瘤具有有限的接近，获得对免疫调节室内肿瘤细胞的增加的接近。此外，可以使用本发明的方法监测CAR T细胞和肿瘤细胞之间的接合。监测可以是诊断性的(例如，检测CAR T细胞-肿瘤相互作用和随后的肿瘤细胞破坏或裂解)和/或可以用于指导治疗(例如，可以筛选针对各种肿瘤抗原的现成的或普通的CAR T细胞或NK细胞以确定最合适的选择)。

可用于本发明的化学治疗剂包括但不限于烷化剂(例如氮芥类(例如，二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑)、亚硝基脲类(例如，链脲菌素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀)、烷基磺酸盐类(例如，白消安)、三嗪类(例如，达卡巴嗪(DTIC)、替莫唑胺)、乙烯亚胺类(例如，噻替派、阿司他敏(altretamine)(六甲蜜胺))、铂类药物(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂)、抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞)、蒽环类抗肿瘤抗生素(例如，道诺霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星)、非蒽环类抗肿瘤抗生素(例如，放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌)、有丝分裂抑制剂(例如，紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他赛)、埃博霉素(例如，伊沙匹隆)、长春花生物碱类(例如，长春花碱、长春新碱、长春瑞滨)、雌莫司汀)、皮质类固醇类(例如，泼尼松、甲基泼尼松龙、地塞米松)、L-天冬酰胺酶、硼替佐米和拓扑异构酶抑制剂。可以使用化学治疗剂的组合。

拓扑异构酶抑制剂是抑制拓扑异构酶活性的化合物，拓扑异构酶是通过催化DNA链的骨架中磷酸二酯键的断裂和重新连接而促进DNA结构改变的酶。DNA结构的此类改变对于正常细胞周期中的DNA复制是必需的。拓扑异构酶抑制剂抑制细胞周期中的DNA连接，导致单链和双链断裂的数目增加并因此使基因组稳定性降低。基因组稳定性的此类降低导致细胞凋亡和细胞死亡。

拓扑异构酶通常分为I型拓扑异构酶和II型拓扑异构酶。I型拓扑异构酶对于DNA复制和转录期间DNA超螺旋的松弛是必需的。I型拓扑异构酶产生DNA单链断裂并且还将所述断裂重新连接以重建完整的双螺旋DNA分子。I型拓扑异构酶抑制剂的实例包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱和片螺素D，它们都是IB型拓扑异构酶。

II型拓扑异构酶抑制剂广泛地分类为拓扑异构酶毒物和拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶毒物靶向拓扑异构酶-DNA复合物，而拓扑异构酶抑制剂破坏酶催化转化。II型拓扑异构酶抑制剂的实例包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素和氟喹诺酮。

也可以使用免疫治疗化合物。在一些情况下，免疫治疗剂包含靶向特定癌细胞类型或部分的单克隆抗体。在一些情况下，抗体与诸如药物分子或放射性物质的部分缀合。作为非限制性实例，抗体可以来源于小鼠、嵌合的或人源化的。治疗性单克隆抗体的非限制性实例包括阿仑珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、伊匹单抗(MDX-101)、纳武单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗。

放射疗法可以包括X射线、γ射线和/或带电粒子的递送。

在一些实施方案中，使用小分子药物。小分子药物通常是具有低分子量(即，小于约900道尔顿)的药剂。用于治疗癌症的小分子药物的非限制性实例包括硼替佐米(一种蛋白酶体抑制剂)、伊马替尼(一种酪氨酸激酶抑制剂)和塞来昔布(一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)和艾卡哚司他(一种吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂)。

本发明的方法也可用于增强双特异性T细胞接合剂。通过将这些修饰的抗体引入免疫调节室的局部环境中，双特异性T细胞接合剂迫使免疫细胞和肿瘤细胞之间相互作用的能力得到提高。

在一些实施方案中，免疫调节室还包括流量调节器。在其它实施方案中，免疫调节室还包括泵。在一些实施方案中，流量调节器和/或泵被用于调节免疫细胞穿过免疫调节室的速率。在一些实施方案中，改变泵的速度以增加或降低穿过免疫调节室的流速。在具体的实施方案中，免疫细胞存在于全血样品或其含有免疫细胞的部分中。

调节流速是有用的，例如，用于优化免疫细胞与被限制在免疫调节室内的捕获细胞(例如，肿瘤细胞，基质细胞)的接触。作为非限制性实例，可降低流速以增加免疫细胞存在于免疫调节室中的时间量，从而增加与肿瘤和/或基质细胞的可用相互作用时间。或者，如果需要增加每单位时间穿过免疫调节室的免疫细胞的数量，则可增加流速。

调节流速也可用于，例如，当细胞(如循环肿瘤细胞)穿过免疫调节室时，优化细胞(如循环肿瘤细胞)的捕获或限制。待捕获的细胞可以存在于全血样品或其一部分中，当它穿过免疫调节室时。可以使用流量调节器和/或泵来调节流速(例如，通过改变泵的速度)。作为非限制性实例，可降低流速以增加待捕获的细胞存在于免疫调节室内的时间量，从而增加细胞将被捕获部分捕获和限制的概率。可替代地，可增加流速以增加每单位时间穿过免疫调节室的细胞的数量，从而增加可用于在免疫调节室内捕获的细胞的数量。在一些实施方案中，根据治疗(例如，癌症治疗)的阶段调节流速。作为非限制性实例，当细胞(例如，循环肿瘤细胞)需要被捕获或限制在免疫调节室内时，可以在治疗的早期阶段期间选择特定的流速，并且当已经捕获足够数量的细胞时，可以在治疗期间的后期选择不同的流速(例如，更高或更低的流速)。在一些情况下，细胞(例如肿瘤细胞)的捕获速率将在一个治疗阶段(例如，在较早的阶段，或在免疫调节室已经被替换之后)具有更高重要性，并且免疫细胞暴露于免疫调节室内的捕获细胞的时间将在其它治疗阶段具有更高重要性。

在具体的实施方案中，通过使用流量调节器和/或泵来调节穿过免疫调节室的全血的流速和/或通过调节穿过免疫调节室的红血细胞的数量或密度来控制免疫调节室内的氧气的可用性。通常，室内红血细胞的数量或密度的增加将与免疫调节室内更高的氧气可用性相关。在一些实施方案中，期望在免疫调节室内产生低氧环境，并且使用流量调节器和/或泵(例如，通过改变泵的速度)来减少免疫调节室内细胞的数量或密度。

在一些实施方案中，使用多个免疫调节室。在具体的实施方案中，多个免疫调节室各自彼此流体连通。在一些实施方案中，多个免疫调节室中的每一个包含不同的肿瘤细胞。该方法的一个优点是本发明的方法可以模拟对象体内转移性癌部位的存在。可使用任何数目的免疫调节室(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个室)。

在一些实施方案中，用第二免疫调节室替换第一免疫调节室。可以将免疫调节室移除(例如，从与对象或其他循环网络的流体连通中移除)，并用新的免疫调节室进行多次替换(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)，这取决于根据本发明的方法激活的对象免疫细胞的持续时间以及其他因素。在一些实施方案中，在免疫细胞已经穿过免疫调节室之后，从免疫调节室中去除肿瘤细胞，并检测肿瘤细胞中一种或多种生物标志物的存在或水平。可以在免疫调节室仍然与对象或其它循环网络流体连通的同时，或者在免疫调节室已经从与对象或其它循环网络流体连通去除之后(例如，当第一免疫调节室被去除并用第二免疫调节室替换时)从免疫调节室去除免疫细胞。在一些情况下，一种或多种生物标志物的存在或水平被用于向对象提供诊断和/或选择用于对象的疾病的治疗。

作为非限制性实例，可以在肿瘤细胞和/或基质材料(例如，基质细胞)中检测或测量一种或多种生物标志物的存在和/或水平，用于确定对象是否对根据本发明的方法、另一种治疗方法或它们的组合的免疫细胞激活有应答的目的。在一些实施方案中，生物标志物物的存在或水平的增加或降低将指示免疫细胞激活或其它疗法是有效的。在其它实施方案中，生物标志物物的存在或水平的增加或降低将指示免疫细胞激活或其它疗法是无效的，在这种情况下可能需要改变疗法。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的存在或水平被用于为对象选择合适的疗法(例如，以确定新的引起疾病的突变的出现，以确定疾病抗性、特定信号传导通路的激活和/或失活的机制)。在一些实施方案中，测定免疫指数，其中在免疫调节室内已经重新创建的肿瘤微环境的组分(例如，相关免疫细胞、肿瘤细胞、基质材料)被用于测定对免疫疗法的无应答机制。通过检测生物标志物的存在或水平，本发明的方法可用于(例如，肿瘤细胞应答的)实时监测和/或生物标志物漂移。

在一些实施方案中，测量或检测生物标志物的水平包括测量或检测生物标志物物的激活状态(即，生物标志物是否被激活)或激活水平(即，生物标志物被激活的程度)。在具体的实施方案中，激活状态对应于生物标志物(例如蛋白质或信号转导分子)的磷酸化、泛素化和/或复合状态。激活状态(括号中所示的)的实例包括但不限于：HER1/EGFR(EGFRvIII、磷酸化的(p-)EGFR、EGFR:Shc、泛素化的(u-)EGFR、p-EGFRvIII)；ErbB2(p-ErbB2、p95HER2(截短的ErbB2)、p-p95HER2、ErbB2:Shc、ErbB2:PI3K、ErbB2:EGFR、ErbB2:ErbB3、ErbB2:ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3、截短的ErbB3、ErbB3:PI3K、p-ErbB3:PI3K、ErbB3:Shc)；ErbB4(p-ErbB4、ErbB4:Shc)；c-MET(p-c-MET、截短的c-MET、c-Met:HGF复合物)；AKT1(p-AKT1)；AKT2(p-AKT2)；AKT3(p-AKT3)；PTEN(p-PTEN)；P70S6K(p-P70S6K)；MEK(p-MEK)；ERK1(p-ERK1)；ERK2(p-ERK2)；PDK1(p-PDK1)；PDK2(p-PDK2)；SGK3(p-SGK3)；4E-BP1(p-4E-BP1)；PIK3R1(p-PIK3R1)；c-KIT(p-c-KIT)；ER(p-ER)；IGF-1R(p-IGF-1R、IGF-1R:IRS、IRS:PI3K、p-IRS、IGF-1R:PI3K)；INSR(p-INSR)；FLT3(p-FLT3)；HGFR1(p-HGFR1)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRA(p-PDGFRA)；PDGFRB(p-PDGFRB)；VEGFR1(p-VEGFR1、VEGFR1:PLCγ、VEGFR1:Src)；VEGFR2(p-VEGFR2、VEGFR2:PLCγ、VEGFR2:Src、VEGFR2：硫酸肝素、VEGFR2:VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；TIEl(p-TIEl)；TIE2(p-TIE2)；EPHA(p-EPHA)；EPHB(p-EPHB)；GSK-3β(p-GSK-3β)；NFKB(p-NFKB)、IKB(p-IKB、p-P65:IKB)；BAD(p-BAD、BAD：14-3-3)；mTOR(p-mTOR)；Rsk-1(p-Rsk-1)；Jnk(p-Jnk)；P38(p-P38)；STAT1(p-STAT1)；STAT3(p-STAT3)；FAK(p-FAK)；RB(p-RB)；Ki67；p53(p-p53)；CREB(p-CREB)；c-Jun(p-c-Jun)；c-Src(p-c-Src)；桩蛋白(p-桩蛋白)；GRB2(p-GRB2)、Shc(p-Shc)、Ras(p-Ras)、GAB1(p-GAB1)、SHP2(p-SHP2)、GRB2(p-GRB2)、CRKL(p-CRKL)、PLCγ(p-PLCγ)、PKC(例如，p-PKCα、p-PKCβ、p-PKCδ)、内收蛋白(p-内收蛋白)、RB1(p-RB1)和PYK2(p-PYK2)。

在一些实施方案中，生物标志物物是信号转导分子。信号转导分子包括在细胞外信号(例如刺激)的传递并将其翻译成应答(例如，在细胞内发生的一个或多个生化过程)中起各种作用的分子和蛋白质。信号转导分子的非限制性实例包括：受体酪氨酸激酶(RTK)，如EGFR(例如EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLk1/KDR、VEGFR3/FLT4、FLT3/FLK2、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体相关受体)、CSF-1R、FGFR 1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C、c-MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE 1-2、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS、V-钙粘蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(间变性淋巴瘤激酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3和RTK 106；受体酪氨酸激酶的截短形式，如具有缺失的氨基末端细胞外结构域的截短的HER2受体(例如，p95ErbB2(p95m)、p110、p95c、p95n等)、具有缺失的氨基末端细胞外结构域的截短的cMET受体和具有缺失的氨基末端细胞外结构域的截短的HER3受体；受体酪氨酸激酶二聚体(例如，p95HER2/HER3；p95HER2/HER2；具有HER1、HER2、HER3或HER4截短的HER3受体；HER2/HER2；HER3/HER3；HER2/HER3；HER1/HER2；HER1/HER3；HER2/HER4；HER3/HER4；等)；非受体酪氨酸激酶，如BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号传导级联成分，如AKT(例如AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PI3K(例如PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、PDK1、PDK2、磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)、SGK3、4E-BP1、P70S6K(例如，p70S6激酶剪接变体αI)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、RAF、PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、Rho、Rac1、Cdc42、PLC、PKC、p53、细胞周期蛋白D1、STAT1、STAT3、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)、磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、GSK-3β、RSK 1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；核激素受体，如雌性激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、雄性激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类维生素A受体、甲状腺激素受体和孤儿受体；核受体共激活因子和抑制因子，如分别在乳腺癌-1(AIB1)和核受体共抑制因子1(NCOR)中扩增的核受体共激活因子和抑制因；及它们的组合。信号转导分子的其它非限制性实例包括G-蛋白偶联受体(GPCR)，其包括在cAMP信号传导通路中起作用的那些受体和在磷脂酰肌醇信号传导通路中起作用的那些受体。

在一些实施方案中，确定生物标志物的存在包括检测特定基因型的存在。在具体的实施方案中，检测基因(例如，致癌基因)中一个或多个突变的存在。致癌基因是具有引起癌症的潜能的基因。致癌基因的非限制性实例包括：生长因子或有丝分裂原如c-Sis；受体酪氨酸激酶，如EGFR、HER2、PDGFR和VEGFR；胞质酪氨酸激酶，如Abl和Src家族、Syk-ZAP-70家族中的激酶和酪氨酸激酶的BTK家族；细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶和它们的调节亚单位，如PIK3CA、PIK3R1和RAF(例如，RAF-1、A-RAF、B-RAF)；调节性GTP酶，如RAS(例如，KRAS)；转录因子，例如MYC；及它们的组合。KRAS突变的非限制性实例包括G12S、G12D、G12A、G12V、G12R、G12C和G13D。BRAF突变的非限制性实例包括V600E、R461I、I462S、G463E、G463V、G465A、G465E、G465V、G468A、G468E、N580S、E585K、D593V、F594L、G595R、L596V、T598I、V599D、V599E、V599K、V599R、K600E和A727V。PIK3CA突变的非限制性实例包括E545A、E545G、E545K、Q546E、Q546K、H1047R、H1047L和3204insA。EGFR突变的非限制性实例包括外显子19中的缺失(如L858R、G719S、G719S、G719C、L861Q和S768I)以及外显子20中的插入(如T790M)。在一些情况下，检测基因中多于一个突变的组合。在其它情况下，检测多于一个基因中的突变。

来自个体的核酸的基因分型(无论是否扩增)都可以使用各种技术中的任一种来进行。有用的技术包括但不限于以下测定：如基于聚合酶链式反应(PCR)的分析测定、序列分析测定、电泳分析测定、限制性长度多态性分析测定、杂交分析测定、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接等位基因特异性延伸/连接、等位基因特异性扩增、单碱基延伸、分子倒置探针、侵入性切割、选择性终止、限制性长度多态性、测序、单链构象多态性(SSCP)、单链多态性、错配切割和变性梯度凝胶电泳，所有这些都可以单独或组合使用。如本文中所使用的，术语“核酸”包括多核苷酸，如单链或双链DNA或RNA分子，其包括例如基因组DNA、cDNA、微小RNA和mRNA。该术语涵盖了天然和合成来源的核酸分子以及代表天然核酸分子的有义链或反义链或两者的线性、环状或分支构型的分子。应当理解，此类核酸可以是未纯化的、纯化的、或例如与合成材料(如珠或柱基质)连接的。

含有核酸的材料通常从个体获得。此类材料是可以从其制备核酸的任何生物物质。作为非限制性实例，材料可以是含有核酸的全血、血清、血浆、唾液、面颊拭子、痰或其它体液或组织。在一个实施方案中，用全血实施本发明的方法，所述全血可通过非侵入性方式容易地获得并用于制备基因组DNA。在另一个实施方案中，基因分型涉及使用聚合酶链式反应(PCR)扩增个体的核酸。使用PCR扩增核酸是本领域熟知的(参见，例如Mullis等人(编辑)，聚合酶链反应(The Polymerase Chain Reaction)，

波士顿，(1994))。在另一个实施方案中，使用一种或多种荧光标记的引物进行PCR扩增。在另一个实施方案中，使用含有DNA小沟结合剂的一种或多种标记或未标记的引物进行PCR扩增。

本领域技术人员将容易地知道检测或测量各种生物标志物物的水平的方法。作为非限制性实例，肿瘤细胞(例如，循环肿瘤细胞)中生物标志物(例如，信号转导分子)的水平和/或激活状态可以使用基于抗体的方法(如20154年2月25日授权的美国专利第8,658,388号中所描述的那些方法，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文中)来检测或测量。

本发明的方法也可用于增强或增加治疗性疫苗接种的效力。作为非限制性实例，可以将疫苗细胞、抗原肽、患者特异性突变肽和/或溶瘤病毒引入免疫调节室中。免疫调节室内的局部环境增加了免疫细胞和/或肿瘤细胞对疫苗试剂的暴露。此外，本发明的方法可用于增强治疗，如溶瘤病毒治疗、放射治疗和/或化学疗法。这些疗法诱导炎性细胞因子并吸引先天性免疫细胞，所述细胞吞噬受损的肿瘤细胞并诱导它们在MHC的环境下经历肿瘤抗原的交叉呈递，这导致肿瘤特异性白细胞的激活。通过将溶瘤病毒、放射物和/或化学治疗剂引入免疫调节室环境中，可以使肿瘤细胞的暴露最大化，从而增加免疫细胞的激活，同时使对对象的全身副作用最小化。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗对象的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括根据本发明的方法激活免疫细胞。在具体的实施方案中，癌症包括实体瘤。

可以根据本发明的方法治疗的癌症的非限制性实例包括：妇科癌症(例如，卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌)；肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、类癌瘤、肺腺癌)；乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌、原位导管癌、浸润性导管癌、小管癌、髓样癌、粘液癌、乳头状癌、筛状癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、原位小叶癌、Paget病、叶状肿瘤)；消化道和胃肠道癌症，如胃癌(gastric cancer)(例如胃癌(stomach cancer))、结肠直肠癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和食道癌；甲状腺癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；前列腺癌(例如，前列腺腺癌)；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经系统的癌症(例如，脑癌，如成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、成神经管细胞瘤)；皮肤癌(例如黑素瘤)；骨和软组织肉瘤(例如，尤文氏肉瘤)；淋巴瘤；绒毛膜癌；泌尿系统癌(例如，尿路上皮性膀胱癌)；头部和颈部癌症；骨髓癌和血液癌(例如，急性白血病、慢性白血病(例如，慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)及它们的组合。如本文中所使用的“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。

在一些实施方案中，癌症选自：肺癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤及它们的组合。

在另一个方面，本发明提供了用于在对象中诱导针对肿瘤的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法包括根据本发明的方法激活免疫细胞。在一些实施方案中，肿瘤包含与免疫调节室内所限制(例如，在免疫调节室内的固体支撑物上所限制)的肿瘤细胞相似的肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤包含肿瘤细胞是在免疫调节室内(例如，在免疫调节室内的固体支撑物上所限制)所限制的相同类型的肿瘤细胞的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。

作为非限制性实例，肿瘤可以来自妇科癌症(例如，卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌)；肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、类癌瘤、肺腺癌)；乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌、原位导管癌、浸润性导管癌、小管癌、髓样癌、粘液癌、乳头状癌、筛状癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、原位小叶癌、Paget病、叶状肿瘤)；消化道和胃肠道癌症，如胃癌(gastric cancer)(例如胃癌(stomach cancer))、结肠直肠癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌或食道癌；甲状腺癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；前列腺癌(例如，前列腺腺癌)；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经系统的癌症(例如，脑癌，如成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤或成神经管细胞瘤)；皮肤癌(例如，黑素瘤)；骨或软组织肉瘤(例如，尤文氏肉瘤)；淋巴瘤；绒毛膜癌；泌尿系统癌(例如，尿路上皮性膀胱癌)；头部或颈部癌症；骨髓癌或血液癌(例如，急性白血病、慢性白血病(例如，慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、或它们组合。

在一些实施方案中，肿瘤来自选自以下的癌症：肺癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤及它们的组合。

本发明的方法可以进行任何合适的时间段。在一些实施方案中，对象中的免疫细胞被激活(例如，用于癌症治疗)约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个小时或更多个小时。在其它实施方案中，对象中的免疫细胞被激活约1、2、3、4、5、6、7天或更多天。在其它实施方案中，对象中的免疫细胞被激活约1、2、3、4周或更多周，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。本发明的方法可被用于连续或间歇地激活免疫细胞。在一些实施方案中，本发明的方法被用于在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单独的场合激活对象中的免疫细胞。

在一些实施方案中，治疗对象(例如，通过根据本发明的方法激活对象中的免疫细胞)或诱导针对肿瘤的免疫应答(例如，通过根据本发明的方法激活对象中的免疫细胞)包括抑制癌细胞生长、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移、抑制癌细胞侵袭、改善或消除癌症的症状、减小癌症肿瘤的大小(例如，体积)，减少癌症肿瘤的数目、减少癌细胞的数目、诱导癌细胞坏死、细胞焦亡、细胞胀亡、细胞凋亡、自噬或其它细胞死亡，或增强组合物或药物组合物的治疗效果。在一些实施方案中，治疗对象或诱导针对肿瘤的免疫应答导致增加的存活时间。在一些情况下，总体存活期增加。在其它情况下，无病存活期增加。在一些情况下，无进展存活期增加。在具体的实施方案中，治疗对象或诱导针对肿瘤的免疫应答导致肿瘤体积的减小和/或存活时间增加。

在具体的实施方案中，治疗对象或诱导针对肿瘤的免疫应答增强抗癌疗法(如化学治疗剂、免疫治疗剂、放射疗法、激素疗法、分化剂和/或小分子药物)的治疗效果。

IV.实施例

将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例仅用于说明性目的，而不是旨在以任何方式限制本发明。

实施例1.人源化的小鼠模型

该实施例描述了使用人源化的小鼠模型来证明本发明的方法激活靶向肿瘤的自体白细胞的能力并提高它们杀死肿瘤细胞的能力。

将人源化的NSG-SGM3小鼠(可获自巴尔港的杰克逊实验室(JacksonLaboratories in Bar Harbor)，ME)用于研究。图5中描绘了人源化的小鼠模型的产生。NSG-SGM3是高度免疫缺陷的小鼠，并且可被用于植入人造血干细胞以产生人源化的小鼠模型。这些小鼠产生人干细胞因子(SCF)、粒细胞/巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-2(IL2)，其表达由巨细胞病毒启动子驱动。

将人源化的NSG-SGM3小鼠保存并饲养在特定的无病原体动物设施中。新生的或3至4周龄的小鼠被亚致死性辐射(例如，使用1Gy的剂量)。随后，小鼠接受包含2×10⁵个CD34⁺干细胞的尾静脉注射，所述CD34⁺干细胞是使用MACS细胞分离系统根据制造商的方案(Miltenyi Biotech)从人脐带血分离的。可替代地，通过尾静脉给小鼠注射CD34⁺干细胞，所述CD34⁺干细胞富集自经由单采血液成分术程序从癌症患者收集的外周血单个核细胞(PBMC)。通过在尾静脉注射后12周获得PBMC，在一只小鼠中证实了人造血细胞的移植。使用流式细胞术用针对各种类型白细胞(例如，hu-CD45⁺、hu-CD3⁺)的探针进行分析，以定量骨髓样细胞群(例如，巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Mmst细胞、红细胞祖细胞)和淋巴细胞群(例如，CD4⁺和CD8⁺T细胞、Treg、B细胞、NK细胞)。

随后，将患者来源的异种移植(PDX)肿瘤皮下植入人源化的CD34-NSG-SGM3(hu-CD34-NSG-SGM3)小鼠(在图5中描绘为阴影小鼠)。当PDX肿瘤达到适当的尺寸(例如，植入后约6至8周)时，使用肿瘤细胞和基质材料(例如，基质细胞、基质成分)制备免疫调节室，所述肿瘤细胞和基质材料被收集(例如，通过细针抽吸(FNA)收集)并引入免疫调节室中。将肿瘤细胞和基质材料在37℃下用CO₂在组织培养培养箱中孵育24小时。在收集和/或孵育期间，提供适当的培养基。此外，适当时，将细胞和基质材料与促炎细胞因子(例如，IL2、IL7、IL12、IL15、IL18、IL21、IFNβ、TNFα、GM-CSF)一起孵育。通过将这些刺激性细胞因子限制在免疫调节室的范围内，可以在对象中避免与这些试剂的高浓度相关的全身毒性作用。此外，通过在免疫调节室中共孵育肿瘤特异性白细胞和肿瘤细胞，肿瘤特异性白细胞可以容易地识别肿瘤细胞，而不必“渗入”基质层。此外，适当时，将可获得的免疫肿瘤剂加入免疫调节室中以增强特异性免疫激活。合适的免疫肿瘤剂包括但不限于免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA4抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗OX40抗体和抗CD137抗体)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。

如图5中所示的，在24小时孵育时间后，将含有捕获的肿瘤和基质材料的免疫调节室与离体循环网络连接。在组织培养培养箱中维持循环网络。

使用具有22号皮下注射针的1mL注射器，每5天经由侧隐静脉从hu-CD34-NSG-SGM3小鼠静脉内收集PBMC。该程序包括麻醉小鼠，从小腿的侧面修剪毛发，用酒精拭子为手术部位做准备并允许干燥，在穿刺部位上施加基于石油的润滑剂薄膜，在拇指和食指之间的膝关节上方收缩侧隐静脉，并收集约200μL至300μL的血液。随后将收集的PBMC引入免疫调节室中。

在免疫细胞暴露于免疫调节室中的肿瘤细胞和基质材料之后，评估免疫调节室内的肿瘤细胞的应答(图6)。为了评估通过本发明的方法激活的免疫细胞抑制肿瘤细胞生长的能力，从离体循环网络收集激活的PBMC(例如，约250μL)并将其注射到具有残余肿瘤的小鼠中。通过加温尾部(例如，将尾部包裹在触摸温暖(但不是热的)的电加热垫中)，将止血带围绕尾巴的底部放置以有利于静脉的可视化，以及限制小鼠(例如，在树脂玻璃(Plexiglas)限制器中)来准备用于静脉内注射的小鼠。通过将与1mL注射器连接的27号皮下注射针插入到近似平行于静脉的皮肤中，将激活的PBMC注射到小鼠中。每天重复注射程序(例如，总共约5次)并监测小鼠中的肿瘤体积的变化。

实施例2.体外单采血液成分术-肿瘤模型

该实施例描述了使用体外模型来证明本发明的方法激活靶向肿瘤的自体白细胞的能力并提高它们杀死肿瘤细胞的能力。特别地，该实施例证明了第二免疫调节室用作通过本发明的方法待治疗的对象的体外替代物的用途。

在该研究中，从对象(例如，癌症患者)获得细针抽吸物(FNA)样品和核心活组织检查样品，以及匹配的PBMC(例如，经由单采血液成分术获得)。将从FNA获得的肿瘤细胞和基质材料(例如，基质细胞和其它基质成分)引入第一免疫调节室中，并在组织培养培养箱中在37℃下用CO₂孵育24小时。在收集和/或孵育期间，提供适当的培养基。此外，适当时，将细胞和基质材料与促炎细胞因子(例如，IL2、IL7、IL12、IL15、IL18、IL21、IFNβ、TNFα、GM-CSF)一起孵育。通过将这些刺激性细胞因子限制在免疫调节室的范围内，可以在对象中避免与这些试剂的高浓度相关的全身毒性作用。此外，通过在免疫调节室中共孵育肿瘤特异性白细胞和肿瘤细胞，肿瘤特异性白细胞可以容易地识别肿瘤细胞，而不必“渗入”基质层。此外，适当时，将可获得的免疫肿瘤剂加入免疫调节室中以增强特异性免疫激活。合适的免疫肿瘤剂包括但不限于免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA4抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗OX40抗体和抗CD137抗体)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。如图7中所示的，在24小时孵育时间之后，将含有捕获的肿瘤和基质材料的第一免疫调节室与离体循环网络连接。

将从核心活组织检查获得的组织解离成单个细胞并引入第二免疫调节室中。作为一种可替代的选择，使用酶促解离。通过用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶、链霉蛋白酶、脱氧核糖核酸酶或其它适当的酶进行温和的酶促处理，将轻轻切碎的组织消化成单细胞悬浮液。作为第二种可替代的选择，使用化学解离。用EDTA、EGTA或四苯基硼加钾离子的复合物处理轻轻切碎的组织以螯合多种类型的阳离子(如Ca²⁺和Mg^{2 +})。

将解离的肿瘤和基质细胞在免疫调节室中(例如在磁板上)于37℃、2至5％的CO₂下用适当培养基中培养。一旦免疫调节室重新充满肿瘤/基质内容物，用PBS洗涤免疫调节室3×以除去任何未结合的碎片。

如图7所描绘的，例如通过单采血液成分术收集的PBMC被注射到循环网络中。使用恒定泵来循环内容物。使用交替的循环泵速度。作为一个实例，循环改变包括以10cm/秒1分钟，然后以0.1cm/秒5分钟，然后以1cm/秒1分钟。可以使用任何交变速度的组合来确保充足的循环和充分的PBMC-肿瘤细胞相互作用。当PBMC暴露于第一免疫调节室的内容物时，它们被激活。

如图8中所示的，当在第二免疫调节室中建立肿瘤/基质集落时，将第二室置于循环回路模块中。然后监测第二免疫调节室中的肿瘤/基质集落对激活免疫细胞的应答。

实施例3.自体免疫细胞的体外激活

该实施例描述了体外自体免疫细胞激活实验，其设置描述于图9中。该实验分别利用不同标记的同系鼠肿瘤细胞和鼠免疫细胞，即绿色荧光蛋白(GFP)标记的鼠肿瘤胰腺细胞和红色荧光蛋白(RFP)标记的免疫细胞。使用鼠胰腺腺癌细胞系Pan02(最初来源于小鼠品系C57BL/6并且获自美国国家癌症研究所的肿瘤储存库(the National CancerInstitute’s tumor repository)，弗雷德里克，MD)和Suetsugu等人(Anticancer Res.(2015)35(5):2553-2557)在文章中所描述的方法开发GFP标记的胰腺肿瘤模型。简言之，用组蛋白H2B-GFP融合基因转导亲本Pan02细胞，并建立稳定的克隆。因此，由于融合基因表达，所得细胞系(下文称为Pan02-H2bGFP)展现出明亮的核GFP荧光。如图9中所示的，在第0天，将Pan02-H2bGFP细胞以2×10⁵个细胞/平皿接种到标记为“A”至“C”的三个单独培养皿上，并且随后在不同条件下培养7天。平皿“A”(仅肿瘤细胞)和平皿“B”(在白细胞介素2(IL-2)存在下生长的肿瘤细胞)作为阴性对照。相反，从转基因RFP标记的C57BL/6小鼠(杰克逊实验室(Jackson Labs)，巴尔港，ME)新鲜提取的脾细胞和骨髓来源的免疫细胞在第0天加入到平皿“C”中的肿瘤细胞中(10⁷个RFP免疫细胞/平皿)，并且共培养物在IL-2存在下生长7天。48小时后，将RFP标记的外周血单个核细胞(PBMC)(即，从转基因RFP-C57BL/6小鼠新提取的)引入共培养物“C”(即，2.87×10⁵个PBMC/平皿)中，然后放置另外的5天的生长期。当表示时，所有培养物在补充有10％胎牛血清和IL-2(32U/mL)的标准细胞培养基中生长，在实验过程中培养基没有变化。定期监测培养物并用光学显微镜和荧光显微镜捕获细胞图像。

如图10中所示的，在IL-2存在下，免疫细胞和肿瘤相互作用在24小时内是可见的。直到第7天观察到同系IL-2刺激的免疫细胞和肿瘤细胞之间的相互作用(参见图10)。值得注意地是，在第7天观察到免疫细胞和肿瘤细胞之间更强烈的相互作用。该数据表明在肿瘤抗原以及IL-2存在下足以在体外快速刺激并激活免疫细胞。这证明使用含有捕获的肿瘤细胞(即抗原)的体外装置的自体抗肿瘤免疫细胞激活可以在IL-2存在下完成。

如图11中所示的，在类似的实验中，在存在或不存在IL-2的情况下，来源于B16F10细胞的GFP标记的鼠黑素瘤细胞(如Tsai等人，Anticancer Res.(2010)30(9):3291-3294中所述的)与从RFP-C57BL/6小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，ME)提取的同系RFP免疫细胞共培养。通过荧光显微镜观察并分析共培养物直到第4天。当细胞在IL-2存在下生长时，在第2天和第3天观察到表达RFP的免疫细胞和GFP肿瘤细胞之间的大量广泛的相互作用。相反，当共培养物在不存在IL-2的情况下生长时，这些相互作用是不可见的(图11)。这些结果表明，IL-2的存在对于触发免疫细胞识别它们的靶标(即肿瘤抗原)是至关重要的，并且突出了在体外装置的背景下，在肿瘤抗原存在下细胞因子引发对于有效的自体抗肿瘤免疫细胞激活的重要性。相关地，该实施例突出了本发明的特定优点-激活免疫调节室中的免疫细胞不仅增加了免疫细胞对肿瘤细胞的暴露，而且还允许以对象(例如，癌症患者)不全身性暴露于刺激剂的方式进行的免疫细胞的刺激(例如，在IL-2存在下)，从而最小化不希望的副作用。

实施例4.用于免疫细胞激活的体外装置

在本实施例所述的实验中，来源于B16F10细胞的GFP标记的鼠黑素瘤细胞(如Tsai等人，Anticancer Res.(2010)30(9):3291-3294中所述的)在允许3D细胞在嵌入的基质(

装置，Rigenerand，意大利)内生长的特殊组织培养装置中培养。这些专门的培养容器被用作体外免疫调节室。在该实验中，如图12中所示的和下面进一步所描述的，使用三个免疫调节室(“室”)，并在第0天接种B16F10-GFP细胞。

室1是对照室并且仅含有肿瘤细胞。在第3天和第5天，将新鲜培养基加入到该室中。

室2是测试室。该室最初用肿瘤细胞接种。在第3天和第5天，将来自训练室(即室3)的上清液(s/n)转移到室2，所述训练室是在IL-2存在下的肿瘤免疫细胞共培养物。在第3天，将收集的室3上清液的一半加入到新鲜培养基(1:1)中，然后转移到室2中。在第5天，收集来自室3的所有上清液并直接转移到室2。对于上清液转移，收集上清液并旋转以分离细胞内容物并完全去除IL-2(即，最小化来自室3的IL-2的遗留)，然后将分离的细胞内容物转移至室2。受刺激的免疫细胞以自分泌方式产生它们自己的刺激细胞因子的能力使得激活的免疫细胞能够识别单独环境中的肿瘤细胞并引发抗肿瘤免疫应答。室2的目的是用作根据本发明的方法待治疗癌症的对象(例如，癌症患者)的体外模型。

室3是训练室。该室含有从第0天起在IL-2存在下生长的肿瘤免疫细胞共培养物。肿瘤细胞是B16F10-GFP鼠黑素瘤细胞，并且从RFP-C57BL/6小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，ME)中提取同系RFP免疫细胞(骨髓和脾脏)。在第3天，收集来自室3的上清液并以1:2分开。用不含IL-2的新鲜培养基重构一半(1:1)并加入到室2中，而用含IL-2的新鲜培养重构另一半(1:1)并加回到室3中。在第5天，收集所有来自室3的上清液并直接转移到室2中，并将补充有IL-2的新鲜培养基添加到室3中。如上所述，对于上清液转移，旋转上清液以分离细胞内容物并去除IL-2，然后将分离的细胞内容物转移到室2中。

如图12中所示的，在不同的时间点拍摄监测免疫细胞和肿瘤细胞相互作用的荧光图像。免疫调节室培养物的代表性荧光图像显示在训练室(室3)中的免疫细胞和肿瘤细胞相互作用在第2天是可见的(参见图13)。令人惊讶地是，在第4天，一旦在第一次从训练室转移到测试室24小时后，在测试室中免疫细胞和肿瘤细胞相互作用是可见的。直到第6天，这些免疫细胞和肿瘤细胞相互作用仍然可见(图13)。这些结果表明，在体外装置中被刺激和激活以识别肿瘤细胞的自体免疫细胞在转移到不同的体外装置时能够识别它们的靶标(即肿瘤抗原)。此外，该实施例模拟激活的抗肿瘤免疫细胞循环至远处转移部位的假转移肿瘤区域模型。

实施例5.用于体外自体免疫细胞疗法的体内动物模型

在图14中总结了该实施例中所描述的实验，并利用与上述实施例3中所描述相同的差异标记的同系鼠肿瘤细胞和鼠免疫细胞，即从转基因RFP-C57BL/6小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，ME)提取的Pan02-H2bGFP细胞和RFP标记的免疫细胞。在该实验中，标准C57BL/6小鼠在第0天接受腹膜内注射Pan02-H2bGFP细胞(2×10⁷个细胞/小鼠)，以便在其腹膜腔中产生散播性胰腺肿瘤模型。然后将小鼠分成三组，如图14中所示的和在下面进一步描述的。

第1组为对照组。这些小鼠在实验过程中没有接受任何RFP标记的免疫细胞的注射，并且仅依靠它们的宿主免疫系统来阻断GFP标记的胰腺肿瘤细胞的生长。

第2组为测试组。这些小鼠在第1天和第3天接受两次单独注射脾脏和骨髓来源的RFP免疫细胞，它们在IL-2存在下与Pan02-H2bGFP细胞已经共培养6天(2.83×10⁶个RFP免疫细胞/小鼠)。换句话说，这些小鼠被注射刺激的和肿瘤训练过的RFP免疫细胞。

组3为基线组。这些小鼠在第1天和第3天接受两次单独注射脾脏和骨髓来源的RFP免疫细胞，它们在存在IL-2但没有任何Pan02-H2bGFP肿瘤细胞的情况下已经培养6天(1.76×10⁶个RFP免疫细胞/小鼠)。换句话说，这些小鼠被注射刺激的和未训练过的RFP免疫细胞。

该实验被设计成测试在体外装置中体外刺激和肿瘤训练过的自体免疫细胞当被转移到具有与所训练的免疫细胞针对的肿瘤类型相同的肿瘤类型的活生物体中时能够发挥抗肿瘤活性的假说。预期在对照组中将发生最强壮的肿瘤生长。相反，预期在测试组中观察到降低的肿瘤负荷，并且在基线组中观察到中间肿瘤生长。

在特定的时间点，每组处死一只小鼠并捕获体腔的明场图像以及荧光图像以确定GFP肿瘤生长的程度。此外，从外周血收集PBMC并通过血细胞计数分析。图15显示在该实验的第6天处死的每组的一只动物所获得的结果。可见的肿瘤存在于对照和第3组小鼠的腹膜腔中，而在第2组测试小鼠的腹膜腔中没有观察到(明场全身图像的比较，图15)。此外，表达GFP的肿瘤细胞和/或GFP肿瘤细胞碎片在膀胱和沿着对照小鼠小肠壁的整个内脏空间中是可见的。然而，如所预期的，没有观察到表达RFP的免疫细胞，因为这些小鼠没有注射免疫细胞。荧光肿瘤细胞和/或肿瘤细胞碎片在第3组小鼠的膀胱中也是可见的，但是荧光强度整体上比对照小鼠弱。相比之下，来自第2组的测试小鼠的荧光成像没有发现GFP胰腺肿瘤细胞的证据(参见图15)。如所预期的，最强壮的肿瘤生长存在于对照小鼠中，而测试小鼠显示缺乏可见的肿瘤生长和/或荧光肿瘤细胞。这些结果证明，在测试小鼠中发生有效的抗肿瘤免疫应答，最有可能通过体外刺激和抗肿瘤训练过的RFP免疫细胞进行，所述RFP免疫细胞在该测试组中被注射到小鼠的腹膜腔中。实际上，从测试小鼠2的外周血中收集的PBMC的细胞计数分析显示存在大量循环RFP免疫细胞(参见图15)。该数据证明，注射到该动物体内的激活的抗肿瘤训练过的RFP免疫细胞在体内扩增并进入循环。此外，通过对来自测试小鼠2的血液进行细胞计数分析，证实了显著的RFP阴性免疫细胞群(图15)。这证明由体外训练过的RFP免疫细胞引发的抗肿瘤免疫应答随后触发宿主免疫细胞的免疫应答，导致宿主(即，未标记的)抗肿瘤免疫细胞的扩增。从第3组中的小鼠血液收集的数据显示了循环RFP免疫细胞以及一些未标记的免疫细胞的一些证据(图15)。然而，这两个群体都很小，这表明在该动物中，在第6天时没有产生强烈的抗肿瘤免疫应答，未训练过的RFP免疫细胞和宿主免疫细胞都没有在体内扩增。如所预期的，没有证据表明在从对照小鼠收集的血液中循环RFP免疫细胞。

此外，如图16中所示的，在第17天，在仅有肿瘤的小鼠(第1组)中可见的肿瘤是明显的(图16A-图16C)，而在注射训练过的免疫细胞的小鼠(第2组)中未发现明显的肿瘤(图16D-图16F)。血细胞计数数据显示在可疑肿瘤结节和来自仅肿瘤小鼠(第1组)的网膜中存在GFP阳性肿瘤细胞(图16C的左图和中图中的实线框，其显示与前向散射(y轴)相关的GFP荧光(x轴))，而在PBMC中没有检测到RFP阳性免疫细胞(图16C的右图)。另一方面，血细胞计数分析显示在实验小鼠(第2组)的可疑肿瘤结节或网膜中没有GFP阳性肿瘤细胞的证据(图16F的左图和中图)，而在PBMC中检测到RFP阳性免疫细胞(图16F的右图)。

总的来说，这些结果表明，免疫细胞在体外装置中初始刺激和抗肿瘤训练过后，然后转移到具有肿瘤的活生物体中，能够在该生物体中诱导抗肿瘤免疫应答。该应答涉及上述刺激的和抗肿瘤训练过的免疫细胞，以及宿主免疫细胞。该数据还强调了在转移之前在体外装置中刺激和训练免疫细胞的重要性，以便触发强烈的抗肿瘤免疫应答。

应当理解，在本文中所描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围内。本文中所引用的所有出版物、专利、专利申请和序列登记号在此通过引用整体并入以用于所有目的。

Claims (67)

1.用于激活对象的免疫细胞的方法，所述方法包括：

(a)使来自所述对象的免疫细胞穿过免疫调节室，从而使所述免疫细胞暴露于肿瘤细胞并激活所述免疫细胞，其中所述免疫调节室包括固体支撑物和被限制在所述免疫调节室内的固体支撑物上的所述肿瘤细胞，和

(b)将激活的免疫细胞返回所述对象。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是离体进行的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法增加所述对象的自体免疫应答。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法减少或消除所述对象的全身治疗的副作用。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是白细胞或外周血单个核细胞(PBMC)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述免疫调节室还包括被限制在所述固体支撑物上的基质细胞和/或基质成分。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含在获自所述对象的全血样品中。

8.根据权利要求7所述的方法，其中使所述全血样品穿过所述免疫调节室。

9.根据权利要求7所述的方法，其中从所述全血样品中分离含有免疫细胞的部分，并且使所述全血样品的含有免疫细胞的部分通所述过免疫调节室。

10.根据权利要求9所述的方法，其中使用过滤方法分离所述全血样品的含有免疫细胞的部分。

11.根据权利要求9所述的方法，其中使用单采血液成分术分离所述全血样品的含有免疫细胞的部分。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中通过使所述全血样品穿过与所述免疫调节室流体连通的分离装置来分离所述全血样品的含有免疫细胞的部分。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中在将所述全血样品的含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分返回所述对象之前，从所述全血样品的含有免疫细胞的部分和/或含有非免疫细胞的部分中去除免疫抑制因子和/或对所述对象具有副作用的因子。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述免疫调节室还包括入口和/或出口。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述入口和/或所述出口与所述对象的血管系统、腹膜腔、胸膜腔或脑脊髓液(CSF)流体连通。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述入口和/或出口与所述对象的静脉系统流体连通。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述入口和/或出口与所述对象的动脉系统流体连通。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞包含肿瘤细胞裂解物。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞包含多种肿瘤细胞。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞获自活组织检查切片、细针抽吸物(FNA)、手术切除物、血液样品、胸腔积液样品、腹膜积液样品、CSF样品、或它们的组合。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞包含自体肿瘤细胞和/或自体肿瘤细胞裂解物。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞包含同种异体肿瘤细胞和/或同种异体肿瘤细胞裂解物。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中在所述免疫细胞穿过所述免疫调节室之前，将所述肿瘤细胞引入所述免疫调节室中。

25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中在所述免疫细胞穿过所述免疫调节室的同时或之后，将所述肿瘤细胞引入所述免疫调节室中。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤细胞包含在全血样品或其含有免疫细胞的部分中，并且当所述血液样品或其含有免疫细胞的部分穿过所述免疫调节室时，所述肿瘤细胞被限制在所述免疫调节室内的所述固体支撑物上。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述肿瘤和/或基质细胞被捕获部分限制在所述固体支撑物上。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述捕获部分还促进肿瘤和/或基质细胞的增殖。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述捕获部分选自抗体、细胞粘附分子及它们的组合。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体是能与以下结合的抗体：上皮细胞粘附分子(EpCAM)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA-125)、MUC1、CD44、HER2、HER3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、c-Met、EGFR、PD-L1、或它们的组合。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞粘附分子选自：选择素、整合素、血管细胞粘附分子1(VCAM1)及它们的组合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述选择素选自E-选择素、L-选择素及它们的组合。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述免疫调节室还包含促免疫原性因子。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述促免疫原性因子是免疫刺激因子、抗免疫抑制因子、或它们的组合。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫刺激因子选自：白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素22(IL-22)、C-X-C趋化因子受体3(CXCR3)、干扰素γ(INFγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及它们的组合。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述免疫刺激因子是IL-2。

37.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗免疫抑制因子选自免疫检查点抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂及它们的组合。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制程序性细胞死亡1配体1(PDL1)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、T细胞免疫球蛋白3(TIM3)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、或它们的组合。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述免疫调节室还包含对象特异性突变肽。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述对象特异性突变肽选自包含激活突变的EGFRvIII肽、p95HER2肽、EGFR肽及它们的组合。

41.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其中所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物连接。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述固体支撑物包括所述免疫调节室的内表面或与所述免疫调节室的内表面接触的支撑结构，并且任选地还包含磁性组分。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述支撑结构包含基质。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物共价连接。

45.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物磁性连接。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽包含磁性颗粒。

47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述固体支撑物包含磁性组分，并且所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述磁性组分磁性连接。

48.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述免疫调节室外部的电磁场被用于将所述捕获部分、促免疫原性因子和/或对象特异性突变肽与所述固体支撑物磁性连接。

49.根据权利要求1至48中任一项的方法，其中通过暴露于溶瘤病毒、放射物和/或化学治疗剂来诱导所述肿瘤细胞经历细胞凋亡。

50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述对象被施用嵌合抗原受体T细胞。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述免疫调节室还包括流量调节器。

52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述免疫调节室还包括泵。

53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述流量调节器和/或所述泵被用于调节所述免疫细胞穿过所述免疫调节室的速率。

54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中通过使用所述流量调节器和/或所述泵来调节穿过所述免疫调节室的全血的流速和/或通过调节穿过所述免疫调节室的红血细胞的数目或密度来控制所述免疫调节室内的氧气的可用性。

55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中使用多个免疫调节室。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述多个免疫调节室各自彼此流体连通。

57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述多个免疫调节室的每一个包括不同的肿瘤细胞。

58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中用第二免疫调节室替换第一免疫调节室。

59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中在所述免疫细胞已经穿过所述免疫调节室之后，从所述免疫调节室去除所述肿瘤细胞，并检测所述肿瘤细胞中一种或多种生物标志物的存在或水平。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的存在或水平被用于向所述对象提供诊断和/或选择用于所述对象的疾病的治疗。

61.治疗对象的癌症的方法，所述方法包括根据权利要求1至60中任一项所述的方法激活免疫细胞。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。

63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述癌症选自：肺癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤及它们的组合。

64.用于在对象中诱导针对肿瘤的免疫应答的方法，所述方法包括根据权利要求1至60中任一项所述的方法激活免疫细胞。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述肿瘤包含所述免疫调节室内的所述固体支撑物上所限制的相同类型的肿瘤细胞。

66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。

67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，其中所述肿瘤来自选自以下的癌症：肺癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤及它们的组合。

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