CN113549705B - 梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents

梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了3种梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用，包括下列步骤：（1）取叶片提取基因组DNA；（2）按照简化基因组测序技术Super‑GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；（3）对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点，并对SNP进行过滤，以提高SNP的准确性；（4）根据每个品种的分型结果筛选3种梨砧木中至少有一个品种与其他两个品种不同的位点；（5）根据上述筛选策略，最终筛选到782个鉴定3种梨砧木的SNP位点，在这些SNP位点当中，根据每个位点能够区分砧木的类别可以组合出几百组能够高效鉴别3种砧木的SNP位点标记群；基于这些位点标记开发出两种简便、快速、准确鉴定3种梨砧木的方法，为从源头准确控制梨品种奠定技术基础。

Description

梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及3种梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
梨为蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomaceae)梨属(Pyrus L.)植物，是我国主栽果树之一，栽培面积和产量仅次于苹果。砧木对梨树生产非常重要，砧木特性可以影响树体矿质营养吸收、树势和树形、树体丰产性及果实品质等。我国梨砧木主要采用实生繁殖，后代单株之间变异较大，抗逆性、生长势等表现不一致，导致嫁接品种后，树体整齐度差，不利于标准化和规模化生产。矮化砧木的栽培和推广，组织培养技术的发展为规模化生产梨砧木提供了条件。
榅桲类砧木主要有ADAMS、ELINE和BA29等，ADAMS、ELINE和BA29由于其抗病性高、生长力强等优势，成为目前梨树嫁接所用的主要砧木品种。其中BA29是法国选育生长势最强的榅桲矮化砧木，矮化效果是实生砧木的60-75％，产量与实生砧木相当，该砧木耐贫瘠，耐盐碱，耐旱，与西洋梨品种亲和性好，在世界各地均有广泛应用。
发明内容
本发明提供一种3种梨砧木的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法筛选到782个品种特异的SNP标记，基于这些标记开发出两种简便、快速、可靠鉴定3种梨砧木品种的方法，为从源头上准确繁育梨砧木品种奠定技术基础。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案予以实现：
首先，本发明提供一种利用简化基因组测序技术Super-GBS筛选3种梨砧木的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：
(1)利用品种已知且准确的6株ADAMS、2株ELINE、4株BA29梨砧木为样品，取叶片提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；
(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到782个SNP位点，具体见表1；
(6)利用782个SNP位点或者其中的部分SNP位点构建进化树和聚类分析。
其次，本发明提供一种利用PCR方法鉴定3种梨砧木的方法，包括如下步骤：
(1)从表1的SNP位点中筛选几个SNP位点组合成能够鉴定3种梨砧木品种的位点群；
(2)根据位点所在的基因组位置设计特异性的PCR扩增引物；
(3)提取3种梨砧木基因组DNA；
(4)依据所述的SNP标记群筛选方法进行SNP标记位点群筛选，已经筛选出的三个位点群及位点对应的特异性引物，如下表2-表7；
(5)利用能够扩增出SNP位点的引物进行PCR扩增；
(6)将获得的PCR产物进行一代测序；
(7)根据测序信息对照SNP位点信息进行梨砧木品种的分析和鉴定。
表1所述的SNP位点，能够筛选出多组准确鉴定3种梨砧木的SNP位点标记群，其中三组SNP位点标记群信息及标记扩增引物信息如下：
表2 其中一组能够准确鉴定3种梨砧木的SNP位点标记群
染色体CHROM 位置POS ADAMS ELINE BA29
chr1 76133 GT GG GT
chr9 11831769 AA AA AC
chr9 14042225 AG GG GG
表3 表2中SNP位点鉴定引物信息
表4 其中一组能够准确鉴定3种梨砧木的SNP位点标记群
染色体CHROM 位置POS ADAMS ELINE BA29
chr10 1679345 AA AT AA
chr10 20131321 AA AA AT
chr9 14042225 AG GG GG
表5 表4中SNP位点鉴定引物信息
表6 其中一组能够准确鉴定3种梨砧木的SNP位点标记群
染色体CHROM 位置POS ADAMS ELINE BA29
chr9 17218021 TT GT TT
chr9 14042225 AG GG GG
chr16 1166511 AC AC AA
表7 表6中SNP位点鉴定引物信息
本发明的有益效果：对3种梨砧木的组培苗、嫁接苗、成品苗能够准确的区分，确保种苗繁育企业对品种的把控，减少繁育过程中误差造成的经济损失。
本发明的3种砧木形态相似，基因组差异小，因此开发能够准确鉴定3种砧木的方法，对科研部门新品种选育、资源苗圃建立、企业苗木繁育销售、果园苗木种植生产等环节提供技术支持，具有重大意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1附图为利用筛选到的ADAMS、ELINE和BA29 3种梨砧木782个特异SNP标记构建进化树，能够准确的区分3种梨砧木。
图2附图为利用Super-GBS方法进行梨砧木样品的测序与SNP筛选，最终筛选到的SNP位点与已经确定有效的782个SNP位点95％以上重合，利用这些重合的位点对3种梨砧木进行聚类，能够准确区分3种梨砧木。
说明，本发明的图1和图2中，样品编号对应的品种如下表所示：
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种利用简化基因组测序技术Super-GBS筛选ADAMS、ELINE和BA29共3种梨砧木特异性SNP分子标记的方法，包括如下步骤：
(1)利用品种已知的12株ADAMS、ELINE和BA29梨砧木样品，取叶片提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；
(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他2个梨砧木品种中至少一个品种位点不同，最终筛选到782个SNP位点；
(6)利用782个SNP位点构建进化树和聚类分析。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
1.酶切：
对本公司购买的标准机构提供的品种准确的6株ADAMS、2株ELINE和4株BA29进行Super-GBS建库，具体过程如下(以下为每个样品酶切试剂使用量)：
DEPC水：21.4μL；10×CutSmart buffer：3μL；PstI-HF(4units)：0.2μL；MspI(8units)：0.4μL；DNA(50ng/μL)：5μL。
所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
2.连接：
在40μL体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
DEPC水：13μL；10×T4 ligase buffer：4μL；PstI Adaptor(0.1μM)：1μL；Commonadaptor(10μM)：1.5μL；T4 DNA ligase(400U/μL)：0.5μL；酶切产物：20μL。
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
3.纯化
取连接产物35μL加入0.7倍体积的Sera-Mag beads(GE Healthcare LifeSciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μL 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mM Tris.HCl(pH 8.0)从磁珠中回收DNA。
4.扩增
DEPC水：16μL；Taq5×Master Mix：5μL；Primer 1(10μM)：0.5μL；Primer 2(10μM)：0.5μL；纯化后的连接产物：3μL。
所有成分混匀后置于PCR仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
5.混库
使用Qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入0.7倍体积的Sera-Mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为Illumina Nova PE150。建库过程所用的接头和引物序列详见下表8。
表8 Super-GBS测序文库构建接头及引物序列
名称 序列(5’-3’)
Common adaptor top GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
Common adaptor bot CGAGATCGGAAGAGCGGGGACTTTAAGC
PstI adaptor top CACGACGCTCTTCCGATCTAACXXXXXXTGCA
PstI adaptor bot YYYYYYAGATCGGAAGAGCGTCGTG
Primer1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA
6.分析
对3种梨砧木品种，共12个样品进行Super-GBS测序，一共得到33M高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为79.15％～84.45％，所有样品的平均测序深度为37.62×。利用GATK(v3.8-1)软件得到SNP位点，然后筛选3个品种间至少有一个品种与其它品种不同的SNP位点，最终获得782个SNP位点，采用treebest软件分析，利用R包ggtree绘图，这些位点可用于3种梨砧木品种的准确鉴定，鉴定结果见图1。
实施例2
本实施例提供按照本发明获得的782个SNP标记中的一部分对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集的3种梨砧木进行品种鉴定，同时加入已知品种的3种梨砧木样品(实施例1中样品)的测序数据作为对照进行试验和验证。包括如下步骤：
(1)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集2株ADAMS、1株ELINE和2株BA29梨砧木品种，提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。保留与表1中的782个位点重合的SNP位点，最终获得751个SNP位点；
(5)根据筛选到的751个SNP位点对17份样品构建进化树，确定品种圃采集的样品品种。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
1.酶切：
对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集的2株ADAMS、1株ELINE和2株BA29进行Super-GBS建库，具体过程如下(以下为每个样品使用量)：
DEPC水：21.4μL；10×CutSmart buffer：3μL；PstI-HF(4units)：0.2μL；MspI(8units)：0.4μL；DNA(50ng/μL)：5μL。
所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
2.连接：
在40μL体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
DEPC水：13μL；10×T4 ligase buffer：4μL；PstI Adaptor(0.1μM)：1μL；Commonadaptor(10μM)：1.5μL；T4 DNA ligase(400U/μL)：0.5μL；酶切产物：20μL。
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
3.纯化
取连接产物35μL加入0.7倍体积的Sera-Mag beads(GE Healthcare LifeSciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μL 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mM Tris.HCl(pH 8.0)从磁珠中回收DNA。
4.扩增
DEPC水：16μL；Taq5×Master Mix：5μL；Primer 1(10μM)：0.5μL；Primer 2(10μM)：0.5μL；纯化后的连接产物：3μL。
所有成分混匀后置于PCR仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
5.混库
使用Qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入0.7倍体积的Sera-Mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为Illumina Nova PE150。建库过程所用的接头和引物序列详见下实施例1中的表8。
6.分析
对5个样品进行Super-GBS测序，一共得到7.8M高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为79.03-83.51，所有样品的平均测序深度为38.2。利用GATK(v3.8-1)软件得到大量SNP位点，然后根据表1中已经经过验证的SNP位点信息挑选本次测序结果中与其重合的SNP位点，最终筛选到751个SNP位点，采用treebest软件分析，利用R包ggtree绘图，这些位点可用于3种梨砧木品种的准确鉴定，结果见图2。
实施例3
本实施例提供按照本发明的782个SNP位点筛选少数几个SNP位点，并根据位点所在基因组的位置设计相对应的PCR检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃采集的多份品种准确的梨砧木树苗基因组DNA进行PCR扩增，并通过一代测序的方法进行3种梨砧木品种鉴定，同时加入已知品种的3种梨砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的ADAMS、ELINE和BA29梨砧木各2株，提取基因组DNA；
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集ADAMS、ELINE和BA29梨砧木各2株，提取基因组DNA；
(3)从782个SNP位点中挑取一组能够准确鉴定3种梨砧木的SNP位点群，见表2；
(4)根据挑取的SNP位点所在的基因组位置设计PCR扩增的上下游引物，见表3；
(5)利用表3中3种梨砧木的通用引物进行PCR扩增；
(6)对扩增的序列进行一代测序；
(7)参照所用的SNP位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行梨砧木品种的分型判读。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即PCR、测序、比对和分析。
1、PCR扩增
根据表2中的位点所在位置设计PCR扩增引物，引物序列见表3。扩增条件为94℃3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
DNA：2μL；Taq2×Master Mix：25μL；Primer F(10μM)：1μL；Primer R(10μM)：1μL；ddH2O：21μL。
2.测序
将获得的PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
3.序列比对
测序获得的结果利用DNAMAN软件或者SnapGene进行序列比对，利用本发明782个位点中筛选的一组SNP位点标记群(见表2)进行3种梨砧木品种的分型。
4.分析
序列比对鉴定结果发现，3种梨砧木ADAMS、ELINE和BA29共计12株鉴定结果与实际品种情况相符。
实施例4
本实施例提供按照本发明的782个SNP位点筛选少数几个SNP位点，并根据位点所在基因组的位置设计相对应的PCR检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃采集的多份品种准确的梨砧木树苗基因组DNA进行PCR扩增，并通过一代测序的方法进行3种梨砧木品种鉴定，同时加入已知品种的3种梨砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的ADAMS、ELINE和BA29梨砧木各2株，提取基因组DNA；
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集ADAMS、ELINE和BA29梨砧木各2株，提取基因组DNA；
(3)从782个SNP位点中挑取一组能够准确鉴定3种梨砧木的SNP位点群，见表4；
(4)根据挑取的SNP位点所在的基因组位置设计PCR扩增的上下游引物，见表5；
(5)利用表5中3种梨砧木的通用引物进行PCR扩增；
(6)对扩增的序列进行一代测序；
(7)参照所用的SNP位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行梨砧木品种的分型判读。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即PCR、测序、比对和分析。
1、PCR扩增
根据表4中的位点所在位置设计PCR扩增引物，引物序列见表5。扩增条件为94℃3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
DNA：2μL；Taq2×Master Mix：25μL；Primer F(10μM)：1μL；Primer R(10μM)：1μL；ddH2O：21μL。
2.测序
将获得的PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
3.序列比对
测序获得的结果利用DNAMAN软件或者SnapGene进行序列比对，利用本发明782个位点中筛选的一组SNP位点标记群(见表4)进行3种梨砧木品种的分型。
4.分析
序列比对鉴定结果发现，3种梨砧木ADAMS、ELINE和BA29共计12株鉴定结果与实际品种情况相符。
实施例5
本实施例提供按照本发明的782个SNP位点筛选少数几个SNP位点，并根据位点所在基因组的位置设计相对应的PCR检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃采集的多份品种准确的梨砧木树苗基因组DNA进行PCR扩增，并通过一代测序的方法进行3种梨砧木品种鉴定，同时加入已知品种的3种梨砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的ADAMS、ELINE和BA29梨砧木各2株，提取基因组DNA；
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集ADAMS、ELINE和BA29梨砧木各2株，提取基因组DNA；
(3)从782个SNP位点中挑取一组能够准确鉴定3种梨砧木的SNP位点群，见表6；
(4)根据挑取的SNP位点所在的基因组位置设计PCR扩增的上下游引物，见表7；
(5)利用表7中3种梨砧木的通用引物进行PCR扩增；
(6)对扩增的序列进行一代测序；
(7)参照所用的SNP位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行梨砧木品种的分型判读。
具体的操作步骤如下：
本实施例主要包含以下步骤，即PCR、测序、比对和分析。
1、PCR扩增
根据表6中的位点所在位置设计PCR扩增引物，引物序列见表7。扩增条件为94℃3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
DNA：2μL；Taq2×Master Mix：25μL；Primer F(10μM)：1μL；Primer R(10μM)：1μL；ddH2O：21μL。
2.测序
将获得的PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
3.序列比对
测序获得的结果利用DNAMAN软件或者SnapGene进行序列比对，利用本发明782个位点中筛选的一组SNP位点标记群(见表6)进行3种梨砧木品种的分型。
4.分析
序列比对鉴定结果发现，3种梨砧木ADAMS、ELINE和BA29共计12株鉴定结果与实际品种情况相符。
从782个SNP位点中挑取其他SNP位点标记群，同样可以准确鉴定3种梨砧木ADAMS、ELINE和BA29。
本发明的表1如下：
表1 梨砧木品种鉴别SNP位点
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 山东大丰园农业有限公司
<120> 梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtattggcg cgaagatggt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtcagctt gccgagaagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtagcaggg aggactacgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtctccgc gtgctcataa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctttggag gactcacgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaggtggct gtaacttgcc 20

Claims (1)

1.检测表2中SNP位点的引物在准确鉴定3种梨砧木中的应用，其特征在于，所述3种梨砧木为ADAMS、ELINE和BA29；
所述SNP位点信息见表2，所述引物信息见表3：
表2能够准确鉴定3种梨砧木的一组SNP位点信息
染色体CHROM 位置POS ADAMS ELINE BA29 chr1 76133 GT GG GT chr9 11831769 AA AA AC chr9 14042225 AG GG GG
表3所述表2中SNP位点鉴定引物信息
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