CN111084787A - 一种抗肿瘤微颗粒的制备方法、药剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，包括以下步骤：1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；2)将所述步骤1)得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；3)将所述步骤2)得到的混合物进行梯度离心，即得到所述抗肿瘤微颗粒。本发明还提供一种抗肿瘤微颗粒药剂，由抗肿瘤微颗粒通过纯化和浓缩而获得。本发明提供的抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒可用于制备抗肿瘤药物。本发明可解决常规放疗不能适用的技术问题。

Description

一种抗肿瘤微颗粒的制备方法、药剂及应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤领域，更特别地，涉及一种抗肿瘤微颗粒的制备方法、药剂及应用。
背景技术
放射治疗是临床常规治疗肿瘤的有效治疗手段，肿瘤放射治疗是利用放射线产生的电离辐射来治疗肿瘤的一种局部治疗方法。大约70％以上的肿瘤患者在治疗的过程中需要用放射治疗，约有40％的癌症可以用放疗根治。放疗导致的旁观者效应(radiation-induced bystander effect，RIBE)是指射线辐射细胞后，不仅会导致被照射细胞死亡，还会导致未受到辐射的周围细胞死亡。研究发现，放疗诱导细胞释放的微颗粒是导致旁观者效应的主要效应产物。但是这种微颗粒目前尚没有完备的制取方法，无法扩展因放疗技术原因造成的放疗局限性问题。
发明内容
本发明提供了一种抗肿瘤微颗粒的制备方法、药剂及应用，该抗肿瘤微颗通过间接放疗实现抗肿瘤，解决常规放疗不能适用的技术问题。
本发明是由以下技术手段实现的：
一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
2)将所述步骤1)得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；
3)将所述步骤2)得到的混合物进行离心，即得到所述抗肿瘤微颗粒，该微颗粒为磷脂双分子层组成的囊泡样结构，直径为100-1000nm之间(见图1和图2)。
步骤3)中所述离心包括依次进行第一离心、第二离心、第三次离心所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟，得上清；第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三次离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为微颗粒。
所述步骤2)的X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV，所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天。
所述肿瘤细胞系包括人源性和鼠源性的多种细胞系：人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100,人肺癌细胞系A549、H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系HONE1、小鼠黑色素瘤细胞系B16、小鼠肺癌细胞系Lewis细胞等；所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔或腹腔积液或实体瘤。
一种抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒，所述抗肿瘤微颗粒为携载活性氧ROS的微囊泡结构，所述微囊泡结构的粒径为100-1000nm；所述抗肿瘤微颗粒的携氧量不低于细胞内活性氧量。
一种抗肿瘤微颗粒药剂，由所述的抗肿瘤微颗粒通过纯化和浓缩而获得。
一种抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明具有以下优点：
①对不能进行放射治疗的肿瘤，可以采用本技术制得药剂实现间接放疗；
②相较于放疗，本技术可通过静脉注射药剂，反复多次给药，可实现对转移瘤起到抑制作用；
③自体来源的微颗粒制得的药剂具有较好的生物安全性和生物相容性；
④制备工艺简单，便于规模化生产；
⑤功能可扩展：自组装多肽材料可联合小分子靶向抑制剂，或直接再负载化疗药物直接杀伤肿瘤。
附图说明
图1为本发明放疗产生微颗粒的电镜图；
图2为本发明放疗产生微颗粒的粒径图；
图3为本发明放疗产生微颗粒产量与放射剂量的关系；
图4为本发明放疗微颗粒针对自体肿瘤细胞的杀伤效应统计图；
图5为比较不同来源的微颗粒对自体肿瘤细胞的杀伤效应统计图；
图6为本发明放疗微颗粒的广谱肿瘤杀伤效应的统计图；
图7为本发明放疗微颗粒ROS含量检测流式图；
图8为本发明放疗微颗粒导致巨噬细胞极化的流式及相应统计图
图9为本发明放疗微颗粒治疗恶性胸腔积液小鼠生存分析图；
图10为本发明放疗微颗粒治疗实体瘤过程中瘤体的体积统计图；
图11为本发明放疗微颗粒静脉给药治疗远处肺转移的效果图；
图12为本发明放疗微颗粒联合PD-1单抗治疗恶性胸腔积液的小鼠生存分析；
图13为本发明放疗微颗粒胸腔给药时小鼠的体重变化图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明涉及一种可替代放射治疗进行间接放疗的抗肿瘤技术，其主要包括一种自体来源的抗肿瘤微颗粒的研制，所述抗肿瘤微颗粒来源于放射线处理肿瘤细胞而产生。所述抗肿瘤微颗粒，具有广谱的抗肿瘤活性，不仅可有效杀伤自体来源的肿瘤细胞，而且可以杀伤非自体来源的肿瘤细胞。可对恶性胸腔积液进行抑制，也可对实体瘤起到控制作用；可局部给药，也可以静脉全身给药。其抗肿瘤原理主要涉及大量活性氧的运载，以及调控肿瘤免疫微环境，如促进巨噬细胞的重编程。所述抗肿瘤微颗粒完全来自自体肿瘤细胞，生物安全性和生物相容性好。抗肿瘤微颗粒也可以负载化疗药物、靶向药物、单抗药物等直接作用于肿瘤。
本发明的具体原理如下：
微颗粒(microparticle)是一种能被多种活细胞分泌，直径为100～1000nm，并广泛分布于多种体液中的微囊泡结构。近10年来研究发现微颗粒因为其富含蛋白质、DNA、RNA和脂质等生物活性分子而参与细胞之间的信号交流，微颗粒可以直接携带信号分子，也可以将肿瘤细胞的Fas配体转移至T细胞从而介导免疫逃逸，甚至介导基因信息的传递。微颗粒适用于局部治疗，有研究将微颗粒包裹化疗药物治疗MPE取得了一定的效果，但是其抗肿瘤效果有限，其部分原因在于该微颗粒载体本身并无抗肿瘤效果。
在放射治疗肿瘤过程中，其生物效应很大程度上是通过直接或间接产生大量活性氧(reactive oxygen speties，ROS)进而造成肿瘤细胞DNA损伤。大量研究表明，放疗能促使肿瘤细胞分泌微颗粒。在一定的条件下，放疗导致肿瘤细胞释放的微颗粒也会高度富集ROS，因此也具备较好的抗肿瘤效应。此外，该放疗微颗粒可使肿瘤相关巨噬细胞重编程，促进肿瘤微环境向抗肿瘤方向发展。利用在体外放疗产生的微颗粒技术，可获得含有大量含ROS的微颗粒，将这些微颗粒回输，将会为肿瘤治疗提供更有效和安全的局部治疗手段，进而实现间接放疗的目的。
一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
2)将所述步骤1)得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；
3)将所述步骤2)得到的混合物进行离心，即得到所述抗肿瘤微颗粒。
步骤3)中所述离心包括依次进行第一离心、第二离心、第三次离心，所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟，得上清；第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三次离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为微颗粒。
所述步骤2)的X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV，所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天。
所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。
所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。
一种抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒，所述抗肿瘤微颗粒为携载活性氧ROS的微囊泡结构，所述微囊泡结构的粒径为100-1000nm；所述抗肿瘤微颗粒的携氧量不低于细胞内活性氧量。
一种抗肿瘤微颗粒药剂，由所述的抗肿瘤微颗粒通过纯化和浓缩而获得。
一种抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
在使用放疗照射肿瘤细胞后，细胞将分泌微颗粒。所得到的微颗粒具有广谱的抗肿瘤能力，即既可以杀伤供体肿瘤细胞，又可以杀伤其它类型的肿瘤细胞。本发明中，所述微颗粒抗保存抗肿瘤活性的储存条件为4℃和7天以内。
在实验过程中试验了包括多种方式处理肿瘤细胞而产生的微颗粒，结果发现只有放疗产生的微颗粒具有杀伤活性。通过抑制其ROS活性，发现放疗微颗粒的杀伤活性受到抑制，证明其主要通过运载ROS而起到杀伤作用。本发明所述放疗微颗粒的结构如图1所示，粒径大小如图2所示。
图1为通过2-30Gy、6MV的X射线放疗后的肿瘤细胞微颗粒电镜下的代表图，可见其为球形囊泡样结构，粒径约为500nm。
图2为通过马尔文粒径分析仪，分析微颗粒的粒径，得出该微颗粒粒径分布在100-1000nm。
下文结合实施例对本发明的效果作进一步解释和验证。
1.构建并BCA定量具有杀伤效应的放疗微颗粒以及保存方法
图3代表不同放疗剂量时，每1000万个肿瘤细胞所释放的微泡量(以蛋白含量计)。
在10mm×10mm的培养皿中用10％FBS(胎牛血清)的培养基培养肿瘤细胞，待皿中细胞达到约5×106个时，以20GY的剂量进行放疗，放疗后的第一天换液，加入20ml含10％FBS的培养基，第3天收集培养皿内所有液体采用梯度离心法提取微颗粒。取放疗后的细胞培养基1000g离心10min后取上清，再将上清14000g，离心2min去除碎片后弃沉淀，最后将上清14000g、4℃离心60min，弃上清，沉淀即是微颗粒，将沉淀再用生理盐水洗两遍，1mlPBS(即磷酸缓冲盐)溶液重悬后4℃保存，取100μl液体离心后，加入适量蛋白裂解液，冰上充分裂解30min后，12000g离心30min，取上清加入BCA定量液进行蛋白定量。
2.放疗微颗粒针对肿瘤细胞的杀伤效应
在96孔板中配置100μl的细胞悬液，细胞密度为5×104个/ml。将96孔板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。向培养板中加入不同量的放疗产生的微颗粒(0.04、0.08、0.12、0.16mg/ml)，将培养板在培养箱孵育48小时。向每孔加入10μl CCK8(Cell CountingKit-8)溶液，再将培养板在培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。吸光度值反映细胞的活性强弱。
图4代表采用人肺癌细胞Calu-1、小鼠黑色素瘤细胞B16、人结肠癌细胞HCT116来源的微泡，杀伤同种细胞，证明放疗制备的微颗粒能够用来杀伤同种细胞。
图5为采用小鼠Lewis肺癌细胞系，紫外微颗粒和放疗微颗粒浓度均为0.08mg/mL时，二者对细胞抑制作用的对比(以紫外微颗粒作为参照)。
图6为采用人肺癌细胞系A549分泌的IR-MP去杀伤人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100，人肺癌细胞系H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系HONE1、小鼠黑色素瘤细胞系B16，可见放疗微颗粒杀灭肿瘤细胞具有广谱性。
随着微颗粒量的增加，微颗粒对肿瘤细胞的杀伤逐渐增强，在人肺癌细胞如H292、H1299中，加入0.04mg/ml的微颗粒时细胞杀伤率达到90％，充分证明了微颗粒对肿瘤细胞有较强杀伤能力。
3.放疗微颗粒的ROS检测
重悬微颗粒后按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA(活性氧检测探针)，使终浓度为10微摩尔/升。37℃细胞培养箱内孵育10分钟。用无血清细胞培养液洗涤微颗粒三次，以充分去除未进入微颗粒内的DCFH-DA。使用488nm激发波长，525nm发射波长流式检测微颗粒内的ROS含量。
图7以人肺癌细胞A549细释放的IR-MP为例，我们检测了放疗产生微颗粒中ROS的含量，发现放疗产生的微颗粒中ROS含量明显高于其来源细胞中ROS的含量。微颗粒内的ROS含量为正常细胞内的350倍多，表明微颗粒内含丰富的ROS。
4.放疗微颗粒抗恶性胸腔积液的动物实验
建立恶性胸腔积液模型：以每只鼠3×104个Lewis-LUC小鼠肺癌细胞的接种量接种于C57小鼠胸腔，控制进针深度为3.3mm，注射体积为50μL。于第8天时进行小动物活体成像证明造模成功后，胸腔分别注射50μL的20GY放疗后第3天提取的微颗粒(5mg/kg)和PBS，连续注射7天，观察老鼠的生存时间。
图8：向巨噬细胞的培养基中加入放疗微颗粒，使微颗粒终浓度为0.01mg/mL,24小时后，采用流式细胞术检测巨噬细胞分型。
A.流式检测的各组的代表图，可见放疗微颗粒可显著增加巨噬细胞CD86和MHC-Ⅱ表达，降低CD206表达。表明放疗微颗粒可使巨噬细胞向M1抗肿瘤表型极化。
B.为A图CD86、MHC-Ⅱ、CD206的统计图。其中,**表示统计学P＜0.01，***表示统计学P<0.001,NS表示无统计学差异.
微颗粒组相比于PBS组，生存时间明显延长，具有统计学意义。
图9为用小鼠Lewis肺癌制作小鼠胸水模型，采用Lewis细胞释放的放疗微颗粒进行胸腔灌注治疗，可显著延长小鼠的生存时间。
5.放疗微颗粒抗实体瘤的动物实验
建立C57小鼠皮下移植瘤模型：以每只鼠5×105个B16细胞的接种量种植于C57小鼠皮下，待肿瘤体积达到约50mm3(大约8天)时分别瘤内注射50μL的20GY放疗后第3天提取的微颗粒(5mg/kg)和PBS，连续注射7天，于药物注射后当天开始每间隔一天测量肿瘤大小。
图10为用小鼠B16黑色素瘤细胞制作小鼠皮下移植瘤模型，采用B16细胞释放的放疗微颗粒瘤内注射给药治疗，可显著延抑制小鼠肿瘤生长。如图10所示，微颗粒组相较于PBS组，其肿瘤体积明显缩小，而体重无明显差异，充分证明了放疗产生的微颗粒具有抑制肿瘤生长的功效，且无明显的毒副作用。
图11：用小鼠B16黑色素瘤细胞，制作小鼠黑色素瘤肺转移模型，采用B16细胞释放的放疗微颗粒尾静脉给药，治疗小鼠肺转移，可显著减少小鼠肺转移瘤的形成(图中箭头所示为黑色素瘤肺转移灶)
图12：放疗微颗粒联合PD-1单抗，可解决的PD-1单抗治疗无效的难题。
图13：通过向小鼠胸腔注射放疗微颗粒，我们发现小鼠体重和安慰剂对照组变化一致，可以认为放疗微颗粒未产生明显毒性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
2)将所述步骤1)得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；
3)将所述步骤2)得到的混合物进行离心，即得到所述抗肿瘤微颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述离心包括依次进行第一离心、第二离心、第三次离心，所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟，得上清；第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三次离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为微颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV，所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天。
4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。
5.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。
6.权利要求1～5任意一项所述的一种抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒，其特征在于，所述抗肿瘤微颗粒为携载活性氧ROS的微囊泡结构，所述微囊泡结构的粒径为100-1000nm；所述抗肿瘤微颗粒的携活性氧量不低于细胞内活性氧量。
7.一种抗肿瘤微颗粒药剂，其特征在于，由权利要求1～5中任一项所述的抗肿瘤微颗粒通过纯化和浓缩而获得。
8.权利要求1～5所述的任意一项所述的一种抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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