CN111567514A - 一种保存新鲜生物组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种保存新鲜生物组织的方法，主要是将生物组织浸泡至含有GAG成分的溶液中至预设时间；将浸泡后的生物组织放入高压静电装置中干燥后密封保存或进行后续的交联处理。浸泡GAG溶液能够降低组织中GAG的丢失，有效保留组织的生物学特性。选用静电场干燥由于没有传热过程，心包组织没有升温，从而对心包材料的外观、成分、状态等具有良好的保持作用，有效避免了GAG的酶降解。其次，静电场干燥装置设备造价低廉，运行费用，更有利于大规模生产。

Description

一种保存新鲜生物组织的方法
技术领域：
本发明属于生物组织材料领域，特别涉及一种保存新鲜生物组织的方法，以应用于人工心脏瓣膜。
背景技术：
人工生物心脏瓣膜是一种治疗心脏瓣膜疾病或缺损的心脏植入医疗器械，1960年首次应用于临床，目前已成为心血管治疗领域一种非常重要的医疗器械。动物源性心包材料是制备人工生物瓣膜的核心原材料，而心包材料是包裹心脏外面的一层薄膜，表面被大片脂肪覆盖，主要成分是胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(Glycosaminoglycan ,GAG)等，经过剥离、清洗、固定后方可用于制备人工生物瓣膜。
GAG又称氨基多糖或酸性多糖，为杂多糖的一种，由含己糖醛酸（角质素除外）和己糖胺成分的重复复合单元构成的大线性多糖。存在于大量的纤维束空隙，与胶原纤维紧密相关，对维持整个纤维网络结构稳定性和保持心脏瓣膜瓣叶运动功能具有重要作用。
但研究发现，GAG在冰的盐水中保存24h后约有25%的丢失(Stability andfunction of glycosaminoglycans in porcine bioprosthetic heart valves(Lovekamp,Biomaterials,2006))。这可能是由于在组织中存在相对大量的可降解GAG的酶（如透明质酸酶、硫酸软骨素酶），在最初的人工瓣膜准备过程（组织获取、清洗、剪裁、置放，这些可能占用24h）中可能激活这些酶，导致固定前GAG的降解(Glycosaminoglycan-degrading enzymes in porcine aortic heart valves: Implications forbioprosthetic heart valve degeneration(Simionescu,The Journal of heart valvedisease, 2003))。
而现有的心包获取工艺都是在屠宰场得到表面有大片脂肪的心包膜，之后将脂肪剥离，经过清洗后保存在冰的盐水中，再运输到实验室进行后续处理。心包都是无规则的堆在冰盐水中，在运输过程，心包随盐水的晃动而进行折叠和卷曲导致质量变差，如印痕等问题。若是从国外采购新鲜心包，心包膜经剥离后放入生理盐水保存再包装运至国内，成本较高，且这对环境、温度，尤其时效要求非常苛刻，否则材料的弹性及生物负载等都将大受影响。
因此，怎样降低新鲜心包组织GAG的丢失，又可以易于保存、便捷运输，且对组织材料后续性能和处理又没有影响，成为目前需要解决的问题。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种保存新鲜生物组织的方法，以解决新鲜动物源性心包组织保存中存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种保存新鲜生物组织的方法，主要是：将生物组织浸泡至含有GAG成分的溶液中至预设时间；将浸泡后的生物组织放入高压静电装置中干燥后密封保存或进行后续的交联处理。
本发明进一步限定的技术方案为：
优选地，上述技术方案具体包括以下步骤：
S1：将经过剥离和清洗后的生物组织浸没在GAG成分的溶液中。
S2：将S1处理的生物组织包裹在中空模具上，并固定。
S3：将S2中固定的组织放入高压静电装置中干燥。
S4：将干燥后的组织裁剪下来，包装。
优选地，上述技术方案中，S1步骤中生物组织是牛、猪、马和其它哺乳动物的心包膜，也可以是哺乳动物其它部位的生物膜。
优选地，上述技术方案中，步骤S1中的浸没是指在将清洗后的生物组织平整地放入含有GAG成分的溶液中，时间为10-240min，温度为4-20℃。
优选地，上述技术方案中，S1步骤中GAG为选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素的一种或多种组合。
优选地，上述技术方案中，所述含有GAG成分的溶液中GAG的质量体积浓度为0.1-25％ W/V。
优选地，上述技术方案中，S1步骤中所述含有GAG成分的溶液中还可以加入抗氧化成分，如抗坏血酸、异抗坏血酸及其盐、乙二胺四乙酸二钠、低聚花青素等的一种或多种组合。
优选地，上述技术方案中，S2步骤中的中空模具为中空的圆柱体形、长方体形、正方体形，圆台体形、梯形体形等。
优选地，上述技术方案中，所述的这些中空模具的距上端1-10mm处还可以有凹槽，以便进一步固定生物组织。
优选地，上述技术方案中，S3步骤中高压静电装置包括金属保护箱体和箱体门、产生高压静电的装置、控制时间和温度的控制系统、样品板、电极。所述的电极还可以是不同形状，如线形电极、针形电极、板形电极等。高压电场干燥是利用电场作用力使生物组织材料中的水分沿电场强度增大的方向作定向移动，水分运动到材料表面后再被电场作用力拉出而蒸发。在此过程中，生物组织材料没有温度升高，显示出更少的收缩、更高的吸水率及再水合能力等优点，对材料的外观、成分、状态等具有极好的保持作用。高压静电电离空气，使产生离子雾和一定的臭氧。当新鲜心包组织中降解GAG的酶受到负离子的作用后，会引起活性的变化，各种代谢功能和生化反应受到抑制，从而减少新鲜心包组织中GAG的丢失。高压静电产生的臭氧可以杀菌，降低新鲜新心包组织微生物负载，有利于新鲜生物组织的长期保存。
优选地，上述技术方案中，S3步骤中的干燥是预干式的干燥，即新鲜生物组织干燥后的含水量在30-70%。干燥条件是在1-37℃、1-60KV下干燥0.1-48h。
优选地，上述技术方案中，干燥还可以分步干燥，可为第一阶段干燥、第二阶段干燥和第三阶段干燥。
优选地，上述技术方案中，经静电场干燥后的生物组织还可以不用裁剪，直接放入交联剂溶液中进行后续处理，减少生物组织的操作步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）采用预干式的保存方法保存新鲜心包组织，摒除传统的将新鲜心包组织放入生理盐水中的保存方式，降低了组织中GAG的丢失，有效保留组织的生物学特性。干态的保存方式还避免了新鲜组织出现印痕、降低了微生物负载，大大拓宽了运输温度、时效和环境等条件。而且这种预干式的新鲜心包组织由于自由水的减少，组织空隙增加，更加有利于后续工艺中交联剂的渗透，提交交联程度，增加组织的耐久性。组织再水合后的弹性性能和生物性能几乎没有变化，有效地提高材料使用率、降低生产成本。
（2）选用的静电场干燥方式有常温干燥特性，由于没有传热过程，心包组织没有升温，从而对心包材料的外观、成分、状态等具有良好的保持作用，有效避免了GAG的酶降解。其次，静电场干燥装置设备造价低廉，运行费用，更有利于大规模生产。
（3）新鲜心包组织在脂肪剥离和清洗后不可避免的会有GAG成分的丢失，因此采用干燥前将心包组织浸没在GAG成分的溶液（含抗氧化剂）中，可减少酶对GAG的降解，最大限度补充丢失的GAG成分，更大程度上保护了组织的结构，防止组织表面的氧化。且采用的中空模具固定组织还能避免干燥后材料的黏连和变形，保证组织的柔顺性，同时提高组织的使用率。
附图说明：
图1是高压静电场干燥装置示意图。
图2是中空正方体模具示意图。
图3是中空圆柱体模具示意图。
图中各标记的含义为：1-高压静电装置，2-控制系统，3-金属保护箱体，4-电极，5-牛心包组织，6-箱体门，7-中空圆柱体，8-样品板，30-圆柱体凹槽。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：
在当地屠宰厂获取牛心包组织5，经剥离、修剪和清洗后，放入含有1%(W/V) 透明质酸和1%(W/V) 硫酸软骨素的PBS溶液（pH=7.2，含0.1%（W/V）乙二胺四乙酸二钠）中，在4℃下浸没20min。取出后立即将牛心包组织5包裹在中空圆柱体7上端的圆柱形凹槽30上，并用O型圈固定。打开箱体门6，将10个含牛心包5的中空圆柱体7放在样品板8上，关闭箱体门6,接通高压装置1的电源，开启控制系统2，调节干燥参数：温度8℃、电压20KV、干燥时间3h。再关闭控制系统2，关闭高压装置1的电源，打开箱体门6，取出中空圆柱体7，将牛心包剪成圆片状后，放入PET包装袋中，密封保存。
高压静电装置1包括金属保护箱体3和箱体门6、产生高压静电的装置、控制时间和温度的控制系统2、样品板8、电极4。电极4可以是不同形状，如线形电极、针形电极、板形电极等。需要说明的是：高压静电装置可以直接商业采购，例如：桂林源林生态科技有限责任公司的JGX型静电场干燥箱。
实施例2：
在当地屠宰厂获取牛心包组织，经剥离、修剪和清洗后，放入含有2%(W/V) 硫酸软骨素和5%(W/V) 肝素的PBS溶液（pH=7.2，含0.2%（W/V）异抗坏血酸盐）中，在8℃下浸没60min。取出后立即将牛心包包裹在中空正方体的上端，并用弹性硅胶圈固定。打开箱体门6，将6个含牛心包5的中空正方体7放在样品板8上，关闭箱体门6,接通高压装置1的电源，开启控制系统2，通过两个阶段进行干燥，第一阶段干燥参数：温度4℃、电压6KV、干燥时间1h；第二阶段干燥参数：温度15℃、电压10KV、干燥时间5h。再关闭控制系统2，关闭高压装置1的电源，打开箱体门6，取出中空圆柱体7，将牛心包剪成正方形后，放入PE包装袋中，密封保存。
实施例3：
在当地屠宰厂获取猪心包组织，经剥离、修剪和清洗后，放入含有0.2%(W/V) 透明质酸、0.1%(W/V) 硫酸软骨素和3%(W/V) 肝素的D-Hanks溶液（pH=7.0，含0.5%（W/V）低聚花青素）中，在15℃下浸没20min。取出后立即将猪心包包裹在中空圆柱体的上端，并用弹性硅胶圈固定。打开箱体门6，将40个含猪心包5的中空圆柱体7放在样品板8上，关闭箱体门6,接通高压装置1的电源，开启控制系统2，调节干燥参数：温度10℃、电压12KV、干燥时间1h。再关闭控制系统2，关闭高压装置1的电源，打开箱体门6，取出中空圆柱体7，将猪心包剪成圆片状后，放入圆形PP塑料包装盒中，密封保存。
实施例4：
在当地屠宰厂获取猪真皮组织，经剥离、修剪和清洗后，放入含有0.5%(W/V) 透明质酸、 0.2%(W/V)硫酸皮肤素和0.1%(W/V)硫酸乙酰肝素的哌嗪乙磺酸钠溶液（pH=6.8）中，在4℃下浸没30min。取出后立即将猪真皮组织包裹在中空长方体的上端，并用弹性硅胶圈固定。打开箱体门6，将含猪真皮组织5的中空长方体7放在样品板8上，关闭箱体门6,接通高压装置1的电源，开启控制系统2，通过三个阶段进行干燥，第一阶段干燥参数：温度4℃、电压5KV、干燥时间30min；第二阶段干燥参数：温度15℃、电压20KV、干燥时间1h；第三阶段干燥参数：温度8℃、电压25KV、干燥时间1h。再关闭控制系统2，关闭高压装置1的电源，打开箱体门6，取出中空长方体7，将猪真皮组织剪成长方形后，放入PE包装袋中，密封保存。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (12)

1.一种保存新鲜生物组织的方法，其特征在于：将生物组织浸泡至含有GAG成分的溶液中至预设时间；将浸泡后的生物组织放入高压静电装置中干燥后密封保存或进行后续的交联处理。
2.根据权利要求1所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1：将经过剥离和清洗后的生物组织浸没在GAG成分的溶液中；
S2：将S1处理的生物组织包裹在中空模具上，并固定；
S3：将S2中固定的组织放入高压静电装置中干燥；
S4：将干燥后的组织裁剪下来，包装。
3.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述步骤S1中的生物组织可以是牛、猪、马和其它哺乳动物的心包膜，也可以是哺乳动物其它部位的生物膜。
4.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述步骤S1中的浸没是指在将清洗后的生物组织平整地放入含有GAG成分的溶液中，时间为10-240min，温度为4-20℃。
5.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述步骤S1中的GAG成分选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素的一种或多种组合。
6.根据权利要求1或2或4所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述含有GAG成分的溶液中GAG的质量体积浓度为0.1-25％ W/V。
7.根据权利要求1或2或4所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述含有GAG成分的溶液中还加入抗氧化成分，抗氧化成分为抗坏血酸、异抗坏血酸及其盐、乙二胺四乙酸二钠、低聚花青素中的一种或多种组合。
8.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述步骤S2中的中空模具为中空的圆柱体、长方体、正方体，圆台体、梯形体或者其他大小适合的立体结构。
9.根据权利要求8所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述中空模具的距上端1-10mm处有凹槽。
10.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述步骤S3中的高压静电装置包括金属保护箱体和箱体门、产生高压静电的装置、控制时间和温度的控制系统、样品板、电极。
11.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，所述步骤S3中的干燥是预干式的干燥，生物组织干燥后的含水量在30-70%，干燥条件是在1-37℃、1-60KV下干燥0.1-48h。
12.根据权利要求2所述的保存新鲜生物组织的方法，其特征在于，步骤S4也可以替换为：经静电场干燥后的生物组织还可以不用裁剪，直接放入交联剂溶液中进行后续处理。
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