CN111560463A - 三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用，包括下列步骤：（1）取叶片提取基因组DNA；（2）按照简化基因组测序技术Super‑GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；（3）对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点，并对SNP进行过滤，以提高SNP的准确性；（4）根据每个品种的分型结果筛选不同品种间至少有一个品种与其他品种不同的位点；（5）根据上述筛选策略，最终筛选到11个鉴定3种嘎啦苹果的SNP位点。基于这些标记开发出一种简便、快速、可靠鉴定三种嘎啦苹果的方法，为从源头准确控制品种奠定技术基础；三种嘎啦苹果的组培苗、嫁接苗能够准确的区分，确保育种企业对品种的把控，减少由于品种误差造成的经济损失。
Description
技术领域
本发明涉及三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
苹果(Malus pumila Mill.)是世界上重要的落叶果树之一，深受消费者喜欢，近年来发展十分迅速。我国已成为世界上最大的苹果生产国和出口国，我国苹果栽培面积和产量分别为246.69万hm2和4388.23万t，均居世界首位(丛佩华等,2018)。全世界有将近上万个登记的苹果品种，目前我国主栽的苹果主要有8个系列，60余个品种，其中最重要的6个系列分别是富士系(63.5％)、元帅系(7.6％)、秦冠(14.6％)、嘎拉(1.9％)、华冠(3.7％)、金冠(1.4％)、栽植面积之和占全国栽植总量的92.4％。在过去的几十年中，通常根据形态、生理和一些农艺性状对果树品种(系)进行鉴定。然而，传统的基于形态性状的品种鉴定需要广泛的观察成熟的植物。而且，在许多情况下，它缺乏准确的定义和客观性(Wrigley etal.,1987)。此外，受环境影响，形态学性状不能作为明确的标记。嘎啦系列苹果中嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦是目前嘎啦系列品种的主栽品种，但这三种苹果在苗期相似度非常高，而我国目前苹果品种正处在新旧品种更替，矮化密植已经是发展的趋势，因此提供简便可靠的方法确保种苗企业能够从源头上对品种控制准确显得尤为重要。
DNA分子标记技术也称为DNA指纹图谱技术，能以个体间遗传物质的核苷酸序列变异为基础，直接反应不同品种/亚群间基因组水平上的遗传多态性，具有可遗传性和可识别性。在过去的20年间，分子标记技术的快速发展成功的解决了这一难题。另一方面，不像限于多态性和时空变化的生化标记，品种特异的遗传标记因不受生理或环境的影响而在品种鉴定工作中呈现独特的优势。
发明内容
针对现有技术中三种嘎啦苹果苗期不易鉴定的缺陷，本发明提供一种嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦苹果的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法鉴定到11个品种特异的SNP标记，基于这些标记开发出一种简便、快速、可靠鉴定三种嘎啦苹果的方法，为从源头准确控制品种奠定技术基础。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案予以实现：
首先，本发明提供一种利用简化基因组测序技术Super-GBS筛选嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦苹果的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：
(1)利用品种已知的12个嘎啦、9个nema嘎啦和5个新嘎啦苹果为样品，取叶片提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。
(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到11个SNP位点，具体见下表1。
表1能够准确区分三种嘎啦苹果的位点信息
| 染色体CHROM | 位置POS | 嘎啦 | 新嘎啦 | nema嘎啦 |
| Chr12 | 32563027 | TT | GT | GT |
| Chr12 | 32563033 | TT | GT | GT |
| Chr12 | 32563350 | TT | CT | CT |
| Chr12 | 32563358 | GG | GT | GT |
| Chr15 | 7682410 | AA | AA | AG |
| Chr15 | 7682428 | TT | TT | CT |
| Chr15 | 7682449 | TT | TT | CT |
| Chr15 | 7682485 | TT | TT | CT |
| Chr8 | 11158568 | AA | AA | AG |
| Chr8 | 11158602 | CC | CC | CT |
| Chr8 | 11158937 | TT | TT | CT |
本发明的有益效果：三种嘎啦苹果的组培苗、嫁接苗能够准确的区分，确保育种企业对品种的把控，减少由于同系列品种误差造成的经济损失。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1附图为利用筛选到的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦特异标记构建进化树。利用筛选到的11个特异性SNP能够明确的区分三种嘎啦苹果。
图2附图为利用筛选到的嘎啦系列的11个SNP位点对嘎啦系列苹果的品种进行分类。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种利用简化基因组测序技术Super-GBS筛选嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦苹果的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：
(1)利用品种已知的12个嘎啦、9个nema嘎啦和5个新嘎啦苹果为样品，取叶片提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。
(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到11个SNP位点。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
1.酶切：
对本公司购买的标准机构提供的品种准确的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦分别12株、9株、5株进行Super-GBS建库，具体过程如下(以下为每个样品酶切试剂使用量)：
所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
2.连接：
在40μL体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
3.纯化
取连接产物35μL加入0.7倍体积的Sera-Mag beads(GE Healthcare LifeSciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μL 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mM Tris.HCl(pH 8.0)从磁珠中回收DNA。
4.扩增
所有成分混匀后置于PCR仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
5.混库
使用Qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入0.7倍体积的Sera-Mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为Illumina Nova PE150。建库过程所用的接头和引物序列详见下表2。
表2 Super-GBS测序文库构建接头及引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Common adaptor top | GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT |
| Common adaptor bot | CGAGATCGGAAGAGCGGGGACTTTAAGC |
| PstI adaptor top | CACGACGCTCTTCCGATCTAACXXXXXXTGCA |
| PstI adaptor bot | YYYYYYAGATCGGAAGAGCGTCGTG |
| Primer1 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| Primer2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA |
6.分析
对3个嘎啦品种，共26个样品进行Super-GBS测序，一共得到133M高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为77.35％～86.35％，所有样品的平均测序深度为36.62×。利用GATK(v3.8-1)软件得到SNP位点，然后筛选3个品种间至少有一个品种与其它品种不同的SNP位点，最终获得11个SNP位点，这些位点可用于3个嘎啦品种的鉴定，鉴定结果见图1。
实施例2
本实施例提供按照本发明的方法对山东大丰园农业有限公司苹果圃随机采集多份嘎啦苹果树苗进行品种鉴定，同时加入已知品种的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦树苗作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
(1)从山东大丰园农业有限公司苹果圃随机采集12份嘎啦苹果树苗的叶片，提取基因组DNA；
(2)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦树苗叶片各取2株，提取基因组DNA；
(3)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(4)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
(5)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。
(6)根据筛选到的11个SNP位点对18份样品构建进化树，确定苹果圃采集的样品品种。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
1.酶切：
对本公司购买的标准机构提供的品种准确的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦各2株、以及从山东大丰园农业有限公司苹果圃随机采集的12株嘎啦进行Super-GBS建库，具体过程如下(以下为每个样品使用量)：
所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
2.连接：
在40μL体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
3.纯化
取连接产物35μL加入0.7倍体积的Sera-Mag beads(GE Healthcare LifeSciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μL 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mM Tris.HCl(pH 8.0)从磁珠中回收DNA。
4.扩增
所有成分混匀后置于PCR仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
5.混库
使用Qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入0.7倍体积的Sera-Mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为Illumina Nova PE150。建库过程所用的接头和引物序列详见下表2。
表2 Super-GBS测序文库构建接头及引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Common adaptor top | GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT |
| Common adaptor bot | CGAGATCGGAAGAGCGGGGACTTTAAGC |
| PstI adaptor top | CACGACGCTCTTCCGATCTAACXXXXXXTGCA |
| PstI adaptor bot | YYYYYYAGATCGGAAGAGCGTCGTG |
| Primer1 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| Primer2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA |
6.分析
对39个样品进行Super-GBS测序，一共得到92M高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为79.25-81.47，所有样品的平均测序深度为38.2。利用GATK(v3.8-1)软件得到SNP位点，然后根据获得的11个SNP位点对18个样品构建进化树，结果见图2。其中，8株是嘎啦、5株是nema嘎啦、5株是新嘎啦。鉴定结果见图2。
实施例3
本实施例提供按照本发明的SNP位点设计相对应的PCR检测引物，对山东大丰园农业有限公司苹果圃随机采集多份嘎啦苹果树苗进行PCR扩增，并通过测序的方法进行三种嘎啦苹果品种鉴定，同时加入已知品种的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦树苗作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦树苗叶片各取2株，提取基因组DNA；
(2)利用三对嘎啦系列苹果的通用引物进行PCR扩增；
(3)对扩增的序列进行测序；
(4)根据测序结果，并参照11个SNP位点的对这测序结果中对应的11个位点的序列进行判读，根据11个位点的分型判定。
(5)根据筛选到的11个SNP位点对6份样品进行分型，确定苹果样品品种。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即PCR、测序、比对和分析。
1、PCR扩增
利用表1中的3对嘎啦苹果通用引物进行PCR扩增，引物序列见表1。扩增体系见表2，扩增条件为94℃3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。
表1 PCR扩增引物序列及扩增片段长度
2.测序
将获得的PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在550bp左右获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
3.序列比对
测序获得的结果利用DNAMAN软件进行序列比对，利用本发明标注的11个SNP位点进行三种嘎啦苹果的分型。
4.分析
对6个标准样品进行序列比对，并根据11个SNP位点进行。鉴定结结果发现，有2株嘎啦、2株nema嘎啦、2株新嘎啦，与实际情况相符。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东丰沃植物研究院有限公司 潍坊科技学院 青岛欧易生物科技有限公司
<120> 三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcggtctc ggcattcctg ctgaaccgct cttccgatct 40
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgagatcgga agagcgggga ctttaagc 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacgacgctc ttccgatcta actgca 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
yyyyyyagat cggaagagcg tcgtg 25
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaa 46
Claims (7)
1.利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦苹果特异分子标记的文库构建接头及引物序列：
2.利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦苹果特异分子标记的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)利用品种确认的12个嘎啦、9个nema嘎啦和5个新嘎啦苹果为样品，取叶片提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点，并对SNP进行过滤，以提高SNP的准确性；
(4)根据每个品种的分型结果，首先剔除所有样品中分型一致的位点，然后筛选每个品种内所有个体分型完全一致、且没有个体缺失的位点，最后筛选不同品种间至少有一个品种与其他品种不同的位点；
(5)根据上述筛选策略，最终筛选到11个鉴定3种嘎啦苹果的SNP位点。
3.根据权利要求2所述的利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，SNP过滤条件为SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点。
4.根据权利要求2所述的利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(4)是筛选特异分子标记的策略，必须保证每个品种的每个样品都有分型信息。
5.根据权利要求2所述的利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，筛选到11个嘎啦苹果特异的分子标记，其信息如下所示：
6.根据权利要求2所述的一种利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(5)中有7个高可信度SNP，可以根据这7个位点鉴定3种嘎啦苹果，这7个位点分别是第12号染色体32563027、32563033、32563350、32563358和8号染色体11158568、11158602、11158937。
7.鉴定3种嘎啦苹果的SNP位点，其特征在于，位点信息如下：
。
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| 温鑫等: "‘嘎啦’苹果花药培养种质创新", 《中国农业科学》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112126699A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-25 | 中国农业大学 | 一种苹果属植物全基因组InDel标记基因型数据库及其在种质资源特异性鉴定上的应用 |
| CN112126699B (zh) * | 2020-09-15 | 2022-03-01 | 中国农业大学 | 一种苹果属植物全基因组InDel标记基因型数据库及其在种质资源特异性鉴定上的应用 |
| CN113355392A (zh) * | 2021-05-17 | 2021-09-07 | 山东大丰园农业有限公司 | 苹果砧木特异性分子标记位点及其筛选方法和应用 |
| CN113493819A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-10-12 | 山东大丰园农业有限公司 | 富士系列苹果特异性分子标记位点及其筛选方法和应用 |
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