CN111557967A - 一种丹参红花提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种丹参红花提取物及其制备方法与应用，通过进一步的提取有效筛选和保留了核心功效成分，减少了药物的副作用，通过抑制葡萄糖代谢、刺激脂肪酸代谢功能改善缺血再灌注心脏的能量代谢障碍；通过抑制血小板脱颗粒、发生聚集改善血流动力学参数，预防血栓的发生；上调抗氧化应激内源性代谢标志物牛磺酸的水平，抑制脂质过氧化，保护心肌抗氧化应激损伤；还可以通过补体系统抑制缺血再灌注损伤引起的心肌炎症发应；对减轻冠心病患者的心肌缺血再灌注损伤效果显著。

Description

一种丹参红花提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其是涉及一种丹参红花提取物及其制备方法与应用。
背景技术
冠心病(CHD)是一种常见的心血管疾病，发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，严重危害着人类的生命健康。近年来，在冠心病的治疗措施中，经皮冠状动脉介入治疗(PCI)占有越来越重要的地位，但易造成心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)。MI/RI机制包括氧化应激损伤、脂质过氧化、钙离子超载、炎症反应、能量代谢障碍、细胞凋亡等。
丹红方由丹参和红花两位药组成，具有活血化瘀，通脉舒络，祛痰生新，除邪不伤正的功效，可用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞和脑血栓等症。临床数据显示：丹红方可明显减少急性心肌梗死(AMI)、患者PCI术后无复流现象的发生、降低MI/RI心律失常的发生率、减轻氧化应激对血管内皮的损伤、改善PCI术后血管内皮功能、抑制炎症因子释放、稳定动脉粥样斑块。
近年来的研究表明丹红方中含有大量的植物初生化学成分，而这类成分组合物的药效作用尚未见研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种丹参红花提取物。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述丹参红花提取物的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述丹参红花提取物的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种丹参红花提取物，是由下述方法制备得到的：
(1)将丹参-红花浓缩水提取液通过十八烷基硅烷键合硅胶开放型色谱柱，分别使用0.1％甲酸水、0.1％甲酸-水甲醇(90:10)、0.1％甲酸水-甲醇(5:95)三个梯度的洗脱剂进行洗脱，每个梯度分别冲洗27、14和1个柱体积；
(2)收集前33个柱体积的流份为D1并进行减压浓缩干燥；
(3)收集第34、35个柱体积的流份，采用0.1％甲酸水(A相)-甲醇(B相)的洗脱系统，在280nm的紫外检测波长下，通过SB-C18高效液相制备色谱柱进一步分离，进样量为400μL，在0-20min将流动相设为95％的A相和5％的B相进行冲洗，流速为10mL/min，在21-22min采用相同比例的流动相，流速设为8mL/min；收集0-22min所得到的流份为D2；
(4)合并D1和D2，减压浓缩，冻干后即得。
优选的，上述丹参红花提取物，是由下述方法制备得到的：将丹参、红花药材混合后用水温浸后浓缩滤液获得丹参-红花浓缩水提取液。
优选的，上述丹参红花提取物，是由下述方法制备得到的：丹参、红花药材按质量比3:1混合后，以10倍体积的水65℃温浸两次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至1倍体积，获得丹参-红花浓缩水提取液。
优选的，上述丹参红花提取物，主要成分包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖、芸香糖、芸香酮糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、琥珀酸、丙二酸、甲酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、葫芦巴碱和尿苷。
优选的，上述丹参红花提取物，上述各主要成分的含量(均值±标准差)分别为：
Figure BDA0002497928920000031
Figure BDA0002497928920000041
上述丹参红花提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将丹参-红花浓缩水提取液通过十八烷基硅烷键合硅胶开放型色谱柱，分别使用0.1％甲酸水、0.1％甲酸-水甲醇(90:10)、0.1％甲酸水-甲醇(5:95)三个梯度的洗脱剂进行洗脱，每个梯度分别冲洗27、14和1个柱体积；
(2)收集前33个柱体积的流份为D1并进行减压浓缩干燥；
(3)收集第34、35个柱体积的流份，采用0.1％甲酸水(A相)-甲醇(B相)的洗脱系统，在280nm的紫外检测波长下，通过SB-C18高效液相制备色谱柱进一步分离，进样量为400μL，在0-20min将流动相设为95％的A相和5％的B相进行冲洗，流速为10mL/min，在21-22min采用相同比例的流动相，流速设为8mL/min；收集0-22min所得到的流份为D2；
(4)合并D1和D2，减压浓缩，冻干后即得。
上述丹参红花提取物在制备用于用于预防和缓解/减轻心肌缺血再灌注损伤的药物方面的应用。
上述心肌缺血再灌注损伤指心内直视手术、冠状动脉搭桥术、冠状动脉腔内成形术、溶栓术后以及心肌内侧支循环血量突然增加等情况下发生的心肌缺血后再灌注损伤。
本发明的有益效果是：
所述丹参红花提取物，通过进一步的提取有效筛选和保留了核心功效成分，减少了药物的副作用，通过抑制葡萄糖代谢、刺激脂肪酸代谢功能改善缺血再灌注心脏的能量代谢障碍；通过抑制血小板脱颗粒、发生聚集改善血流动力学参数，预防血栓的发生；上调抗氧化应激内源性代谢标志物牛磺酸的水平，抑制脂质过氧化，保护心肌抗氧化应激损伤；还可以通过补体系统抑制缺血再灌注损伤引起的心肌炎症发应；对减轻冠心病患者的心肌缺血再灌注损伤效果显著。
附图说明
图1中药初生组分中22种化学成分的结构式；
图2中药初生组分调节心肌中代谢物标志物的箱线图；
图3中药初生组分调节心肌脂质物标志物的柱状图；
图4中药初生组分调节血清中代谢物标志物的箱线图；
图5中药初生组分调节血清中脂质物标志物的柱状图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
实施例1
制备丹参红花提取物：丹参、红花药材按质量比3:1混合后，以10倍体积的水65℃温浸两次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至1倍体积，获得丹参-红花浓缩水提取液。
1.中药初生组分的制备与检测
将3mL丹参-红花浓缩水提取液通过开放型ODS柱，色谱柱填料十八烷基硅烷键合硅胶300g。分别使用0.1％甲酸水、0.1％甲酸-水甲醇(90:10)、0.1％甲酸水-甲醇(5:95)三个梯度的洗脱剂进行洗脱，每个梯度分别冲洗27、14和1个柱体积，收集前33个柱体积的流份为D1并进行减压浓缩干燥；收集第34、35个柱体积的流份，采用0.1％甲酸水(A相)-甲醇(B相)的洗脱系统，在280nm的紫外检测波长下，通过SB-C18高效液相制备色谱柱进一步分离，进样量为400μL，在0-20min将流动相设为95％的A相和5％的B相进行冲洗，流速为10mL/min，在21-22min采用相同比例的流动相，流速设为8mL/min。收集0-22min所得到的流份为D2，合并D1和D2，减压浓缩，冻干后获得初生组分(丹参红花提取物)。
精密称取初生组分40mg，溶解于2.4mL含0.2mM TSP-d4的重水中，取500μL转移至5mm核磁管中，密封，直接用于1H-NMR测试。
2.中药初生组分对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠心动功能、血流变的影响
将SPF级雄性健康SD大鼠随机分为假手术组(i.v.生理盐水0.75mL/kg)、模型组(i.v.生理盐水0.75mL/kg)、初生组分治疗组(i.v.13mg/kg)，连续7天预给药。将给药后的大鼠称重，打开胸腔对冠状动脉左前降支进行结扎，而后进行复灌、再灌注，心电图ST段逐渐下降一半左右即表示模型建立成功，假手术组只穿线不结扎。分别评价术后三组大鼠的心脏功能，测定血流动力学参数，大鼠腹主动脉取血，脏器称重，组织冻存。
3.中药初生组分对MI/RI大鼠代谢标志物的影响
大鼠心肌组织(-100mg)，用甲醇和水(2:1)提取，提取物复溶于重水溶剂中后转移至核磁管待测。
另取大鼠心肌组织(-100mg)，加入氯仿和水(2:1)提取，分别获得水层和氯仿层提取物。氯仿层脂质提取物复溶于氘代氯仿中，转移至核磁管待测。水层除去溶剂后复溶于含有EDTA-2Na的重水溶剂中，转移至核磁管中待测。
取大鼠血清100μL，加入70μL重水，取上清150μL转移至核磁管中。
4.中药初生组分对MI/RI大鼠心肌蛋白质组的影响
心肌组织样本中加入适量Lysis Buffer(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS)，混匀研磨离心后，取上清液分装冷冻保存。采用Bradford法对蛋白质进行定量并验证，再将蛋白质酶解并用iTRAQ进行标记，进行酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析。对差异蛋白分析时，定量值进行归一化处理，采用Maxquant significances A方法检验差异显著性，卡Pvalue<0.05、Fold change>1.1倍筛选差异蛋白。
实验结果
1.中药初生组分的定性、定量分析结果
中药初生组分样品溶液的1H-NMR图谱经过相位校正、基线校正和化学位移校正后，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，鉴定出22种化合物(图1)，包括5个单糖(葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖)、5个寡糖(芸香糖、芸香酮糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖)、3个有机酸(琥珀酸、丙二酸、甲酸)、7个氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸)以及葫芦巴碱和尿苷。它们的质子信号峰1H-NMR的化学位移信号归属见表1。
表1中药初生组分中22种化学成分的关键质子信号归属
Figure BDA0002497928920000081
Figure BDA0002497928920000091
在1H-NMR指纹图谱中选择分辨率高、重叠性低的质子信号峰为对应化合物的定量峰及内标定量峰分别进行积分，按照内标定量法公式计算各化合物的含量。
Figure BDA0002497928920000092
其中WX为待测物的浓度，WTSP为内标TSP的浓度，AX、ATSP分别为待测化合物和内标物TSP的定量峰积分面积，NX、NTSP分别为待测化合物和内标物TSP的定量峰质子个数，MX、MTSP分别为待测化合物和内标物TSP的相对分子质量。根据上述公式，计算了在初生组分溶液中22个化学成分的含量(表2)。
表2中药初生组分中22个化学成分含量测定结果
Figure BDA0002497928920000093
Figure BDA0002497928920000101
2.中药初生组分对MI/RI大鼠的心脏保护作用
与模型组相比，中药初生组分可以增加左心室收缩压、左心室舒张压、左心室射血分数、增加左室内压最大下降速率，减少左心室松弛时间常数(表3)。中药组分显著改善心肌收缩功能和舒张功能，纠正了扩张的心脏结构，改善心脏重塑，提示初生组分缓解心肌缺血再灌注对心脏的损伤功能。
表3大鼠心脏超声动态检测结果及血流动力学指标检测结果(均数±标准差)
假手术组 模型组 初生组分组
左心室收缩末期内径(mm) 4.21±0.42 5.24±0.81** 4.78±0.61
左心室舒张末期后壁厚度(mm) 1.91±0.18 1.70±0.20* 1.80±0.32
左心室射血分数(％) 68.7±4.60 45.0±9.47** 51.9±5.87<sup>#</sup>
左心室短轴缩短分数(％) 39.7±3.90 23.2±5.52** 27.3±3.83
左室收缩压(mmHg) 117±8.05 90.0±8.43** 111±3.46<sup>##</sup>
左室舒张压(mmHg) 107±7.01 67.1±8.36** 87.3±4.67<sup>##</sup>
左室内压最大上升速率(mmHg/s) 7368±793 4262±300** 5078±943
左室内压最大下降速率(mmHg/s) 7912±541 3982±274** 4896±919<sup>#</sup>
心率(bmp) 446±20 389±12.3** 406±20.0
左心室松弛时间常数(ms) 10.9±3.74 25.4±6.90** 19.8±3.25<sup>#</sup>
与假手术组比较：*P<0.05、**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05、##P<0.01。
3.中药初生组分对MI/RI大鼠代谢标志物的调节作用
差异代谢物主要通过有监督的正交偏最小二乘判别分析法进行筛选，卡VIP值大于1以及p小于0.05。筛选结果显示：
在大鼠心肌组织中，初生组分可以将16种代谢标志物调归正常水平，包括下调亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、琥珀酸盐、天冬氨酸、葡萄糖、甘油、甘氨酸和苏氨酸水平，上调谷氨酰胺、谷胱甘肽、肌酸、胆碱、肉碱和牛磺酸水平(图2)。此外，初生成分组能显著调节心肌组织的脂代谢紊乱，涉及多不饱和脂肪酸、甘油磷脂、二十二碳烯酸、二烯丙基酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、单不饱和脂肪酸和亚油酸(图3)。
在大鼠血清中，初生组分可以调节亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘油三酯、二烯丙基酸、多不饱和脂肪酸、胆固醇等代谢差异物回归正常水平(图4、5)。
4.中药组分对MI/RI大鼠心肌差异表达蛋白的影响
iTRAQ定量蛋白质组分析结果显示，初生组分给药组与模型组之间存在770个差异蛋白质，这些差异蛋白质富集于以下信号通路(FDR<0.05)：血小板脱粒、血小板激活信号和聚集、纤维蛋白凝块的形成(凝块级联)、补体级联调节、网格蛋白介导的内吞作用、翻译后蛋白质磷酸化、胰岛素样生长因子结合蛋白对胰岛素样生长因子转运和摄取的调控、细胞外基质的组织、表皮生长因子受体下调、从血浆中清除血红素、乳糜微粒组装、与弹性纤维有关的分子、通过清除受体结合和吸收配体、血浆脂蛋白的组装、硫酸角质素降解、ER到高尔基顺行运输、整合素细胞表面的相互作用、嗜中性粒细胞脱颗粒、天冬酰胺N糖基化、类固醇激素受体的HSP90伴侣周期、纤维蛋白凝块形成的共同途径、柠檬酸循环与呼吸电子传递、纤维蛋白凝块形成的内在途径、丙酮酸代谢、线粒体铁硫簇生物发生、乳糜微粒重构、血浆脂蛋白的组装、重塑和清除、红细胞吸收氧气并释放二氧化碳。
5.结论
中药初生组分可以通过抑制葡萄糖代谢、刺激脂肪酸代谢功能改善缺血再灌注心脏的能量代谢障碍；通过抑制血小板脱颗粒、发生聚集改善血流动力学参数，预防血栓的发生；上调抗氧化应激内源性代谢标志物牛磺酸的水平，抑制脂质过氧化，保护心肌抗氧化应激损伤；还可以通过补体系统抑制缺血再灌注损伤引起的心肌炎症发应。
以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种丹参红花提取物，其特征在于：是由下述方法制备得到的：
(1)将丹参-红花浓缩水提取液通过十八烷基硅烷键合硅胶开放型色谱柱，分别使用0.1％甲酸水、0.1％甲酸-水甲醇90:10溶液、0.1％甲酸水-甲醇5:95溶液三个梯度的洗脱剂进行洗脱，每个梯度分别冲洗27、14和1个柱体积；
(2)收集前33个柱体积的流份为D1并进行减压浓缩干燥；
(3)收集第34、35个柱体积的流份，采用A相0.1％甲酸水-B相甲醇的洗脱系统，在280nm的紫外检测波长下，通过SB-C18高效液相制备色谱柱进一步分离，进样量为400μL，在0-20min将流动相设为95％的A相和5％的B相进行冲洗，流速为10mL/min，在21-22min采用相同比例的流动相，流速设为8mL/min；收集0-22min所得到的流份为D2；
(4)合并D1和D2，减压浓缩，冻干后即得。
2.根据权利要求1所述的丹参红花提取物，其特征在于：是由下述方法制备得到的：将丹参、红花药材混合后用水温浸后浓缩滤液获得丹参-红花浓缩水提取液。
3.根据权利要求2所述的丹参红花提取物，其特征在于：是由下述方法制备得到的：丹参、红花药材按质量比3:1混合后，以10倍体积的水65℃温浸两次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至1倍体积，获得丹参-红花浓缩水提取液。
4.根据权利要求1所述的丹参红花提取物，其特征在于：主要成分包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖、芸香糖、芸香酮糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、琥珀酸、丙二酸、甲酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、葫芦巴碱和尿苷。
5.根据权利要求4所述的丹参红花提取物，其特征在于：各主要成分的含量(均值±标准差)分别为：
Figure FDA0002497928910000021
6.权利要求1所述丹参红花提取物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)将丹参-红花浓缩水提取液通过十八烷基硅烷键合硅胶开放型色谱柱，分别使用0.1％甲酸水、0.1％甲酸-水甲醇90:10溶液、0.1％甲酸水-甲醇5:95溶液三个梯度的洗脱剂进行洗脱，每个梯度分别冲洗27、14和1个柱体积；
(2)收集前33个柱体积的流份为D1并进行减压浓缩干燥；
(3)收集第34、35个柱体积的流份，采用A相0.1％甲酸水-B相甲醇的洗脱系统，在280nm的紫外检测波长下，通过SB-C18高效液相制备色谱柱进一步分离，进样量为400μL，在0-20min将流动相设为95％的A相和5％的B相进行冲洗，流速为10mL/min，在21-22min采用相同比例的流动相，流速设为8mL/min；收集0-22min所得到的流份为D2；
(4)合并D1和D2，减压浓缩，冻干后即得。
7.权利要求1所述丹参红花提取物在制备用于用于预防和缓解/减轻心肌缺血再灌注损伤的药物方面的应用。
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