CN111588730A - FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用及角膜碱烧伤药物 - Google Patents

FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用及角膜碱烧伤药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了FL2‑siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用，所述FL2‑siRNA用于角膜碱烧伤后的角膜损伤疾病的急性期或早期治疗，加速角膜损伤愈合，减少损伤后并发症的出现；FL2‑siRNA制备成注射液用于角膜碱烧伤的结膜下注射，用于促进局部上皮细胞的迁移与损伤愈合。本发明治疗角膜碱烧伤药物，其特征在于：所述治疗角膜碱烧伤药物是一种含有FL2‑siRNA的注射液，包括胆固醇、甲基化修饰的siRNA、RNase free水。本发明为角膜碱性烧伤提供精准的治疗靶点，为眼碱化学烧伤的药物治疗提供理论依据。

Description

FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用及角膜碱烧 伤药物
技术领域
本发明涉及治疗角膜碱性烧伤药物的技术领域，具体说是FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用及角膜碱烧伤药物。
背景技术
视力为人类提供了关于外部世界超过85％的全部信息。眼化学伤，尤其是角膜碱性烧伤，是我国常见难治性致盲眼病,是治疗最棘手的常见病因之一。在治疗和预后方面，它比酸烧伤或机械性角膜损伤更具有破坏性。它可引起广泛的角膜新生血管化、角膜溃疡和角膜疤痕，从而导致角膜穿孔和视力丧失甚至失明，可对生活质量造成持续性的毁灭性影响。除了角膜移植之外，目前还没有有效的治疗方法，但这类患者因为严重的角膜新生血管和角膜移植的术后排斥依然非常具有挑战性的。所以研究眼碱性化学伤愈合的相关分子参与机制，寻找更有效、更经济、更精准的治疗靶点，为眼碱化学烧伤的药物治疗提供理论依据称为研究的重点，也将是一个巨大的治疗性突破。
发明内容
本发明的目的是提供一种FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用及角膜碱烧伤药物，为角膜碱性烧伤提供精准的治疗靶点，为眼碱化学烧伤的药物治疗提供理论依据。
本发明通过以下技术路线来实现：
FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用，其特征在于：所述FL2-siRNA用于角膜碱烧伤后的角膜损伤疾病的急性期或早期治疗，加速角膜损伤愈合，减少损伤后并发症的出现。
FL2-siRNA制备成注射液用于角膜碱烧伤的结膜下注射，用于促进局部上皮细胞的迁移与损伤愈合。
一种治疗角膜碱烧伤药物，其特征在于：所述治疗角膜碱烧伤药物是一种含有FL2-siRNA的注射液，包括胆固醇、甲基化修饰的siRNA、RNase free水。
所述含有FL2-siRNA的注射液中FL2基因的siRNA的碱基序列是：5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'。
所述碱基序列5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'通过下列生产流程得到：
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的FL-2核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护FL-2核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到FL-2核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应；第三步，带帽反应，即缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段通过在纯化时分离掉；第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式的FL-2核苷酸转变为更稳定的磷酸三酯；重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去形成FL-2siRNA。
本发明相比于现有技术，明显具有以下优点：
本发明通过比较评估角膜碱性烧伤后FL2-siRNA与对照组control siRNA的再上皮化率，经过FL2-siRNA处理后角膜上皮愈合方面显著改善。FL2-siRNA可使得FL-2靶向缺失，从而增强了角膜再上皮化。
(1)可以用于角膜碱烧伤后(甚至所有角膜损伤疾病的急性期或早期治疗)，FL2-siRNA促进角膜上皮细胞的迁移，有助于损伤修复；
(2)FL2-siRNA可加速角膜损伤愈合，减少损伤后并发症的出现，如角膜溃疡、瘢痕及角膜新生血管形成；
(3)FL2-siRNA属于基因靶向治疗，治疗精准，无过敏成分，可适用的范围广，可在角膜损伤疾病患者中广泛适用。
附图说明
图1为本发明角膜较对照组一；
图2为本发明角膜较对照组二；
图3为本发明角膜较对照组三。
具体实施方式
本发明FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用，是指FL2-siRNA用于角膜碱烧伤后的角膜损伤疾病的急性期或早期治疗，加速角膜损伤愈合，减少损伤后并发症的出现。具体应用而言是FL2-siRNA制备成注射液用于角膜碱烧伤的结膜下注射，用于促进局部上皮细胞的迁移与损伤愈合。
本发明治疗角膜碱烧伤药物，是一种含有FL2-siRNA的注射液，包括胆固醇、甲基化修饰的siRNA、RNase free水。所述含有FL2-siRNA的注射液中FL2基因的siRNA的碱基序列是：5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'。
Fidgetin是一种微管依赖的切割蛋白，可以通过调控微管的动态变化来促进有丝分裂染色体的分离。Fidgetin是Cox等于2000年从小鼠中克隆的一个AAA蛋白家族新成员，它由定位于小鼠2号染色上的基因Fidgetin编码，该基因的突变会影响小鼠的发育进程，引起内耳半规管的缩小或缺失、导致骨骼畸形发育，具体表型有摇头、转圈、小眼、颅骨融合和畸指等.从蛋白质序列上看，fidgetin的C端含有一个AAA蛋白家族中保守的AAA结构域，其中包括Walker-A、Walker-B和SRH motif等.通过同源序列分析发现fidgetin还有两个直系同源物:fidgetin like-1(FL-1)，fidgetin like-2(FL-2)，且与katanin和spastin同属于AAA家族第七亚家族。既往研究表明，一种新发现的细胞微管切割酶(Fidgetin-like 2,FL2)是细胞迁移和皮肤伤口愈合过程的基本调节因子；在组织培养中，加入FL2纳米颗粒包裹的小干扰RNA(FL2--siRNA)可导致细胞运动速度增加2倍以上。将FL2--siRNA纳米颗粒局部应用于皮肤全层切除和烧伤创面伤口，从临床上和组织学上检查发现其可显著改善表皮的伤口修复愈合和上皮组织的再上皮化；上述研究利用-siRNA和纳米技术，这两种新技术作为新的治疗手段，结果发现对FL2蛋白基因表达的干扰抑制可稳定微管结构(细胞骨架)，从而促进皮肤组织表皮细胞中的细胞能动性，证实FL-2是一个有希望的治疗靶点，以促进皮肤伤口的再生和修复角膜碱性烧伤CorNV动物模型，通过用FL2-siRNA注射液结膜下注射对其作用并观察角膜的临床愈合过程、组织病理变化、和使用Western blot检测FL2-siRNA治疗后FL-2蛋白表达的水平。研究中发现：1.FL2-siRNA可增强角膜上皮再生；2.FL2-siRNA可增强角膜的透明度(同时抑制角膜水肿和疤痕形成)，并且抑制了角膜的新生血管化；3.通过组织病理学研究发现FL 2-siRNA可促进角膜伤口愈合过程。
如前述，本发明含有FL2-siRNA的注射液，其组成主要是胆固醇；甲基化修饰的siRNA，作用是稳定siRNA结构；RNase free水，作用是溶解FL2-siRNA冻干粉，使其溶度变为1nmol/10μl。
甲基化修饰的siRNA就是甲基化FL2-siRNA，溶度0.8-1.5nmol/10μl；最佳值是1nmol/10μl。
FL2--siRNA对皮肤伤口的再生和修复与角膜损伤的治疗均具有可靠的操作性，均针对FL2基因的siRNA，但两者序列不同，本发明所涉及的药物的序列是本发明独有的设计，其碱基序列是：5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'；两者在配方、作用部位及使用方法均不同：用于皮肤伤口的FL2-siRNA为纳米粒包裹，本发明所涉及药物是溶剂用于角膜碱烧伤的结膜下注射，促进局部上皮细胞的迁移与损伤愈合。
本发明碱基序列5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'通过下列生产流程得到：
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的FL-2核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护FL-2核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到FL-2核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式的FL-2核苷酸转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去形成FL-2siRNA。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，page等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，按5nmol分装。
本发明FL2--siRNA对角膜损伤的治疗机理：(1)可以用于角膜碱烧伤后(甚至所有角膜损伤疾病的急性期或早期治疗)，FL2-siRNA促进角膜上皮细胞的迁移，有助于损伤修复；(2)FL2-siRNA可加速角膜损伤愈合，减少损伤后并发症的出现，如角膜溃疡、瘢痕及角膜新生血管形成；(3)FL2-siRNA属于基因靶向治疗，治疗精准，无过敏成分，可适用的范围广，可在角膜损伤疾病患者中广泛适用。本发明用于大鼠碱烧伤的治疗时，结膜下注射FL2-siRNA溶剂1nmol/L，隔日一次。
下面进一步分析说明：
目前抗VEGF药物可以一定程度上抑制角膜碱烧伤后角膜新生血管的形成，但容易反复，而且对角膜碱烧伤急性期上皮修复也有抑制作用，故对角膜损伤愈合有延迟作用。急性期的治疗不利于角膜损伤修复。
比较评估角膜碱性烧伤后FL2-siRNA与对照组control siRNA的再上皮化率。在第3天和第7天，经过FL2-siRNA处理后角膜上皮愈合方面显著改善。FL2-siRNA可使得FL-2靶向缺失，从而增强了角膜再上皮化。图1中A所示对照组control siRNA与本药物组FL2-siRNA在0天和7天时的角膜情况。与对照组相比，FL2-siRNA治疗组在第3天和第7天时，角膜上皮愈合明显改善。
SD大鼠角膜碱性烧伤模型中使用FL2-siRNA处理后14天角膜情况，如图2之B示对照组角膜情况：角膜混浊、水肿，碱烧伤后角膜中央愈合不良,周围角膜广泛新生，角膜后可见出血。
FL2-siRNA处理组角膜较对照组透明，水肿轻，中央角膜愈合明显改善，周围角膜新生血管减少如图2之图C；如图3之D示碱性烧伤SD大鼠经FL2-siRNA处理或对照组siRNA处理后14天时，Western blot检测角膜FL-2蛋白的表达水平。在FL2-siRNA处理组中，FL-2蛋白表达显著降低，其中GAPDH为内参。
在本发明中，Fidgetin是指一种微管依赖的切割蛋白，其C端含有一个AAA蛋白家族中保守的AAA结构域。
fidgetin like-1(FL-1)：细胞微管切割酶-1；fidgetin like-2(FL-2)：细胞微管切割酶-2；FL2-siRNA：细胞微管切割酶-2小干扰RNA；control siRNA：对照组小干扰RNA；siRNA：小干扰RNA；RNase free水：不含核糖核酸酶的蒸馏水；katanin AAA：家族第七亚家族蛋白；spastinAAA：家族第七亚家族蛋白；VEGF：血管内皮生长因子；SD大鼠：Sprague-Dawley大鼠；Western blot：蛋白质印迹；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶。
CPG：表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后；FL-2核苷酸：细胞微管切割酶-2核苷酸；DMT：二甲基色胺；DNA：脱氧核糖核酸；TCA：三羧酸循环；C18，OPC和page是三种常用的DNA纯化方法，C18：一种非极性固体吸附剂；OPC：根据DNA保护基和树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段，此法纯化的DNA纯度大于95％；page：聚丙烯酰胺凝胶电泳；OD260：一种定量方法，根据siRNA在260nm处的紫外吸收来定量。

Claims (5)

1.FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用，其特征在于：所述FL2-siRNA用于角膜碱烧伤后的角膜损伤疾病的急性期或早期治疗，加速角膜损伤愈合，减少损伤后并发症的出现，所述FL2是fidgetin like-2的简称。
2.根据权利要求1所述的FL2-siRNA在制备治疗角膜碱烧伤药物中的应用，其特征在于FL2-siRNA制备成注射液用于角膜碱烧伤的结膜下注射，用于促进局部上皮细胞的迁移与损伤愈合。
3.一种治疗角膜碱烧伤药物，其特征在于：所述治疗角膜碱烧伤药物是一种含有FL2-siRNA的注射液，包括胆固醇、甲基化修饰的siRNA、RNase free水。
4.根据权利要求2所述的治疗角膜碱烧伤药物，其特征在于：所述含有FL2-siRNA的注射液中FL2基因的siRNA的碱基序列是：5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'。
5.根据权利要求4所述的治疗角膜碱烧伤药物，其特征在于：所述碱基序列5'GGTCTTGGATTCTCCCTACGA 3'通过下列生产流程得到：
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的FL-2核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护FL-2核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到FL-2核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应；
第三步，带帽反应，即缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段通过在纯化时分离掉；
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式的FL-2核苷酸转变为更稳定的磷酸三酯；
重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去形成FL-2siRNA。
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