CN102921047B - 一种制备多孔生物材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备多孔生物材料的方法，包括使用来自天然组织的胶原材料，用物理方法去除组织上的杂质，并通过预处理、肿胀处理、渗透压调节、化学交联、清洗以及冻干等一系列步骤制备；从而得到具有良好生物相容性，适当力学性能，降解速率可控的多孔性生物材料，所述多孔生物材料可进行植入，起到支架作用，供受损部位周围的细胞进入其中生长，从而修复人体受损组织，也可作为培养一般细胞或干细胞等的基质材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用胶原制备而成的生物材料，特别涉及一种使用动物组织中的胶原制备而成的生物材料。
背景技术
胶原是构成动物机体的重要功能物质，广泛存在于动物骨、软骨、肌腱、皮肤以及其他结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的三分之一，是动物体中最丰富的蛋白资源。目前已确认的胶原有28种，包括从Ⅰ型到ⅩⅩⅧ型，其中Ⅰ型胶原在动物体内含量最多并且其免疫原性比其他型胶原要低得多，因而被运用的也最为广泛。不同型的胶原由于分子中多肽链的初级结构不同，其生理特性也有差别。胶原基本结构为由三条肽链组成的三股螺旋绳状结构，肽链则由一系列氨基酸排列组成，其中氨基酸的排布序列影响胶原的生物性能。胶原纤维在自然组织中与相邻的蛋白、糖类或脂类形成三维结构以提供适合细胞生长的内环境，共同形成具有功能的组织。
近年来随着人们健康意识的提高和组织工程材料研究的迅猛发展，寻求到具有良好生物相容性和力学性能的医用修复材料已成为业内的迫切需求。大量研究表明胶原是一种具备诸多优点的天然聚合材料，具有其他合成材料无法比拟的生物相容性及特殊的力学性能。同种胶原（来源于人的胶原）在植入人体后无抗原性，可被人体组织接纳，与周围组织迅速整合为一体。然而，同种胶原来源非常有限，因此人们开始对异种胶原（猪或牛等其他动物来源的胶原）进行研究开发，发现异种胶原本身安全无毒，且来源广泛，还具有价格低廉及易加工成型等优点，也已获得大量临床应用的成功案例。异种胶原虽然抗原性较低但并非完全无抗原性，植入人体后在被吸收的过程中导致的炎性反应程度决定了它的转归（缓慢降解）和宿主的愈合时间。低度的炎性反应能促进血小板凝结，刺激、促进细胞生长及植入物的转归。天然胶原力学强度往往在植入体内后发生改变，在一些部位的转归速度通常也比受损部位愈合速度快，在新生组织能完全修复前，植入物完全降解会导致新生组织的再度受创，降低了治疗效果，达不到预期目标，理想的情况是转归速度与受损组织的愈合速度同步。因此，对胶原进行适当的交联，通过控制交联过程来控制交联程度，既可以进一步降低异种胶原的抗原性，同时也提高了其抗酶解特性和力学强度，从而使植入的胶原制品具有不同的植入寿命。此外，对胶原处理后制成的胶原制品的表面和内部结构的改变也会进一步影响与多种宿主细胞及组织的相互作用。目前胶原已被大量应用于制备胶原基医用材料及组织工程支架材料，如生物型心脏瓣膜、止血海绵、人工皮肤/敷料，手术缝合线，外科补片等。随着生物材料技术水平的不断提高，天然胶原将会得到更好地运用和开发，成为新一代的理想生物材料。
正因为许多研究和实践表明胶原是制备组织工程支架的理想材料，因此将胶原制成支架材料的技术工艺成为了组织工程领域的热门研究课题。通常的思路是先除去其中的非胶原成分和抗原物质进一步降低其免疫原性，再通过物理或化学方法提高其力学性能和化学稳定性，最后进行干燥。目前报道较多的制备工艺是将天然胶原材料制成胶原溶液后直接涂敷或注入模具，并在空气中自然干燥成膜或用烘箱加热烘干，这种工艺的优点是制备周期短，但制得的支架材料中一般没有孔隙存在，细胞很难向其内部生长；或者是将胶原溶液进行冷冻干燥，工艺较简单且可获得很高的孔隙率，通常采用此种工艺制备多孔支架的较多，但此种工艺耗时较长，能耗较大，且制成的材料力学性能不佳。
组织工程支架材料的特点之一是需要合适的孔径和相连的孔形态结构。材料表面结构和物理结构影响种子细胞粘附、生长和分化。其中孔径尺寸和互联互通是结构设计的关键因素。合适的孔径和相连的孔形态诱导并决定细胞的生长于分化，如直径在15-50μm的孔径诱导肌肉纤维细胞的生长,直径在20-80μm的孔径诱导上皮及内皮细胞的附着和爬行生长，直径在50-150μm的孔径诱导类骨质的生长,其中90-120μm孔径诱导软骨成长,直径在150-500μm的孔径诱导矿化骨形成。冻干过程中的预冻温度，溶液浓度，渗透压等极大地影响了制得的支架材料的孔径大小、孔隙率及三维网状结构。其中，支架孔径大小与冷冻时的预冻温度有密切关系，在一定范围内，温度降低越快，凝固时冰晶形核数越多，凝固时间越短，因此形成的冰晶颗粒越小，最后支架中的孔就越小。而支架孔径结构取决于材料溶液冷冻时的分相，溶液在凝固过程中会产生一定的温度梯度，导致冰晶的定向生长，产生一定的结晶取向，最终形成方向性的空隙。而且，胶原溶液的浓度越大，支架孔径越小越均匀，实际生产过程中可通过控制胶原溶液浓度来调节支架的孔径大小。然而目前鲜见关于溶液渗透压与支架材料的孔径关系的报道。此外，将天然胶原制成胶原溶液的过程中，容易引起胶原螺旋区结构的断裂，破坏了天然胶原的生物活性，且制成的支架材料往往不能满足生物力学性能的要求。
因此本发明寻求在保留天然胶原原有的螺旋区结构的基础上，通过控制化学处理、冻干过程中的温度和溶液渗透压来调节支架材料的孔径大小，满足生物材料的使用需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的多孔生物材料，通过对天然胶原进行特定工艺处理，并根据使用需求的不同对过程参数加以控制，从而制作出具有良好生物相容性，适当力学性能，降解速率可控的多孔性生物材料。本发明所提供的多孔生物材料可进行植入，起到支架作用，供受损部位周围的细胞进入其中生长，从而修复人体受损组织，也可作为培养一般细胞或干细胞等的基质材料。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种制备多孔生物材料的方法，包括以下具体步骤：
（1）预处理：使用来自天然组织的胶原材料，例如猪、牛等动物的心包、皮肤、肌腱、硬脑（脊）膜等含有较多胶原的组织，仅用物理方法如手撕，剪刀镊子等去除组织上的多余脂肪，血迹等杂质。
（2）肿胀处理：将（1）中处理后的胶原材料用0.01N-2N浓度的酸或碱液处理1-2小时，可初步改变胶原纤维之间空隙及材料的含水性，从而改变孔隙分布及大小。
（3）渗透压调节：根据需要不同，将（2）中处理后的胶原材料用不同渗透压的溶液进行多次清洗，不同渗透压溶液包括低渗溶液，等渗溶液和高渗溶液。其中，渗透压小于280mOsm/kg为低渗溶液，渗透压在280mOsm/kg至320mOsm/kg之间为等渗溶液，渗透压大于320mOsm/kg为高渗溶液。用于清洗的溶液渗透压越高，基材含水量越少，在后续冻干过程中形成的孔径越小，用于清洗的溶液渗透压越低，基材含水量越多，在后续冻干过程中形成的孔径越大。
（4）化学交联：将（3）中处理后的胶原材料完全浸没在交联剂中对胶原进行固定，交联剂可以是醛类，碳亚二胺或/和环氧类等化合物，交联剂通过与胶原分子间较活泼的氨基及羧基发生化学反应，降低胶原基材的免疫原性，并提高基材本身的力学强度。通过控制交联剂浓度和交联时间，交联剂浓度越大，时间越长，则交联程度越强，经交联后的胶原纤维可移动性越弱，抗降解能力越强，降解越缓慢；交联剂浓度越小，时间越短，则交联程度越弱，经交联后的胶原纤维可移动性越强，抗降解能力越弱，降解越快。此外，交联剂与材料反应过程中形成的一些亲水基团，如羟基，冻干后复水时可与水分子迅速结合，使水分子迅速渗入材料孔隙中，复水时间大为缩短，复水后具有良好的弹性。
（5）清洗：将（4）中处理后的胶原材料用不同渗透压的溶液进行多次清洗，不同渗透压溶液包括低渗溶液，等渗溶液和高渗溶液。其中，渗透压小于280mOsm/kg为低渗溶液，渗透压在280mOsm/kg至320mOsm/kg之间为等渗溶液，渗透压大于320mOsm/kg为高渗溶液。
（6）冻干：第一步，将（5）中处理后的胶原材料先进行预冻处理：方案1可将其置于两个可感应并可调控温度的平面介质之间，例如两个平面介质中各附有可通液氮的制冷管，并在介质中放置温度传感器，温度控制器一侧与温度传感器相连，接收传感器数据，另一侧与液氮泵相连，控制泵出的液氮流量大小，从而可控制胶原材料不同面的降温速率，并使胶原材料温度降至要求达到的预冻温度；方案2将一种导热系数大于2W/m·℃的平面介质预冻至与环境一致的温度后，迅速将胶原材料置于平面介质上，再置于刚才的预冻环境中预冻1-3小时降至与环境温度一致，胶原材料与介质接触的一面，降温速率较快，胶原材料未与介质接触的一面，降温速率较慢。其中，预冻环境温度范围为0℃至-200℃，材料降温速率可达到的范围为0.1℃/min-50℃/min。第二步，将预冻后的产物放入冻干机于0℃至-100℃温度下进行冻干。总之，溶液渗透压越高，材料含水量越低，预冻温度越低，降温速率越快，则冰晶形成越小越均匀，形成的孔径越小，孔隙率越高；溶液渗透压越低，材料含水量越高，预冻温度越高，降温速率越慢，则冰晶形成越大越不均匀，形成的孔径越大，孔隙率越小；
（7）包装及灭菌：将冻干后的产品密封包装后，进行辐照或环氧乙烷灭菌。
较佳的，所述碱为NaOH、KOH和/或Ca(OH)2。
较佳的，所述酸为HCl和/或过氧乙酸。
较佳的，所述不同渗透压的溶液为：低渗溶液如蒸馏水，等渗溶液如生理盐水、PBS缓冲液，12.5g/L的NaHCO3溶液，高渗溶液如质量浓度为1%-10%的NaCl溶液。
较佳的，（4）中所述交联剂为戊二醛、碳化二亚胺和/或乙二醇二缩水甘油醚。
本发明所述平面介质指的是可传递能量的平面形状的介质；优选铝合金板、铜板和/或不锈钢板。
本发明的有益效果在于：（1）保留天然活性：使用胶原材料来自天然组织，来源可以是猪、牛等动物的心包、皮肤、肌腱、硬脑（脊）膜等含有较多胶原的组织，且处理过程中未破坏其螺旋区结构，保留了生物活性；（2）可控孔径大小及孔隙率：可根据接触的组织要求不同，通过酸或碱性处理改变胶原纤维之间的空隙、控制冻干过程中的材料表面温度变化和溶液渗透压等工艺来调节材料的孔径大小，制成不同的多孔性以适合相应细胞进入生长；（3）特殊的复水性：交联工艺中根据需要采用亲水性或疏水性交联剂，改变产品冻干后的复水性能及细胞对产品的亲附程度；（4）可控降解速率：根据使用需求，通过控制交联过程来控制胶原纤维的交联程度，改变了胶原纤维的可移动度从而改变预冻过程中胶原纤维之间的空隙大小，进一步影响冻干过程中形成的冰晶大小，最终影响成品的孔径大小，使得材料的降解速率可控。（5）制成的同一个多孔生物材料的不同面可具有不同的孔径大小和孔隙率，以适应不同类型细胞长入。
附图说明
图1为显示多孔生物材料上较大的孔径，30-80μm；
图2为显示多孔生物材料上较小的孔径，5-20μm；
图3为预冻装置A，1为温度控制器，2为液氮泵，3为液氮容器，4为制冷管，5为连接线，6为温度传感器，7为平面介质，8为胶原组织；
图4为预冻装置B，7为平面介质，8为胶原组织。
具体实施方式
实施例1：
（1）预处理：选用检验检疫合格的新鲜牛心包，仅用物理方法如手撕，剪刀镊子等去除组织上的多余脂肪，血迹等杂质。
（2）肿胀处理：将（1）中预处理后的牛心包用1N的NaOH浸没1小时，
（3）渗透压调节：将（2）中肿胀处理后的牛心包用纯化水清洗6次，每次10分钟。
（4）化学交联：将（3）中渗透压调节后的牛心包用乙二醇二缩水甘油醚浸没进行化学交联15日，
（5）清洗：将（4）中化学交联后的牛心包用纯化水清洗6次，每次10分钟。
（6）冻干：采用图3所示的预冻装置A进行预冻，7采用不锈钢板，调节1，使降温速率控制在1℃/min，将（5）中清洗后的牛心包8放入，2小时后取出；然后迅速放入-40℃至-20℃的真空冻干机中进行冻干15小时。取出后在电镜下扫描，孔径如图1所示,
（7）包装及灭菌：将冻干后的产品密封包装后，进行辐照或环氧乙烷灭菌。
实施例2：
（1）预处理：选用检验检疫合格的新鲜牛心包，仅用物理方法如手撕，剪刀镊子等去除组织上的多余脂肪，血迹等。
（2）肿胀处理：将（1）中预处理后的牛心包用1N的NaOH浸没1小时，
（3）渗透压调节：将（2）中肿胀处理后的牛心包用生理盐水清洗6次，每次10分钟。
（4）化学交联：将（3）中渗透压调节后的牛心包用乙二醇二缩水甘油醚浸没进行化学交联15日，
（5）清洗：将（4）中化学交联后的牛心包用生理盐水清洗6次，每次10分钟。
（6）冻干：采用图4所示的预冻装置B进行预冻，将一个导热系数为200-300W/m·℃的铝合金方块预冻至-80℃后，将（5）中清洗后的牛心包一面置于铝合金方块上，一起置于-80℃环境中预冻2小时后取出；然后放入-40℃至-20℃真空冻干机中进行冻干15小时。取出后在电镜下扫描，孔径如图2所示。
（7）包装及灭菌：将冻干后的产品密封包装后，进行辐照或环氧乙烷灭菌。
实施例3：
（1）预处理：选用检验检疫合格的新鲜牛心包，仅用物理方法如手撕，剪刀镊子等去除组织上的多余脂肪，血迹等。
（2）肿胀处理：将（1）中预处理后的牛心包用0.8N的NaOH浸没1小时。
（3）渗透压调节：将（2）中肿胀处理后的牛心包用质量浓度为2%NaCl溶液清洗6次，每次10分钟。
（4）化学交联：将（3）中渗透压调节后的牛心包用乙二醇二缩水甘油醚进行化学交联15日，
（5）清洗：将（4）中化学交联后的牛心包用质量浓度为2%NaCl溶液清洗6次，每次10分钟。
（6）冻干：采用图4所示的预冻装置B进行预冻，将一个导热系数为200-300W/m·℃的铝合金方块7预冻至-60℃后，将（5）中清洗后的牛心包一面置于铝合金方块上，一起置于-60℃环境中预冻2小时后取出；然后放入-40℃至-20℃真空冻干机中进行冻干15小时。取出后在电镜下扫描，显示孔径为5-30μm。
（7）包装及灭菌：将冻干后的产品密封包装后，进行辐照或环氧乙烷灭菌。
Claims (8)
1.一种制备多孔生物材料的方法，包括以下具体步骤：
(1)预处理：使用来自动物组织的胶原材料，去除组织上的杂质；
(2)肿胀处理：将(1)中处理后的胶原材料用0.01N-2N浓度的酸或碱液处理以改变胶原纤维之间的空隙和胶原材料的含水性；
(3)渗透压调节：根据需要不同，将(2)中处理后的胶原材料用一种渗透压溶液进行清洗，其中，渗透压小于280mOsm/kg为低渗溶液，渗透压在280mOsm/kg至320mOsm/kg之间为等渗溶液，渗透压大于320mOsm/kg为高渗溶液；
(4)化学交联：将(3)中处理后的胶原材料完全浸没在交联剂中对胶原进行固定，所述交联剂为醛类、碳亚二胺或/和环氧类化合物；
(5)清洗：根据需要不同，将(4)中处理后的胶原材料用与(3)中相同的渗透压的溶液进行清洗；
(6)冻干：先将(5)中处理后的胶原材料于0℃至-200℃环境中进行预冻，将所述胶原材料置于两个可感应并可调控温度的平面介质之间，控制胶原材料不同面的降温速率不同，并使胶原材料降至预冻温度；或将一种导热系数大于2W/m·℃的平面介质预冻至与环境一致的温度后，将胶原材料置于平面介质上，再置于预冻环境中预冻至与环境温度一致；然后再置于冻干机中于0℃至-100℃进行冻干；
(7)包装及灭菌：将(6)中冻干后的产品密封包装后，进行辐照或环氧乙烷灭菌。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述碱为NaOH、KOH和/或Ca(OH)2。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述酸为HCl和/或过氧乙酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中，(3)和(5)中所述渗透压溶液为蒸馏水、生理盐水、PBS缓冲液、12.5g/L的NaHCO3溶液或/和质量浓度为1％-10％的NaCl溶液中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其中(2)中肿胀处理时间为1-2小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中，(4)中所述交联剂为戊二醛、碳化二亚胺和/或乙二醇二缩水甘油醚。
7.如权利要求1所述的方法，其中，(6)中预冻过程中所述胶原材料的降温速率为0.1℃/min-50℃/min。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述导热系数大于2W/m·℃的平面介质为铝合金板、铜板和/或不锈钢板。
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