CN111579615A - 一种便携式抗生素生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物和化学领域，涉及一种便携式抗生素生物传感器的制备方法，用于便捷高效的检测抗生素AMP。其设计主要在于检测电极槽中发生的氧化还原反应，制备Glucose@MSN@ssDNA纳米储存器，将电子媒介葡萄糖封装于孔径内部，目标AMP的适体链(ssDNA)封孔。目标AMP与其适体链发生特异性识别，使适体链脱离MSN表面，孔内的葡萄糖被释放并与检测电极上修饰的葡萄糖氧化酶反应，产生电流，使血糖仪示数改变，实现AMP的检测。该传感器检测过程中样品无需分离、组装过程简便、实验成本低、准确性好、选择性高、检测速度快，因此，本发明设计的基于DNA适体的便携式生物传感器，可快速灵敏的检测AMP。
Description
技术领域
本发明属于生物和化学领域，涉及一种便携式抗生素生物传感器的制备方法。
背景技术
血糖仪(PGM)，是一个通过检测人体血液中葡萄糖的浓度来表征血糖健康状况的仪器，它是一种电流型酶传感器，以一次性使用的葡萄糖氧化酶修饰的印刷电极作为传感器，将生化信号转换为可定量测定的电信号，从而实现对血糖浓度的测定。血糖仪检测在医学领域十分重要，具有许多优点：检测速度快、结果准确、检测样品使用量较少(检测一次只需1～5μL)、样品不需要预处理、操作简单、仪器体积小便于携带、实验成本低，因而被广泛应用于医学领域，用来对糖尿病人进行实时监测。
适体一般由几十个核苷酸组成，可以是RNA或单链DNA，也可以是多肽。它具有许多优点，如：(1)识别的靶分子范围广(可以是酶、抗体、毒素等蛋白质类生物大分子以及有机染料、多肽、氨基酸、糖类、金属离子等小分子物质)；(2)亲和力强；(3)特异性强；(4)制备方便、易于合成；(5)稳定性好，可长期保存。这使得适体在生物医学及化学分析等领域应用广泛。
抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌等)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能在低微的浓度下干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。抗生素能够抑制细菌生长繁殖，被用于治疗各种疾病，在农业、畜牧业和养殖业中应用广泛，但滥用抗生素会对人体和动物造成巨大的伤害(例如过敏反应、耳炎、肾毒性疾病等)，抗生素残留问题必须引起高度重视。因此，寻找一种快速、高效、灵敏的方法检测食品中抗生素残留量迫在眉睫。目前主要有：免疫分析法(放射免疫测定法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法等)、微生物学测定法、色谱法等。其中免疫分析法分析技术选择性低，样品检测时可能会出现假阳性结果；微生物学测定法虽然操作简单、价格低廉，但检测的灵敏度低、花费时间长；色谱法准确性好、灵敏度高，但操作程序复杂，价格昂贵，样品预处理过程繁琐，不适用于快速检测分析。因此，设计制备基于DNA适体的便携式生物传感器，发展简单、快速、灵敏、易推广的抗生素残留检测技术对于食品安全检测非常重要。
本发明针对这一问题，构建了基于DNA适体的便携式生物传感器，核心技术便为便携式生物传感器的构建。其中以一次性使用的葡萄糖氧化酶修饰的印刷电极作为传感器，电极加样端直接触及待测样品，通过虹吸作用将一定量的样品吸入到修饰了葡萄糖氧化酶的检测电极槽屮，电极上的葡萄糖氧化酶很快催化被测样品中的葡萄糖发生氧化还原反应，产生电子，在一定电压作用下，形成电流，酶电极响应到电流的变化，将与样品中葡萄糖浓度呈相应线性关系，血糖仪根据这一关系计算并显示血糖值。首先将电子媒介葡萄糖封装在MSN孔中，以目标物AMP的适体链(ssDNA)封孔。当无目标AMP时，由于适体链将葡萄糖封装于MSN孔中，此时被测样品中电子媒介葡萄糖含量相对较少，血糖仪示数小；当目标AMP存在时，目标AMP与适体链(ssDNA)之间存在特异性识别作用，使适体链远离MSN表面，孔内的葡萄糖被释放到体系中，与检测电极上的葡萄糖氧化酶发生氧化还原反应，产生电子，形成电流，使血糖仪示数增大。目标AMP的引入，达到释放葡萄糖的目的，使待测体系中葡萄糖含量增加，电流信号增大，用于定量检测抗生素AMP。本发明设计的基于DNA适体的便携式生物传感器，可简便、快速、灵敏、高效检测目标物AMP。
发明内容
本发明的目的是提供一种便携式抗生素生物传感器的制备方法，实现抗生素AMP的简便、快速、灵敏、高效检测，有助于我国的食品安全检测。
本发明的技术方案如下：
一种便携式抗生素生物传感器的制备方法以及便携式传感血糖仪的构建。
采用检测电极槽中诱发的氧化还原反应，通过电子媒介储存器释放葡萄糖，与电极上修饰的葡萄糖氧化酶发生氧化还原反应，产生电子，在一定电压作用下形成电流。
DNA适体Glucose@MSN@ssDNA的制备方法如图1，它由下列步骤组成：
步骤1.MSN的制备：向CTAB浓度为1.5～3.0mg mL-1的水溶液中，加入500～1000μL2.0M NaOH溶液，在80℃下剧烈搅拌10～20min。随后，加入1～2mL的TEOS到上述溶液中，室温下缓慢搅拌1～3h直至有白色沉淀产生。将得到的产物抽滤，去离子水和甲醇反复洗涤，空气中晾干。接着取一定量沉淀物在盐酸(37％)和甲醇的混合物中回流10h，以除去表面活性剂模板，抽滤得到的MSN用去离子水和甲醇洗涤，60℃干燥。
步骤2.取一定量步骤1中制得的MSN，将其超声分散于0.5～2mL无水乙醇中，随后，加入0.5～1mL APTES，室温下缓慢搅拌4～8h，将上述混合物在2000～8000rpm下离心5～10min，并用无水乙醇清洗多次，去除上清液，得到带正电荷的PMSN。
步骤3.将步骤2中制得的PMSN与一定量浓度的葡萄糖混合，室温下缓慢搅拌一夜。随后，将100nM～1500nM ssDNA加入到上述溶液中，并在室温下缓慢搅拌孵育2～6h。将最终得到的混合物在1000～5000rpm下离心1～5min，反复洗涤，除去未封装在孔内的葡萄糖，去离子水定容，制得Glucose@MSN@ssDNA。
一种基于DNA适体的便携式AMP生物传感器的制备及测量，由下列步骤组成：
步骤1.在不引入目标AMP时，取一定量Glucose@MSN@ssDNA溶液加入到检测电极槽中，测其血糖值CGlu，记为C0 Glu。
步骤2.引入目标AMP，取一定量上述步骤3中的Glucose@MSN@ssDNA与不同浓度的目标AMP 37℃混合，反应1～10min，每隔5min测其血糖值，每次进行3次测量，取其平均值，分别记为C1 Glu、C2 Glu。
基于DNA适体的便携式生物传感器超灵敏检测AMP的原理如图2所示：
当无目标AMP时，葡萄糖被适体链封在MSN的孔内，待测体系内葡萄糖含量较少，氧化还原反应较弱，产生电子较少，血糖仪读数较小；当引入目标AMP后，目标AMP与适体链(ssDNA)之间的特异性识别作用，使得适体链脱离MSN表面，孔内的葡萄糖释放到体系中，随着引入AMP浓度的增加，脱离MSN表面适体链的量增加，释放出来的电子媒介葡萄糖含量增加，从而导致氧化还原反应产生的电流增加，血糖仪读数增大，通过血糖仪示数增加值与目标AMP对应关系得出AMP含量。
有益效果
本发明提供了一种便携式抗生素生物传感器的制备方法，实现简便、快捷、灵敏、高效检测AMP，与现有的AMP检测方法相比，具有以下有益效果：
(1)本发明所述的基于DNA适体的便携式生物传感器中，采用了根据生物电化学原理设计的传感血糖仪，利用其体积较小、操作简单、便于携带的特点，将其应用于抗生素AMP的检测。主要设计如下：
(a)制备Glucose@MSN@ssDNA纳米储存器，将电子媒介葡萄糖封装于介孔硅孔径内部；
(b)利用ssDNA封孔，目标物AMP与其适体链(ssDNA)之间发生特异性识别作用，将孔内的葡萄糖释放到待测体系中(扩散作用)；
(c)使用血糖仪进行测量，采用一次性的葡萄糖氧化酶印刷电极作为传感器，葡萄糖作为电子媒介，将待测样品滴于印刷电极上后，电极上修饰的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖发生氧化还原反应，产生电子，将生化信号转化为可定量测定的电信号。
整个检测过程中，操作流程简单，耗时较少，仪器设备价格低廉、使用方便且对温度和环境适应能力较强。本发明所述的设计具有成本低、易操作、实用性较强的优点，有利于便捷、高效的检测AMP。
(2)本发明所述的Glucose@MSN@ssDNA电子媒介储存器，对葡萄糖储存量大，并且ssDNA封装效果良好，稳定性高，重复性好。
(3)本发明所述的基于DNA适体的便携式生物传感器利用了目标物AMP与适体链(ssDNA)之间的特异性结合，不仅准确度高、选择性好，还提高了检测的灵敏度。
(4)本发明所述基于DNA适体的便携式生物传感器，检测过程中无需样品分离和复杂的清洗程序，样品使用量较少，响应时间短、检测速度快，测量范围宽，测试结果可由仪器直接读数，能够实现现场实时检测，有利于快速灵敏的检测抗生素AMP。
附图说明
图1.Glucose@MSN@ssDNA组装过程示意图
图2.基于DNA适体的便携式生物传感器超灵敏检测AMP的原理示意图
具体实施方式
实施例1：便携式生物传感器用于AMP的检测
(1)介孔硅(MSN)的制备：向2.0mg mL-1的CTAB水溶液中加入875μL 2.0M的NaOH溶液，80℃下剧烈搅拌20min。随后，将1.25mL的TEOS加入到上述溶液中，室温下缓慢搅拌2h。将得到的产物抽滤、洗涤、干燥。取164mg沉淀物在1.5mL盐酸(37％)和75mL甲醇的混合物中回流10h，去除表面活性剂模板，制得的MSN抽滤，洗涤并在60℃下干燥。
(2)APTES修饰MSN的制备：取25mg步骤1中制得的MSN，超声分散于1.0mL无水乙醇中，随后，加入0.8mL APTES，室温下缓慢搅拌6h，5000rpm下离心5min并用无水乙醇清洗3次，去除上清液，得到PMSN。
(3)Glucose@MSN@ssDNA纳米储存器的制备：向步骤2中制得的PMSN中1.0mL 1.0M的葡萄糖溶液，室温下缓慢搅拌一夜。随后，将10μL 100μM的ssDNA加入到上述溶液中，并在室温下缓慢搅拌孵育4h。将最终得到的混合物在1000rpm下离心1min，反复洗涤，去除未被封装在孔内的葡萄糖，去离子水定容，得到Glucose@MSN@ssDNA纳米储存器。
(4)基于DNA适体的AMP便携式传感器的搭建及测量：当无目标AMP时，取50μLGlucose@MSN@ssDNA溶液，测其血糖值CGlu，记为C0 Glu；引入目标AMP后，50μL不同浓度的目标AMP与50μL的Glucose@MSN@ssDNA 37℃恒温水浴孵育10min，随后再次测其血糖值CGlu，每隔5min测量一次，每次测量进行3次，取其平均值，分别记为C1 Glu、C2 Glu。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。
Claims (4)
1.一种便携式抗生素生物传感器的制备方法，其特征是：便携式传感血糖仪的构建。
2.根据权利要求1所述的传感血糖仪。其特征是：采用检测电极槽中诱发的氧化还原反应，通过电子媒介储存器释放葡萄糖，与电极上修饰的葡萄糖氧化酶发生氧化还原反应，产生电子，在一定电压作用下形成电流。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖电子媒介储存器，其特征是：它由下列步骤组成：
步骤1.介孔硅(MSN)的制备：向CTAB浓度为1.5～3.0mg mL-1的水溶液中，加入500～1000μL 2.0M NaOH溶液，在80℃下剧烈搅拌10～20min。随后，加入1～2mL的TEOS到上述溶液中，室温下缓慢搅拌1～3h直至有白色沉淀产生，抽滤、洗涤、干燥、回流，制得MSN。
步骤2.取一定量步骤1中制得的MSN，将其超声分散于0.5～2mL无水乙醇中，随后，加入0.5～1mL APTES，室温下缓慢搅拌4～8h，将上述混合物在2000～8000rpm下离心5～10min，并用无水乙醇清洗多次，去除上清液，得到带正电荷的PMSN。
步骤3.将步骤2中制得的PMSN与一定量浓度的葡萄糖混合，室温下缓慢搅拌一夜。随后，将100nM～1500nM ssDNA加入到上述溶液中，并在室温下缓慢搅拌孵育2～6h。将最终得到的混合物在1000～5000rpm下离心1～5min，反复洗涤，去除未封装在孔内的葡萄糖，去离子水定容，制得Glucose@MSN@ssDNA。
4.根据权利要求1所述的便携式传感血糖仪的构建。其特征是：它由以下操作步骤组成：
步骤1.在不引入目标AMP时，取一定量Glucose@MSN@ssDNA溶液加入到检测电极槽中，测其血糖值CGlu，记为C0 Glu。
步骤2.引入目标AMP，取一定量上述步骤3中的Glucose@MSN@ssDNA溶液与不同浓度的目标AMP 37℃混合，反应1～10min，每隔5min测其血糖值，每次进行3次测量，取其平均值，分别记为C1 Glu、C2 Glu。
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Citations (4)
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| CN104013965A (zh) * | 2014-05-06 | 2014-09-03 | 重庆大学 | 一种兼具细胞特异靶向性、还原响应性及三重抗癌治疗功效的介孔硅纳米药物载体的制备方法 |
| CN105203715A (zh) * | 2015-10-14 | 2015-12-30 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种利用介孔硅可控释放体系与血糖仪检测汞离子的方法 |
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-
2020
- 2020-05-25 CN CN202010447182.2A patent/CN111579615A/zh active Pending
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