CN111575257B - 一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法 - Google Patents

一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，通过全基因合成突变体GOD‑8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD‑M523L‑M524L、GOD‑M524L‑M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；通过基因突变常规葡萄糖氧化酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能，过程中先设计出突变体，之后通过毕赤酵母表达得到相应的纯酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能；解决了葡萄糖氧化酶抗氧化性差，导致其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中生产率低的技术问题；本发明还公开了一种测定装置，通过设置多个检测头和检测仪，能够同时对含量进行测定，防止出现误差，而且同时进行，缩短测定时间，在储液盒中设置缓流机构能够防止流速等因素存在导致测定不准确。

Description

一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法
技术领域
本发明属于分子酶技术领域，具体为一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法。
背景技术
葡糖氧化酶(GlucoseOxidase，GOD)是食品工业中一种重要的工业用酶，广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脱氧、面粉改良、防止食品褐变等方面，在食品快速检测及生物传感器上也有广泛应用。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。
中国发明专利CN105209611B公开了一种具有改进性质的新型微生物葡糖氧化酶变体，更具体地涉及具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。
发明内容
为了克服上述的技术问题，本发明提供一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法。
本发明所要解决的技术问题：
(1)葡萄糖氧化酶抗氧化性差，导致其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中生产率低；
(2)现有的用于蛋白测定的测定装置无法同时进行多组测定，测定效率低，而且容易受到外界环境的影响，影响测定的准确性能。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：
步骤S1、通过全基因合成突变体GOD-8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD-M523L-M524L、GOD-M524L-M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；
步骤S2、合成突变体基因后，通过分子克隆到pPIC9K载体上，重组表达载体转入毕赤酵母GS115菌株中，28℃-30℃培养3-4天，将MD平板上长出来的重组子，同时转接到MD和MM平板上，28℃温箱培养48h，之后制得显色液并将显色液检测、筛选，收集上清液，制得纯酶样品；
步骤S3、对制得的纯酶样品通过测定装置进行蛋白质含量测定，具体步骤如下所示：
配制浓度为1.2U/mL葡萄糖氧化酶标准溶液，之后配置待检测液，将待检测液加入传液箱中，待检测液通过导液管和进液口进入储液盒中，通过缓流管，待检测液缓流进储液盒中，密闭顶盖，调节限位板对测定仪限位固定，测定仪底端安装测定头，调节第一固定板和第二固定板，第一固定板和第二固定板带动驱动泵机以及测定头上下移动，打开驱动泵机，测定头对待检测液进行抽取，测定仪测定，之后通过分析表盘进行读取。
进一步地，步骤S3中待检测液由如下方法配置：将邻联茴香胺、质量分数10％葡萄糖溶液和质量分数10％过氧化氢酶溶液混合，反在37℃保温5min后，加入1.2U/mL葡萄糖氧化酶，在此温度下反应3min后，加入体积分数98％浓硫酸，振荡摇匀直至反应终止，制得待检测液，控制邻联茴香胺、10％葡萄糖溶液、10％过氧化氢酶溶液、1.2U/mL葡萄糖氧化酶和浓硫酸的重量比为10∶1∶0.1∶0.1∶5。
进一步地，步骤S3中测定装置包括外壳机构、测定机构、进液机构和储液机构；
外壳机构包括固定箱、分析表盘、连接杆、滑块、水平滑板、滑轨和固定架，固定架安装在固定箱上表面，分析表盘安装在固定架侧表面中心位置，连接杆一端与分析表盘固定，连接杆另一端与固定架侧表面固定，滑块、水平滑板和滑轨均安装在固定架内部，三根滑轨安装在固定箱上表面，滑轨与固定箱为可拆卸固定，水平滑板安装在滑轨上表面，水平滑板下表面安装滑块，滑块与滑轨配合；
测定机构包括支撑板、竖直支撑杆、驱动泵机、第一固定板、连接管、第二固定板、测定仪、限位板和测定头，四个竖直支撑杆安装在固定箱上表面，竖直支撑杆与固定箱固定，支撑板安装在竖直支撑杆顶端，竖直支撑杆贯穿第一固定板和第二固定板，驱动泵机、连接管、测定仪和测定头从上往下依次安装，四个驱动泵机安装在第一固定板上表面，每个驱动泵机底端与连接管固定，连接管顶端与驱动泵机连接，连接管底端与测定仪连接，测定仪与分析表盘连接，测定仪贯穿第二固定板和限位板，限位板安装在第二固定板上表面，测定仪底端安装测定头；
进液机构包括第一支撑架、第二支撑架、L型固定架、传液箱、竖直滑板、伸缩杆和导液管，第一支撑架、第二支撑架均安装在固定箱上表面，L型固定架和传液箱安装在第一支撑架上表面，传液箱通过L型固定架固定在第一支撑架上方，L型固定架侧表面上方固定传液箱，L型固定架下表面固定在第一支撑架上表面，L型固定架与传液箱和第一支撑架均通过螺栓固定，竖直滑板和伸缩杆安装在第二支撑架上方，伸缩杆顶端贯穿竖直滑板，伸缩杆底端固定在第二支撑架上表面，导液管贯穿第一支撑架上表面与传液箱连通；
储液机构包括储液盒、顶盖、缓流管、连通管、进液口、测定口和隔板，储液盒安装在水平滑板上表面，缓流管、连通管和隔板安装在储液盒内部，进液口通过导管与导液管连通，缓流管一端与进液口连通，缓流管另一端连接连通管，顶盖上设置测定口，测定口与连通管连通，连通管通过隔板卡扣在储液盒内部。
进一步地，测定机构、进液机构和储液机构均安装在外壳机构内部，两个进液机构安装在测定机构两侧表面，两个进液机构安装在外壳机构内部侧表面，储液机构安装在测定机构下方，两个进液机构与储液机构两端连通。
进一步地，支撑板、竖直支撑杆、驱动泵机、第一固定板、连接管、第二固定板、测定仪、限位板和测定头均安装在固定架内部。
进一步地，第一支撑架、第二支撑架、L型固定架、传液箱、竖直滑板、伸缩杆和导液管均安装在固定架内部。
进一步地，该测定装置的测定过程如下所示：
第一步、将支撑板、竖直支撑杆、驱动泵机、第一固定板、连接管、第二固定板、测定仪、限位板和测定头均安装在固定架内部，竖直支撑杆贯穿第一固定板和第二固定板；
第二步、将四个驱动泵机安装在第一固定板上表面，每个驱动泵机底端与连接管固定，连接管顶端与驱动泵机连接，连接管底端与测定仪连接，测定仪与分析表盘连接；
第三步、将待检测液加入传液箱中，通过导液管和进液口进入储液盒中，通过缓流管，待检测液缓流进储液盒中，密闭顶盖，测定仪底端安装测定头，调节第一固定板和第二固定板，第一固定板和第二固定板带动驱动泵机以及测定头上下移动，打开驱动泵机，测定头对待检测液进行抽取，测定仪进行测定，之后通过分析表盘进行读取。
本发明的有益效果：
(1)本发明一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法通过基因突变常规葡萄糖氧化酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能，过程中先设计出突变体，之后通过毕赤酵母表达得到相应的纯酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能；解决了葡萄糖氧化酶抗氧化性差，导致其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中生产率低的技术问题。
(2)本发明还制备出一种用于检测蛋白含量的测定装置，在装置在使用过程中将待检测液加入传液箱中，通过导液管和进液口进入储液盒中，通过缓流管，待检测液缓流进储液盒中，密闭顶盖，调节限位板能够对测定仪进行限位固定，测定仪底端安装测定头，调节第一固定板和第二固定板，第一固定板和第二固定板能够带动驱动泵机以及测定头上下移动，打开驱动泵机，测定头对待检测液进行抽取，测定仪进行测定，之后通过分析表盘进行观察，本装置通过设置多个检测头和检测仪，能够同时对含量进行测定，防止出现误差，而且同时进行，缩短测定时间，在储液盒中设置缓流机构能够防止流速等因素存在导致测定不准确；解决了现有的用于蛋白测定的测定装置无法同时进行多组测定，测定效率低，而且容易受到外界环境的影响，影响测定的准确性能的技术问题。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明测定装置结构示意图；
图2为图1局部结构示意图；
图3为图2主视图；
图4为图1中进液机构结构示意图；
图5为图1中储液机构结构示意图。
图中：1、外壳机构；11、固定箱；12、分析表盘；13、连接杆；14、滑块；15、水平滑板；16、滑轨；17、固定架；2、测定机构；21、支撑板；22、竖直支撑杆；23、驱动泵机；24、第一固定板；25、连接管；26、第二固定板；27、测定仪；28、限位板；29、测定头；3、进液机构；31、第一支撑架；32、第二支撑架；33、L型固定架；34、传液箱；35、竖直滑板；36、伸缩杆；37、导液管；4、储液机构；41、储液盒；42、顶盖；43、缓流管；44、连通管；45、进液口；46、测定口；47、隔板。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：
步骤S1、通过全基因合成突变体GOD-8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD-M523L-M524L、GOD-M524L-M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；
步骤S2、合成突变体基因后，通过分子克隆到pPIC9K载体上，重组表达载体转入毕赤酵母GS115菌株中，30℃培养3天，将MD平板上长出来的重组子，同时转接到MD和MM平板上，28℃温箱培养48h，之后制得显色液并将显色液检测、筛选，收集上清液，制得纯酶样品；
步骤S3、对制得的纯酶样品通过测定装置进行蛋白质含量测定，具体步骤如下所示：
配制浓度为1.2U/mL葡萄糖氧化酶标准溶液，之后配置待检测液，将待检测液加入传液箱34中，待检测液通过导液管37和进液口45进入储液盒41中，通过缓流管43，待检测液缓流进储液盒41中，密闭顶盖42，调节限位板28对测定仪27限位固定，测定仪27底端安装测定头29，调节第一固定板24和第二固定板26，第一固定板24和第二固定板26带动驱动泵机23以及测定头29上下移动，打开驱动泵机23，测定头29对待检测液进行抽取，测定仪27测定，之后通过分析表盘12进行读取。
所述待检测液由如下方法配置：将邻联茴香胺、10％葡萄糖溶液和10％过氧化氢酶溶液混合，反在37℃保温5min后，加入1.2U/mL葡萄糖氧化酶，在此温度下反应3min后，加入98％浓硫酸，振荡摇匀直至反应终止，制得待检测液，控制邻联茴香胺、10％葡萄糖溶液、10％过氧化氢酶溶液、1.2U/mL葡萄糖氧化酶和浓硫酸的重量比为10∶1∶0.1∶0.1∶5。
请参阅图1-5所示，本发明测定装置包括外壳机构1、测定机构2、进液机构3和储液机构4，测定机构2、进液机构3和储液机构4均安装在外壳机构1内部，两个进液机构3安装在测定机构2两侧表面，两个进液机构3安装在外壳机构1内部侧表面，储液机构4安装在测定机构2下方，两个进液机构3与储液机构4两端连通；
如图1-2所示，外壳机构1包括固定箱11、分析表盘12、连接杆13、滑块14、水平滑板15、滑轨16和固定架17，固定架17安装在固定箱11上表面，分析表盘12安装在固定架17侧表面中心位置，连接杆13一端与分析表盘12固定，连接杆13另一端与固定架17侧表面固定，滑块14、水平滑板15和滑轨16均安装在固定架17内部，三根滑轨16安装在固定箱11上表面，滑轨16与固定箱11为可拆卸固定，水平滑板15安装在滑轨16上表面，水平滑板15下表面安装滑块14，滑块14与滑轨16配合，水平滑板15通过滑块14能够沿着滑轨16进行水平移动；
如图1-3所示，测定机构2包括支撑板21、竖直支撑杆22、驱动泵机23、第一固定板24、连接管25、第二固定板26、测定仪27、限位板28和测定头29，支撑板21、竖直支撑杆22、驱动泵机23、第一固定板24、连接管25、第二固定板26、测定仪27、限位板28和测定头29均安装在固定架17内部，四个竖直支撑杆22安装在固定箱11上表面，竖直支撑杆22与固定箱11固定，支撑板21安装在竖直支撑杆22顶端，竖直支撑杆22贯穿第一固定板24和第二固定板26，第一固定板24和第二固定板26能够沿着竖直支撑杆22上下移动，驱动泵机23、连接管25、测定仪27和测定头29从上往下依次安装，四个驱动泵机23安装在第一固定板24上表面，每个驱动泵机23底端与连接管25固定，连接管25顶端与驱动泵机23连接，连接管25底端与测定仪27连接，测定仪27与分析表盘12连接，测定仪27贯穿第二固定板26和限位板28，限位板28安装在第二固定板26上表面，调节限位板28能够对测定仪27进行限位固定，测定仪27底端安装测定头29，调节第一固定板24和第二固定板26，第一固定板24和第二固定板26能够带动驱动泵机23以及测定头29上下移动，打开驱动泵机23，测定头29对待检测液进行抽取，测定仪27进行测定；
如图1和3-4所示，进液机构3包括第一支撑架31、第二支撑架32、L型固定架33、传液箱34、竖直滑板35、伸缩杆36和导液管37，第一支撑架31、第二支撑架32、L型固定架33、传液箱34、竖直滑板35、伸缩杆36和导液管37均安装在固定架17内部，第一支撑架31、第二支撑架32均安装在固定箱11上表面，L型固定架33和传液箱34安装在第一支撑架31上表面，传液箱34通过L型固定架33固定在第一支撑架31上方，L型固定架33侧表面上方固定传液箱34，L型固定架33下表面固定在第一支撑架31上表面，L型固定架33与传液箱34和第一支撑架31均通过螺栓固定，竖直滑板35和伸缩杆36安装在第二支撑架32上方，伸缩杆36顶端贯穿竖直滑板35，伸缩杆36底端固定在第二支撑架32上表面，导液管37贯穿第一支撑架31上表面与传液箱34连通；
如图1、3和5所示，储液机构4包括储液盒41、顶盖42、缓流管43、连通管44、进液口45、测定口46和隔板47，储液盒41安装在水平滑板15上表面，缓流管43、连通管44和隔板47安装在储液盒41内部，进液口45通过导管与导液管37连通，缓流管43一端与进液口45连通，缓流管43另一端连接连通管44，顶盖42上设置测定口46，测定口46与连通管44连通，连通管44通过隔板47卡扣在储液盒41内部。
本发明测定装置工作过程如下所示：
第一步、将支撑板21、竖直支撑杆22、驱动泵机23、第一固定板24、连接管25、第二固定板26、测定仪27、限位板28和测定头29均安装在固定架17内部，竖直支撑杆22贯穿第一固定板24和第二固定板26；
第二步、将四个驱动泵机23安装在第一固定板24上表面，每个驱动泵机23底端与连接管25固定，连接管25顶端与驱动泵机23连接，连接管25底端与测定仪27连接，测定仪27与分析表盘12连接；
第三步、将待检测液加入传液箱34中，通过导液管37和进液口45进入储液盒41中，通过缓流管43，待检测液缓流进储液盒41中，密闭顶盖42，调节限位板28能够对测定仪27进行限位固定，测定仪27底端安装测定头29，调节第一固定板24和第二固定板26，第一固定板24和第二固定板26能够带动驱动泵机23以及测定头29上下移动，打开驱动泵机23，测定头29对待检测液进行抽取，测定仪27进行测定，之后通过分析表盘12进行观察。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种用于抗氧化葡萄糖氧化酶的蛋白质含量测定装置，其特征在于，包括外壳机构（1）、测定机构（2）、进液机构（3）和储液机构（4），测定机构（2）、进液机构（3）和储液机构（4）均安装在外壳机构（1）内部，两个进液机构（3）安装在测定机构（2）两侧表面，两个进液机构（3）安装在外壳机构（1）内部侧表面，储液机构（4）安装在测定机构（2）下方，两个进液机构（3）与储液机构（4）两端连通；
外壳机构（1）包括固定箱（11）、分析表盘（12）、连接杆（13）、滑块（14）、水平滑板（15）、滑轨（16）和固定架（17），固定架（17）安装在固定箱（11）上表面，分析表盘（12）安装在固定架（17）侧表面中心位置，连接杆（13）一端与分析表盘（12）固定，连接杆（13）另一端与固定架（17）侧表面固定，滑块（14）、水平滑板（15）和滑轨（16）均安装在固定架（17）内部，三根滑轨（16）安装在固定箱（11）上表面，滑轨（16）与固定箱（11）为可拆卸固定，水平滑板（15）安装在滑轨（16）上表面，水平滑板（15）下表面安装滑块（14），滑块（14）与滑轨（16）配合；
测定机构（2）包括支撑板（21）、竖直支撑杆（22）、驱动泵机（23）、第一固定板（24）、连接管（25）、第二固定板（26）、测定仪（27）、限位板（28）和测定头（29），四个竖直支撑杆（22）安装在固定箱（11）上表面，竖直支撑杆（22）与固定箱（11）固定，支撑板（21）安装在竖直支撑杆（22）顶端，竖直支撑杆（22）贯穿第一固定板（24）和第二固定板（26），驱动泵机（23）、连接管（25）、测定仪（27）和测定头（29）从上往下依次安装，四个驱动泵机（23）安装在第一固定板（24）上表面，每个驱动泵机（23）底端与连接管（25）固定，连接管（25）顶端与驱动泵机（23）连接，连接管（25）底端与测定仪（27）连接，测定仪（27）与分析表盘（12）连接，测定仪（27）贯穿第二固定板（26）和限位板（28），限位板（28）安装在第二固定板（26）上表面，测定仪（27）底端安装测定头（29）；
进液机构（3）包括第一支撑架（31）、第二支撑架（32）、L型固定架（33）、传液箱（34）、竖直滑板（35）、伸缩杆（36）和导液管（37），第一支撑架（31）、第二支撑架（32）均安装在固定箱（11）上表面，L型固定架（33）和传液箱（34）安装在第一支撑架（31）上表面，传液箱（34）通过L型固定架（33）固定在第一支撑架（31）上方，L型固定架（33）侧表面上方固定传液箱（34），L型固定架（33）下表面固定在第一支撑架（31）上表面，L型固定架（33）与传液箱（34）和第一支撑架（31）均通过螺栓固定，竖直滑板（35）和伸缩杆（36）安装在第二支撑架（32）上方，伸缩杆（36）顶端贯穿竖直滑板（35），伸缩杆（36）底端固定在第二支撑架（32）上表面，导液管（37）贯穿第一支撑架（31）上表面与传液箱（34）连通；
储液机构（4）包括储液盒（41）、顶盖（42）、缓流管（43）、连通管（44）、进液口（45）、测定口（46）和隔板（47），储液盒（41）安装在水平滑板（15）上表面，缓流管（43）、连通管（44）和隔板（47）安装在储液盒（41）内部，进液口（45）通过导管与导液管（37）连通，缓流管（43）一端与进液口（45）连通，缓流管（43）另一端连接连通管（44），顶盖（42）上设置测定口（46），测定口（46）与连通管（44）连通，连通管（44）通过隔板（47）卡扣在储液盒（41）内部；
支撑板（21）、竖直支撑杆（22）、驱动泵机（23）、第一固定板（24）、连接管（25）、第二固定板（26）、测定仪（27）、限位板（28）和测定头（29）均安装在固定架（17）内部；
第一支撑架（31）、第二支撑架（32）、L型固定架（33）、传液箱（34）、竖直滑板（35）、伸缩杆（36）和导液管（37）均安装在固定架（17）内部；
该测定装置的测定过程如下所示：
第一步、将支撑板（21）、竖直支撑杆（22）、驱动泵机（23）、第一固定板（24）、连接管（25）、第二固定板（26）、测定仪（27）、限位板（28）和测定头（29）均安装在固定架（17）内部，竖直支撑杆（22）贯穿第一固定板（24）和第二固定板（26）；
第二步、将四个驱动泵机（23）安装在第一固定板（24）上表面，每个驱动泵机（23）底端与连接管（25）固定，连接管（25）顶端与驱动泵机（23）连接，连接管（25）底端与测定仪（27）连接，测定仪（27）与分析表盘（12）连接；
第三步、将待检测液加入传液箱（34）中，通过导液管（37）和进液口（45）进入储液盒（41）中，通过缓流管（43），待检测液缓流进储液盒（41）中，密闭顶盖（42），测定仪（27）底端安装测定头（29），调节第一固定板（24）和第二固定板（26），第一固定板（24）和第二固定板（26）带动驱动泵机（23）以及测定头（29）上下移动，打开驱动泵机（23），测定头（29）对待检测液进行抽取，测定仪（27）进行测定，之后通过分析表盘（12）进行读取。
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