CN111574740B - 在sebs材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法以及修饰后的sebs材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法以及修饰后的SEBS材料，修饰方法包括以下步骤：(1)基底材料表面预处理：将表面洁净的基底材料SEBS与光引发剂混合，将光引发剂固定到基底材料表面；(2)引发聚合：在紫外光条件下，将8‑15wt％的肽类抗菌聚合物溶液滴在步(1)所得基底材料表面，然后在紫外光下辐照8‑15min，制得。本发明将肽类抗菌聚合物修饰在SEBS材料表面，可对革兰氏阴性与革兰氏阳性菌具有高效杀灭且无明显溶血与细胞毒性的优点。

Description

在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法以及修饰后的 SEBS材料

技术领域

本发明属于SEBS材料技术领域，具体涉及一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法以及修饰后的SEBS材料。

背景技术

Poly(styrene-b-(ethylene-co-butylene)-b-styrene)(SEBS)是以苯乙烯-丁二烯共聚物加氢得到的弹性嵌段的共聚物。得益于弹性体中不饱和双键被氢化，其不仅具有优异的机械性能和加工性能，还具有良好的抗氧化和抗水解性能。因此，SEBS在医用材料中得到了广泛的应用，特别是医用手套、导尿管、药物控释植入体基体材料等。然而由于细菌引起的感染性疾病是导致植入体失败的主要原因之一，所以对SEBS表面进行杀菌处理是十分必要的。但目前并未有很好的杀菌剂及修饰方法用于修饰SEBS材料。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法以及修饰后的SEBS材料，可在保留基底材料的物理性能的同时赋予基底材料杀菌功能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，包括以下步骤：

(1)基底材料表面预处理：将表面洁净的基底材料SEBS与光引发剂混合，将光引发剂固定到基底材料表面；

(2)引发聚合：在紫外光条件下，将8-15wt％的肽类抗菌聚合物溶液滴在步(1)所得基底材料表面，然后在紫外光下辐照8-15min，制得。

进一步地，步骤(1)具体过程为：将表面洁净的基底材料SEBS在0.5-1.5wt％光引发剂溶液中浸泡20-50min，然后在室温条件下进行干燥。

进一步地，步骤(1)中将表面洁净的基底材料SEBS在1.0wt％光引发剂溶液中浸泡30min。

进一步地，步骤(1)中光引发剂为二苯酮或2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(光引发剂2959)。

进一步地，步骤(2)中将10wt％的肽类抗菌聚合物溶液滴在步(1)所得基底材料表面，然后在紫外光下辐照10min。

进一步地，步骤(2)中肽类抗菌聚合物通过以下方法制得：

1)制备二代赖氨酸树状分子；

2)制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体：在二代赖氨酸树状分子上接枝带保护基团的赖氨酸分子，然后在无水环境下与三光气混合，制得α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体；

3)单体的开环聚合：将α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体分子在无水环境下与引发剂混合，进行开环聚合反应，制得聚合物前体；

4)聚合物前体的PEG化与脱保护：将聚合物前体与TCEP混匀，然后加入双丙烯酸酯PEG，室温反应10-15h，然后再进行脱保护，制得。

进一步地，步骤1)中二代赖氨酸树状分子的制备过程具体为：将2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、赖氨酸甲酯二盐酸盐、HOBt和EDC·HCl混合，在冰浴中维持40-80min，然后升温至室温反应45-50h，制得；其中2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、赖氨酸甲酯二盐酸盐、HOBt和EDC·HCl的摩尔比为1:2-4:2-4:2-4，优选1:2.5:2.5:2.5；在冰浴中维持时间优选1h，室温反应时间优选48h；

反应原料2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸为Boc-L-Lys(Boc)-OH或Boc-D-Lys(Boc)-OH，赖氨酸甲酯二盐酸盐为H-L-Lys-OMe·2HCl或H-D-Lys-OMe.2HCl。

进一步地，步骤1)中在冰浴的同时向体系中加入二异丙基乙胺，减少副反应的产生，在提高产率的同时还可以保持氨基酸的手性构型，减少消旋现象的产生。

进一步地，步骤1)中反应结束后还进行洗涤、干燥、纯化步骤，具体为：用饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸、饱和氯化钠溶液进行交替洗涤3-5次，收集有机相用无水硫酸钠进行干燥，最后进行柱层析提纯。

进一步地，步骤2)中α-氨基酸环内酸酐单体的制备过程具体为：

①将二代赖氨酸树状分子、Fmoc-Lys-OH·HCl、HOBt、EDC在溶液中按摩尔比为1:1-2:2-4:2-4进行混合，然后将混合溶液在冰浴中放置40-80min，然后将反应体系温度升至室温并反应45-50h；

②将步骤①所得产物加入有机溶液中，于无水条件下加入三光气，于45-55℃反应10-15h，制得；其中，步骤①所得产物与三光气的摩尔比为4-7:1-3。

进一步地，步骤①中二代赖氨酸树状分子、Fmoc-Lys-OH·HCl、HOBt、EDC的摩尔比为1:1:2:2。

进一步地，步骤①中在冰浴的同时向体系中加入二异丙基乙胺，减少副反应的产生，在提高产率的同时还可以保持氨基酸的手性构型，减少消旋现象的产生。

进一步地，步骤①中冰浴中放置1h，然后将反应体系升至室温后反应48h。

进一步地，步骤①中反应结束后还进行洗涤、干燥、纯化步骤，具体为：用饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸、饱和氯化钠溶液进行交替洗涤3-5次，收集有机相用无水硫酸钠进行干燥，最后进行柱层析提纯。

进一步地，步骤②中步骤①所得产物与三光气的摩尔比为5:2，反应温度为50℃，反应时间为12h。

进一步地，步骤3)中具体过程为：室温下，α-氨基酸环内酸酐与引发剂以摩尔比为1:0.01-0.02反应45-50h，制得。

进一步地，α-氨基酸环内酸酐与引发剂的摩尔比为60:1，反应时间为48h。

进一步地，引发剂为含氨基和二硫键的引发剂，优选胱胺。

进一步地，步骤4)中聚合物前体、TCEP和双丙烯酸酯PEG的摩尔比为1:20-30:8-12，优选摩尔比为1:25:10。

进一步地，步骤4)中向PEG化的产物中加入三氟乙酸进行脱保护，脱保护温度为室温，时间为5-8h，优选6h。

本发明提供的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法以及修饰后的SEBS材料，具有以下有益效果：

本发明通过将基底材料SEBS浸入引发剂溶液中，并通过物理过程如浸泡一定时间后，干燥使得溶剂挥发，使引发剂分子能够均匀分布于基底材料SEBS表面，然后通过紫外光引发自由基聚合物反应，将含有碳碳双键的肽类抗菌聚合物固定于基底材料SEBS表面，在保留基底材料的物理性能的同时赋予基底材料杀菌功能。

本发明在制备肽类抗菌聚合物时先制备了二代赖氨酸树状分子，由于二代赖氨酸树状分子无法直接通过三光气得到相应的NCA分子，因此，需在二代赖氨酸树状分子上先接枝一个赖氨酸分子，接枝的赖氨酸分子可以是制备二代赖氨酸树状分子时所用的氨基酸，但应选用带不同保护基团的赖氨酸反应物，氨基酸分子中的氨基与羧基进行缩合反应，氨基酸分子中的保护基如甲酯保护基团在碱性环境下进行水解反应，然后再与三光气发生取代反应，形成α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体，然后采用引发剂尤其是含氨基的引发剂引发α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体发生开环聚合反应，所得聚合物前体再发生还原反应以及巯基-烯点击反应，随后脱去氨基酸的保护基，最终制得以树状分子为侧链的手性肽类抗菌聚合物。

本发明制备方法避免了传统的固相多肽合成方法，具有生产成本低的优点，并且制得的肽类聚合物分子具有独特的结构，其具有α-螺旋的主链结构和树状分子为侧链的复合放射螺旋结构，赋予其高效广谱杀菌效果及细胞毒性和溶血性低的优点。

将肽类抗菌聚合物修饰在SEBS材料表面，可对革兰氏阴性与革兰氏阳性菌具有高效杀灭且无明显溶血与细胞毒性的优点。

附图说明

图1为实施例1制备的左旋分子的H-NMR表征结果图。

图2为实施例1制备的左旋分子的MALDI-TOF MS表征结果图。

图3为实施例1制备的右旋分子的H-NMR表征结构图。

图4为实施例1制备的右旋分子的MALDI-TOF MS表征结果图。

图5为实施例1制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体时步骤1中采用左旋分子作为原料时的H-NMR表征结构图。

图6为实施例1制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体时步骤1中采用左旋分子作为原料时的MALDI-TOF MS表征结果图。

图7为实施例1制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体时步骤1中采用右旋分子作为原料时的H-NMR表征结构图。

图8为实施例1制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体时步骤1中采用右旋分子作为原料时的MALDI-TOF MS表征结果图。

图9为实施例1制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体时步骤2中采用左旋分子作为原料时的H-NMR表征结构图。

图10为实施例1制备α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体时步骤2中采用右旋分子作为原料时的H-NMR表征结构图。

图11为实施例1引发剂的H-NMR表征结果图。

图12为实施例1以左旋分子为原料时制得的聚合物前体的H-NMR表征结果图。

图13为实施例1以左旋分子为原料时制得的聚合物前体的GPC表征结果图。

图14为实施例1以右旋分子为原料时制得的聚合物前体的H-NMR表征结果图。

图15为实施例1以右旋分子为原料时制得的聚合物前体的GPC表征结果图。

图16为实施例1以左旋分子为原料制得的最终产物的H-NMR表征结果图。

图17为实施例1以左旋分子为原料制得的最终产物的GPC表征结果图。

图18为实施例1以右旋分子为原料制得的最终产物的H-NMR表征结果图。

图19为实施例1以右旋分子为原料制得的最终产物的GPC表征结果图。

图20为左旋分子为原料时制得的肽类抗菌聚合物的二级结构表征图。

图21为分子动力学模拟本发明肽类抗菌聚合物与细菌膜相互作用0至100ns的模拟结果。

图22为修饰后的SEBS材料的水接触角测试结果图。

图23为修饰后的SEBS材料的SEM表面形貌观察结果图。

图24为修饰后的SEBS材料的XPS表面元素成分及化学态分析结果图。

图25为修饰后的SEBS材料的ATR-FTIR表面化学基团分析结果图。

图26为修饰后的SEBS材料的抑菌率结果图。

图27为修饰后的SEBS材料的细菌活死染色结果图。

图28为修饰后的SEBS材料的细菌SEM观察结果图。

图29为修饰后的SEBS材料的细胞相容性评价结果图。

图30为修饰后的SEBS材料的血液相容性评价结果图。

具体实施方式

实施例1

一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，包括以下步骤：

(1)基底材料表面预处理

将基底材料SEBS切割成所需形状(本实施例中切割为直径为12mm，厚度为1mm的圆片状)，并用去离子水和无水乙醇交替超声清洗各3次，每次15min，随后在氮气氛围下干燥，待用；

将表面洁净的基底材料SEBS在含1wt％二苯酮的乙醇溶液中浸泡30min，并在室温下干燥。

(2)引发聚合

将含10wt％的肽类抗菌聚合物(也称手性肽类抗菌聚合物)的DMSO滴在预处理后的基底材料表面，并以紫外反应器(高压汞灯，400W，中心波长365nm)对其进行紫外辐照10min。

(3)后处理

将引发聚合后的基底材料在DMSO与无水乙醇中交替洗涤3次，以除去未反应的抗菌聚合物，并在真空条件下干燥，制得。

实施例2

一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，包括以下步骤：

(1)基底材料表面预处理

将基底材料SEBS切割成所需形状(本实施例中切割为直径为12mm，厚度为1mm的圆片状)，并用去离子水和无水乙醇交替超声清洗各3次，每次15min，随后在氮气氛围下干燥，待用；

将表面洁净的基底材料SEBS在含0.5wt％二苯酮的乙醇溶液中浸泡50min，并在室温下干燥。

(2)引发聚合

将含8wt％的肽类抗菌聚合物(也称手性肽类抗菌聚合物)的DMSO滴在预处理后的基底材料表面，并以紫外反应器(高压汞灯，400W，中心波长365nm)对其进行紫外辐照15min。

(3)后处理

将引发聚合后的基底材料在DMSO与无水乙醇中交替洗涤3次，以除去未反应的抗菌聚合物，并在真空条件下干燥，制得。

实施例3

一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，包括以下步骤：

(1)基底材料表面预处理

将基底材料SEBS切割成所需形状(本实施例中切割为直径为12mm，厚度为1mm的圆片状)，并用去离子水和无水乙醇交替超声清洗各3次，每次15min，随后在氮气氛围下干燥，待用；

将表面洁净的基底材料SEBS在含1.5wt％二苯酮的乙醇溶液中浸泡20min，并在室温下干燥。

(2)引发聚合

将含15wt％的肽类抗菌聚合物(也称手性肽类抗菌聚合物)的DMSO滴在预处理后的基底材料表面，并以紫外反应器(高压汞灯，400W，中心波长365nm)对其进行紫外辐照8min。

(3)后处理

将引发聚合后的基底材料在DMSO与无水乙醇中交替洗涤3次，以除去未反应的抗菌聚合物，并在真空条件下干燥，制得。

上述实施例1-3中肽类抗菌聚合物均通过以下方法制备得到：

一、二代赖氨酸树状分子的制备

1、左旋分子的制备

将Boc-L-Lys(Boc)-OH((S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸，5mmol)，H-L-Lys-OMe·2HCl(L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，12.5mmol)，HOBt(1-羟基苯并三氮唑，12.5mmol)，EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，12.5mmol)加入到30mL无水二氯甲烷中，并将混合溶液至于冰浴中维持0℃1个小时。在冰浴的同时将DIPEA(二异丙基乙胺，8mL)滴加入反应体系。随后将反应体系升至室温并反应48小时。待反应结束，向反应体系中加入70mL氯仿，并按体积比1:1分别与饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸、饱和氯化钠溶液交替洗涤3次。将有机相收集并以无水硫酸钠干燥8小时。将干燥后的溶液进行旋转蒸发富集，并以二氯甲烷：甲醇体积比1:30的混合物为流动相将粗产物进行柱层析提纯。将上述产物置于1M浓度的氢氧化钠甲醇溶液中，室温下反应12小时。带反应结束向混合物中加入三倍体积的氯仿，逐滴加入1M浓度的稀盐酸直至溶液pH为2-3。收集有相并以无水硫酸钠干燥8小时，过滤后将滤液富集，得到白色产物。

上述反应中DIPEA是一种有机碱，其主要作用是减少副反应的产生，在提高产率的同时可以保持氨基酸的手性构型，减少消旋现象的产生。

反应式如下：

所得产物的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.39–1.86(m,CH₂-Lys andCH₃-Boc),3.12(s,CH₂NH-Lys),3.39(s,NCH₂CH₂NHCO),4.07–4.77(m,COCH(R)NH),6.96–6.63(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

MALDI-TOF MS表征结果数据为：m/z＝825.4([M+Na]⁺)。

所得产物H-NMR、MALDI-TOF MS表征结果分别见图1和图2。

2、右旋分子的制备

氨基酸反应原料使用右旋氨基酸(Boc-D-Lys(Boc)-OH与H-D-Lys-OMe.2HCl)，其余反应物与反应操作同左旋分子制备完全相同。

所得产物的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.36–1.85(m,CH₂-Lys andCH₃-Boc),3.03(s,CH₂NH-Lys),3.47(s,NCH₂CH₂NHCO),4.04–4.67(m,COCH(R)NH),6.90–7.34(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

MALDI-TOF MS表征结果数据为：m/z＝825.6([M]⁺)。

所得产物H-NMR、MALDI-TOF MS表征结果分别见图3和图4。

二、α-氨基酸环内酸酐(NCA)单体的制备

1、将上步骤制得的产物(5mmol)，Fmoc-L-Lys-OH·HCl(N-芴甲氧羰基-L-赖氨酸盐酸盐，5mmol)，HOBt(10mmol)，EDC(10mmol)加入到30mL无水二氯甲烷中，并将混合溶液至于冰浴中维持0℃1个小时。在冰浴的同时将DIPEA(3.2mL)滴加入反应体系。随后将反应体系升至室温并反应48小时。待反应结束，向反应体系中加入70mL氯仿，并按体积比1:1分别与饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸、饱和氯化钠溶液交替洗涤3次。将有机相收集并以无水硫酸钠干燥8小时。将干燥后的溶液进行旋转蒸发富集，并以二氯甲烷：甲醇体积比1:20的混合物为流动相将粗产物进行柱层析提纯。将上述产物置于1M浓度的氢氧化钠甲醇溶液中，室温下反应12小时。待反应结束向混合物中加入三倍体积的氯仿，逐滴加入1M浓度的稀盐酸直至溶液pH为2-3。收集有机相并以无水硫酸钠干燥8小时，过滤后将滤液富集，得到白色产物。

反应式如下：

采用左旋分子作为原料制得的反应产物的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.43–1.79(m,CH₂-Lys and CH₃-Boc),3.10–3.26(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),4.08–4.78(m,COCH(R)NH),6.64–7.58(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

MALDI-TOF MS表征结果数据为：m/z＝931.6([M]⁺)。

所得产物H-NMR、MALDI-TOF MS表征结果分别见图5和图6。

采用右旋分子作为原料进行制备，制备过程与上述相同，制得的反应产物的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.43–1.79(m,CH₂-Lys and CH₃-Boc),3.09–3.43(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),4.13–4.89(m,COCH(R)NH),6.48–7.60(m,CH₂NH-Lys andNCH₂CH₂NHCO)。

MALDI-TOF MS表征结果数据为：m/z＝931.5([M]⁺)。

所得产物H-NMR、MALDI-TOF MS表征结果分别见图7和图8。

2、将上述产物(5mmol)加入50mL无水四氢呋喃中，并在无水条件下加入4mL三光气的四氢呋喃溶液(0.5M浓度)，反应体系在50℃反应12小时。待反应结束，将溶剂以旋转蒸发去除，并将粗产物在无水乙醚中沉淀并以无水乙醚洗涤三次。

反应式如下：

采用左旋产物作为原料时，H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.37–1.77(m,CH₂-Lys),2.67–3.00(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),3.82–4.14(m,COCH(R)NH),6.99–7.75(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

H-NMR表征结果见图9。

采用右旋产物作为原料时，H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.40–1.70(m,CH₂-Lys),2.78–3.03(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),3.80–4.18(m,COCH(R)NH),7.05–7.90(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

H-NMR表征结果见图10。

三、单体的开环聚合

1、引发剂的前处理

将胱胺二盐酸盐(9mmol)在冰浴条件下加入至2.5M浓度的70mL氢氧化钠溶液中，随后向反应体系内加入50mL氯仿，并在室温下反应4小时。待反应结束，将有机相收集，以旋转蒸发去除溶剂并小心维持温度不超过25摄氏度。将上述得到的引发剂溶于无水DMF中，制备成0.1M浓度的引发剂溶液待用。

反应式如下：

H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝1.98(br s,NH₂CH₂CH₂S),2.71(t,NH₂CH₂CH₂S),2.79(t,NH₂CH₂CH₂S)。

H-NMR表征结果图见图11。

2、将NCA单体(3mmol)溶于30mL无水DMF中，并加入0.5mL引发剂溶液，室温下反应48小时。待反应结束，以无水乙醚沉淀出白色产物，并以无水乙醚将产物洗涤三次得到聚合物前体。

反应式如下：

以左旋分子为原料时，所得聚合物前体的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.44–1.68(m,CH₂-Lys),2.79–3.54(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),4.13–4.79(m,COCH(R)NH),7.05–7.66(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

GPC表征结果数据为：GPC in DMF/LiBr:M_w＝4.61×10⁴g/mol,M_w/M_n＝2.88,degree of polymerization≈50。

H-NMR、GPC表征结果见图12和13。

以右旋分子为原料时，所得聚合物前体的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.43–1.70(m,CH₂-Lys),2.83–3.44(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),4.21–4.77(m,COCH(R)NH),7.08–7.63(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

GPC表征结果数据为：GPC in DMF/LiBr:M_w＝4.72×10⁴g/mol,M_w/M_n＝2.48,degree of polymerization≈52。H-NMR、GPC表征结果见图14和15。

四、聚合物前体的PEG化与脱保护

将得到的聚合物前体(0.6mmol)与750mL 20mM浓度的TCEP DMSO溶液(含三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的二甲基亚砜溶液)混合，并在室温下搅拌一个小时，随后将双丙烯酸酯PEG(AC-PEG-AC)(6mmol)加入，室温下反应12小时。待反应结束后以截断分子量MWCO＝3500的透析袋在去离子水中透析72小时，并每8小时换液，最终冻干收集产物。将上述产物(1mmol)与TFA(三氟乙酸)：DMSO＝1:1的混合物(50mL)混合，室温下反应6小时。待反应结束后以截断分子量MWCO＝3500的透析袋在去离子水中透析72小时，并每8小时换液，最终冻干收集产物。

在聚合物前体的PEG化过程中，首先是TCEP作为还原剂发生二硫键的还原反应，然后滴加双丙酸酯PEG(AC-PEG-AC)进行反应是发生巯基-烯点击反应，该过程是以残留的TCEP作为催化剂发生的巯基-烯点击反应，随后脱去氨基酸的保护基，具体为氨基酸的N-Boc保护基团在酸性环境下进行脱除反应。

反应式如下：

以左旋分子为原料时，制得的最终产物的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O):δ＝3.71(s,OCH₂CH₂O),3.84(t,COOCH₂CH₂),4.37(t,COOCH₂CH₂),6.03(d,CH₂CHCO),6.24(dd,CH₂CHCO),6.45(d,CH₂CHCO)。

GPC表征结果数据为：GPC in DMF/LiBr:M_w＝2.02×10⁴g/mol,M_w/M_n＝1.21,degree of polymerization≈30。H-NMR、GPC表征结果见图16和17。

以右旋分子为原料时，制得的最终产物的H-NMR数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝1.38–1.69(m,CH₂-Lys),2.76–3.06(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO),3.55(s,OCH₂CH₂O),3.63–4.21(m,COCH(R)NH),7.71–8.70(m,CH₂NH-Lys and NCH₂CH₂NHCO)。

GPC表征结果数据为：GPC in DMF/LiBr:M_w＝2.13×10⁴g/mol,M_w/M_n＝1.23,degree of polymerization≈31。

H-NMR、GPC表征结果见图18和19。

以左旋分子为原料时，制得的肽类抗菌聚合物的二级结构表征图(圆二色谱)见图20。

由图20可知，肽类抗菌聚合物在波长为207nm及225nm处存在两个数值为负的吸收峰，这是典型的α螺旋肽段的圆二色谱特征。所以可以得出该抗菌聚合物主链存在α螺旋的二级结构，而树状分子作为侧链向外侧伸展。这种放射螺旋状的三维结构可以有利于抗菌聚合物与细菌膜的结合，并且位于外侧伸展的阳离子树状分子对内侧α螺旋主链具有一定的屏蔽作用，这种屏蔽作用可以减少相对疏水的主链对哺乳动物细胞的毒性。因此，本发明制得的肽类抗菌聚合物在结构上具有较强的抗菌、细胞毒性和溶血性低的潜力。

实验例1分子动力学模拟本发明肽类抗菌聚合物与细菌膜的相互作用

分子动力学使用GROMACS version 2019.3软件包，采用GROMOS 53A7力场，水分子采用SPC模型，细菌膜模型使用POPG：POPE＝1:3的双层磷脂膜，聚合物分子使用AutomatedTopology Builder(ATB)服务器建模。初始阶段将聚合物分子置于磷脂双分子层上方4.5nm处，体系平衡阶段使用最速下降法和共轭梯度法对其进行能量优化，随后进行恒温系综(NVT)及恒压系综(NPT)平衡，温度耦合使用v-rescale方法，温度逐渐上升至310K。最终对抗菌聚合物与双层磷脂膜进行100ns的模拟，采用蛙跳算法，积分步长为2fs，长程静电相互作用使用PME算法，短程邻居列表截断半径、短程库伦截断半径、短程范德华截断半径均设为1.2nm，体系分子键长使用LINCS算法约束。

0至100ns的模拟结果见图21。由图21可知，聚合物分子(紫色)在模拟开始后10nm内快速接近至磷脂膜表面(黄绿色)，并且部分赖氨酸树状分子侧链接触到膜表面。随着时间的推移，更多的树状分子侧链插入到磷脂膜的表面。最终100ns时，整个聚合物分子铺展到磷脂膜表面，并且有部分的树状分子侧链插入到磷脂膜中。结果表明这种树状分子为侧链的肽类聚合物与细菌膜具有很强的相互作用，能够在极短的时间内与插入到细菌膜表面，为其能够通过与细菌膜相互作用进而破坏细菌膜、杀灭细菌提供了有力的证明，是一种具有高效杀菌潜力的聚合物材料。

实验例2修饰后的SEBS材料表面性能评价

以实施例1制得的修饰后的SEBS材料为例，对其表面进行水接触角测试，并以SEM观察其表面形貌，以XPS、ATR-FTIR分析其表面元素及化学基团。

1、水接触角测试

测试过程：将待测样品置于样品台上并调整样品台高度与图像采集器焦距，使样品在取景框中心清晰可见。每次以微量进样针将3μL去离子水滴至样品表面并拍照记录，以设备配套的图像处理软件计算水接触角。每个待测样以十字取点测量5个位置的水接触角并将求得的平均值作为该试样的水接触角。

水接触角测试结果见图22，图22中A组表示SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组表示SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组表示未处理SEBS。

由图22可知，对于未修饰的SEBS材料表面(C组)，其表面具有较强的疏水性，水接触角达到98.9°。而经过左旋与右旋抗菌聚合物修饰的A、B两组，其水接触角具有较大程度的降低，降低至20.7°(A)与22.5°(B)。这是由于抗菌聚合物中的PEG链段及大量带正电的氨基基团，SEBS表面经抗菌聚合物修饰后由疏水性表面变为亲水性表面，且修饰左旋与右旋聚合物的SEBS材料表面水接触角差别不大。

2、SEM表面形貌观察

SEM表面形貌观察结果见图23，图23中A组表示SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组表示SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组表示未处理SEBS，且上排为材料表面正视图，下排为材料表面剖视图。

由图23可知，修饰前的SEBS材料表面较为光滑，而经左旋与右旋抗菌聚合物修饰后(分别为A、B两组)，其表面可观察到一层聚合物刷层，且在剖视图中可观察到聚合物层厚度约为10μm左右。左旋与右旋抗菌聚合物修饰的SEBS材料表面形貌没有明显差别。

3、XPS表面元素成分及化学态分析

XPS表面元素成分及化学态分析结果见图24，图24中(a)、(b)、(c)分别为SEBS、SEBS接枝左旋抗菌聚合物、SEBS接枝右旋抗菌聚合物材料组表面C1s能谱图，(d)为N1s能谱图，且(d)图中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS。

首先从(a)中可以观察到修饰前SEBS表面主要为C-C键(248.5eV)，这是由于SEBS弹性体为苯乙烯与丁二烯共聚加氢产物，结构组成上主要为C-C键。而(b)、(c)中可以观察到经抗菌聚合物修饰后的SEBS材料表面除了较强的C-C峰(248.5eV)，增加了C-N/C-O(286.1eV)与O＝C-NH(288.8eV)两组新的亚峰。这是由于修饰的抗菌聚合物中PEG链段带来醚键(C-O)与赖氨酸中较多的氨基(C-N)、酰胺基团(O＝C-NH)。并且从(d)图N1s能谱中可以看出未经修饰的SEBS表面几乎没有N元素被检测到，而抗菌聚合物修饰后的材料表面新增了N元素的两个亚峰，分别为N-H(399.6eV)与N⁺(401.5eV)两种N元素化学态，这是由于抗菌聚合物中赖氨酸链段的氨基带来的，并且左旋与右旋聚合物修饰的材料表面化学元素与化学态没有明显差别。

4、ATR-FTIR表面化学基团分析

ATR-FTIR表面化学基团分析结果见图25，图中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS。

从图25中可以看出，经抗菌聚合物修饰后SEBS材料表面新增了-OH、-NH₂、C＝O、C-N基团震动峰。这些新增的振动峰均可以从抗菌聚合物的化学组成中得到印证，并且左旋与右旋抗菌聚合物修饰的SEBS材料表面化学基团组成没有明显差别。

从上述表征可知，左旋与右旋抗菌聚合物均成功修饰到SEBS材料表面，而且左旋与右旋抗菌聚合物修饰后材料表面水接触角、形貌、化学元素种类与化学价态均没有明显差别。

实验例3抑菌效果评价(抑菌率检测)

以实施例1制得的修饰后的SEBS材料为例，对其进行抑菌率检测，具体过程如下：

(1)取保存的大肠杆菌(E.coli)及金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌种，接种环挑取一环，于MHA平板上划线复苏。将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养过夜。次日，取平板，挑取单克隆接种至MHB液体培养基中，放入恒温摇床，37℃，200rpm培养过夜。

(2)培养12小时后，取1mL上述细菌悬液至离心管中，1000g离心10分钟，并以PBS洗涤三次，将PBS中细菌震荡至悬液状态，在600nm处测定菌液吸光度，用PBS调整菌液浓度至10⁸CFU/mL。

(3)取10μL上述悬液(约10⁶个细菌)，置于修饰后的SEBS材料表面。

(4)37℃孵育4小时后，将修饰后的SEBS材料浸入1mL PBS中，剧烈震荡10分钟。将上述孵育后的细菌悬液以10倍浓度梯度稀释至最大10^-4倍，各浓度取5μL分别点种至MHB琼脂平板上，待菌液吸收后，将平板倒置放入37℃恒温培养箱中，培养24小时。

(5)计数菌落数。若只有一个稀释度在可计数范围，则以该梯度计算菌落数，若有二个稀释度均在可计数范围，则以二者比值(高稀释倍数/低稀释倍数)决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字的稀释倍数计算菌落数。

(6)计算抑菌率。以未处理的SEBS材料作为对照组，以接枝了左旋或右旋抗菌聚合物的SEBS表面作为实验组，抑菌率按照以下公式进行计算：

抑菌率结果见图26，图26中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS。

从图26中A组数据可以看出SEBS表面修饰左旋聚合物的材料组表面E.coli细菌菌落量较未处理SEBS表面从1.2×10⁵CFU/mL降低至0.77CFU/mL，而抑菌率达到了99.99％。SEBS表面修饰右旋聚合物的材料组表面S.aureus细菌菌落量较未处理SEBS表面从6×10⁵CFU/mL降低至1.9×10⁴CFU/mL，抑菌率达到了96.82％。对于B组SEBS表面修饰右旋抗菌聚合物的材料，E.coli细菌菌落量从1.2×10⁵CFU/mL降低至1.6CFU/mL，抑菌率为99.99％，S.aureus细菌菌落量从6×10⁵CFU/mL降低至3.3×10⁴CFU/mL，抑菌率达到了94.45％。综上，修饰上抗菌聚合物的SEBS材料组对革兰氏阳性与革兰氏阴性菌均有良好的抗菌效果，但修饰的左旋与右旋抗菌聚合物组之间的抑菌效果差别不大。

实验例4抑菌效果评价(细菌活死染色及扫描电镜SEM检测)

以实施例1制得的修饰后的SEBS材料为例，对其进行细菌活死染色及扫描电镜SEM检测，具体过程如下：

(1)取菌悬液，在600nm处测定菌液吸光度，用新鲜的MHB培养基调整菌液浓度至10⁸CFU/mL。

(2)将菌液加入黏有材料的24孔培养板中，2mL每孔，在37℃下孵育72小时，保持培养基每24小时换液。

(3)培养结束后，轻轻吸弃培养上清，向培养板孔中小心加入生理盐水，轻轻洗去材料表面浮游的细菌，重复3次。

(4)取

9,propidium iodide各18μL加入至6mL无菌水中，充分混匀后，以200μL每孔的体积轻轻滴加到材料上，避光条件下室温孵育30分钟。

(5)孵育结束后，以生理盐水轻轻洗涤材料表面3次，使用共聚焦显微镜观察。

(6)将观察后的材料在4℃条件下分别以体积分数30％、50％、70％、90％、100％的乙醇溶液浸泡15分钟，进行逐级脱水。脱水完毕后在室温条件干燥样品，使用SEM形貌观察。

细菌活死染色结果见图27，图27中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS，并且活细菌被染为绿色，死细菌被染为绿色，右下角标尺大小为20μm。

从图27中可以看出，无论是E.coli或者S.aureus细菌，未处理的SEBS材料组(C组)表面具有大量绿色的活细菌，而接枝左旋(A组)与右旋(B组)抗菌聚合物的材料组表面绿色活细菌的数量均大量减少，并且有较多的红色死细菌可以被观察到。

细菌SEM观察结果见图28，图28中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS，并且箭头所指为细菌破裂处。

从图28中可以看出在抗菌聚合物修饰的SEBS表面(A与B组)，细菌形态发生了变化，细菌表面产生了褶皱与凹陷，其完整性遭到了破坏。证明此左旋与右旋抗菌聚合物都是是通过与细菌膜相互作用，对细菌膜产生破坏作用，最终导致细菌死亡。

实验例5细胞相容性评价

以实施例1制得的修饰后的SEBS材料为例，对其进行细胞相容性评价，具体过程如下：

(1)将预先灭菌的实验组材料的聚合物修饰面向下置入48孔培养板中，并在每个培养孔中加入2mL培养基浸泡24小时。

(2)将孔板中的培养基吸出，加入新鲜培养基(含有10％血清与1％青霉素/链霉素)2mL每孔，并向每孔中加入约1×10⁵个L929细胞，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。

(3)将培养孔中的培养基吸出，并小心地以PBS润洗两次。随后向培养孔中加入10％CCK-8的无血清培养基溶液，在避光条件下37℃孵育1小时。

(4)将孵育结束后的培养基吸入96孔培养板中，检测其在450nm处的吸光度，并以TCPS培养板为对照计算细胞活性。

细胞活性结果见图29，图29中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS，D组代表TCPS对照(设为100％)。

从图29中可以看出，经抗菌聚合物修饰后的材料组(A、B)与未修饰的SEBS相比，其细胞活性从83.5％略微地升高到85.3％(A)与86.2％(B)，并且与TCPS对照组相比没有明显的统计学差异(p>0.05)。以上结果说明表面修饰的左旋与右旋抗菌聚合物并没有降低SEBS材料的细胞相容性，反而略有增加，并且修饰左旋与右旋抗菌聚合物的SEBS材料的细胞相容性没有明显差异。

实验例6血液相容性(溶血率)评价

以实施例1制得的修饰后的SEBS材料为例，对其进行细胞相容性评价，具体过程如下：

(1)将新鲜的兔血在1000g、4℃条件下离心15分钟，取离心后的下层血细胞以质量百分比2％分散于生理盐水中待用。

(2)将血细胞按质量百分比2％分散于去离子水与生理盐水中，并分别设为阳性对照与阴性对照组。

(3)将材料浸没在血细胞悬液中，并在37℃下孵育1小时，设为实验组。

(4)孵育完成后，分别将各实验组与阴性、阳性对照组的细胞悬液在1000g、4℃条件下离心5分钟。

(5)取离心后的上清液，检测其在540nm处的吸光度。

溶血率按以下公式计算：

溶血率结果见图30，图30中A组代表SEBS表面接枝左旋抗菌聚合物，B组代表SEBS表面接枝右旋抗菌聚合物，C组代表未处理SEBS。

从图30中可以看出，SEBS材料表面经左旋与右旋抗菌聚合物修饰后，其溶血率从0.07％略微地上升到了0.11％(A)、0.17％(B)，但三组均远低于5％，均可视为无溶血现象发生，具有良好的血液相容性。

Claims (7)

1.一种在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基底材料表面预处理：将表面洁净的基底材料SEBS与光引发剂混合，将光引发剂固定到基底材料表面；

(2)引发聚合：在紫外光条件下，将8-15wt％的肽类抗菌聚合物溶液滴在步(1)所得基底材料表面，然后在紫外光下辐照8-15min，制得；

其中，肽类抗菌聚合物通过以下方法制得：

1)制备二代赖氨酸树状分子：将2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、赖氨酸甲酯二盐酸盐、HOBt和EDC·HCl混合，在冰浴中维持40-80min，然后升温至室温反应45-50h，制得；其中2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、赖氨酸甲酯二盐酸盐、HOBt和EDC·HCl的摩尔比为1:2-4:2-4:2-4；

2)制备α-氨基酸环内酸酐单体：在二代赖氨酸树状分子上接枝带保护基团的赖氨酸分子，然后在无水环境下与三光气混合，制得α-氨基酸环内酸酐单体；

3)单体的开环聚合：将α-氨基酸环内酸酐单体分子在无水环境下与引发剂混合，进行开环聚合反应，制得聚合物前体；

4)聚合物前体的PEG化与脱保护：将聚合物前体与TCEP混匀，然后加入双丙烯酸酯PEG，室温反应10-15h，然后再进行脱保护，制得以树状分子为侧链的手性肽类抗菌聚合物。

2.根据权利要求1所述的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，步骤(1)中将表面洁净的基底材料SEBS在0.5-1.5wt％光引发剂溶液中浸泡20-50min，然后在室温条件下进行干燥。

3.根据权利要求1所述的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，步骤(2)中将10wt％的肽类抗菌聚合物溶液滴在步(1)所得基底材料表面，然后在紫外光下辐照10min。

4.根据权利要求1所述的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，步骤2)中α-氨基酸环内酸酐单体的制备过程具体为：

①将二代赖氨酸树状分子、Fmoc-Lys-OH·HCl、HOBt、EDC在溶液中按摩尔比为1:1-2:2-4:2-4进行混合，然后将混合溶液在冰浴中放置40-80min，然后将反应体系温度升至室温并反应45-50h；

②将步骤①所得产物加入有机溶液中，于无水条件下加入三光气，于45-55℃反应10-15h，制得；其中，步骤①所得产物与三光气的摩尔比为4-7:1-3。

5.根据权利要求1所述的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，步骤3)中具体过程为：室温下，α-氨基酸环内酸酐与引发剂以摩尔比为1:0.01-0.02反应45-50h，制得。

6.根据权利要求1所述的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，步骤4)中聚合物前体、TCEP和双丙烯酸酯PEG的摩尔比为1:20-30:8-12。

7.根据权利要求1所述的在SEBS材料表面修饰高效杀菌聚合物的方法，其特征在于，步骤4)中向PEG化的产物中加入三氟乙酸进行脱保护，脱保护温度为室温，时间为5-8h。

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