CN111549145A - 基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法。本发明的技术方案为：检测方法主要步骤为：1.选取公开的微型基因条形码序列为引物，以提取自待测样品中的DNA为模板进行PCR扩增；2.对PCR扩增产物直接进行高分辨熔解；3.采用MyGo Pro仪器分析采集的数据，利用分析归一化、差异化熔解曲线以及PCA中的一种或多种进行目的基因的区分与鉴别。本发明实现了对样品中不同动物源性成分的鉴别。解决了特异性引物设计和优化困难，通用性引物通用范围小的不足，提高了检测通量和降低了操作难度。大大提高了检测通量，重复性良好，检测效果理想。

Description

基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的 试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法。

背景技术

DNA条形码是一段较短的标准DNA序列，是物种的一种身份识别系统。自2003年加拿大科研人员Hebert等人提出用线粒体细胞色素c氧化酶（COI）作为DNA条形码来进行识别物种身份后，关于DNA条形码的分析和研究开始发展和扩大。DNA条形码的识别主要依据物种的种内保守性和种间多样性。由于DNA条形码不受形态学方法限定，操作简单，近年来在动物，植物，微生物方面取得了广泛应用。经过筛选和研究分析，植物条形码多采用rbcL和matK区域序列，动物条形码一般为线粒体细胞色素c氧化酶（COI）。在分析深加工产品和短片段的目标基因时，长片段的DNA条形码（~650bp）应用受到限制。本发明采用的微型基因条码大小为192bp，更适合各种原材料及其加工产品的分析，同时具有更高的分辨率。在实际应用中基因条形码需要结合PCR以及测序来完成，通过PCR富集和筛选靶目标，测序获得PCR扩增产物的序列信息，经过在线数据库（BOLD/NCBI）的分析比对，最终确定分析对象的身份信息。但由于测序价格高且耗时长，使得条形码方法无法得到广泛应用。本发明提出HRM分析结合DNA条形码的检测方法。

HRM是一种实时PCR结合饱和染料和高分辨率仪器来检测样本荧光信号的方法，通过分析采集的荧光信息和熔解曲线，来进行基因筛选和分型。对于70-300bp的基因序列，HRM可以实现单核苷酸多态性，短序列的插入和缺失的检测，具有很高的灵敏度。相比较于普通熔解曲线而言，熔解曲线形状和位置重复性好，检测结果更加准确。DNA条形码结合HRM可以实现闭管检测和鉴定多个目标序列，具有操作简单，检测范围广，检测速度快，灵敏度高，高通量的优点。

发明内容

本发明的目的是要提供一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法，为微型基因条码结合HRM在掺假鉴定方面提供了方向和参考数据，包括PCR反应体系参数，扩增程序和高分辨熔解程序，在发展真实性鉴定和原产地溯源领域具有广阔的应用前景。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，具体包括以下步骤：

（1）根据样品中的不同动物源性成分的可能存在情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，在NCBI查找微型基因条形码对应的DNA序列，使用u-Melt软件在线拟合高分辨熔解曲线，判断是否可以达到区分目的，若可能存在的动物源性成分种类在GB/T 35918-2018所列的微型基因条形码可区分的范围内，则扩增片段长度为192bp；

（2）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解可能存在的动物源性成分对应的标准品DNA，制定高分辨熔解数据库；

（3）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解实际样品中的DNA，将其放入步骤（2）所得的标准高分辨熔解数据库中分析比对，区分和鉴别样品中动物源性成分。

所述步骤（2）中，用于扩增的引物序列为：

上游引物：

FISHCOILBC_ts：5'-CTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3'；

下游引物:

REVshort1：5'-GGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC-3'。

所述PCR扩增体系为：5.00μL 2×Tap PCR Master Mix，1.00μL（20ng/µL） DNA模板，10μM的正向引物和反向引物各0.20μL，0.50μL 20×EvaGreen染料，最后用超纯水将反应体系补足至10.00μL。

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；执行40个循环，包括94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。

所述高分辨熔解程序为：初始温度65℃停留60s，熔解梯度为4℃/s，终止温度95℃停留1s，熔解梯度为0.05℃/s。

一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒，包括：微型基因条形码引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品的PCR扩增产物对应的高分辨熔解曲线，所述对照品选自不同动物种类的基因组DNA或对应各动物种类的基因组DNA的组合。

所述不同动物种类的基因组DNA 为山羊、绵羊、牛和水牛的基因组DNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用微型基因条形码引物进行PCR扩增，以提取自样品的DNA为模板，经过HRM分析区分多个动物源性成分，实现了对样品中不同动物源性成分的鉴别。

本发明不需要单独设计通用引物或者特异性引物，统一采用微型基因条形码引物，解决了特异性引物设计和优化困难，通用性引物通用范围小的不足，提高了检测通量和降低了操作难度。

本发明扩增的的片段大小为192bp，对于经过高温，高压等深加工产品中降解的DNA片段可实现有效扩增，且对于一些特定长度的短片段可以成功检测。

本发明采用的微型基因条形码可以同时扩增牛，水牛，绵羊，山羊四种物种，但不仅限于此四种，还包括GB/T 35918-2018微型基因条形码下的共计64个物种，大大提高了检测通量。

HRM具有很高的分别率和灵敏度，对于同一目标序列设置的多个重复对应的熔解曲线基本重合，重复性良好，相比于普通熔解曲线的检测结果更准确，检测效果理想。

附图说明

图1为山羊、绵羊、牛、水牛基因组DNA的鉴别图；A-理论拟合的熔解峰图；B-实验得到的熔解峰图；C-PCR扩增曲线图；D-电泳验证图。

图2为山羊、绵羊、牛、水牛多组分混合差异化熔解曲线区分效果图；A -单组份；B-两组分；C-三组分和四组分（PCA）；D-多组分。

图3牛和山羊不同比例混合区分效果图；A-二维主成分分析图（PCA）；B-标准曲线图。

图4为八种市售乳制品样品动物源性成分检测结果图；A -归一化熔解曲线图；B -二维主成分分析图（PCA）。

图5为实际样品8的测序结果图。

图中，G-山羊基因组DNA、S-绵羊基因组DNA、B-牛基因组DNA、W-水牛基因组DNA、NTC-空白对照组。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式包括但不限于以下实施例表示的范围。

实施例

(一)乳样品来源及DNA提取

生鲜牛乳和山羊乳采自未央区奶牛场和市场，绵羊乳和水牛乳购于淘宝网店。不同品牌的牛、羊乳产品（液态乳、全脂奶粉、脱脂奶粉及配方奶粉），共计6种样品，分别编号为1-6，相对应标签成分依次为：牛+山羊，牛+山羊，牛+山羊，牛+山羊，牛+山羊，牛，山羊，山羊，以上市售样品分别购自西安市以及网上不同的超市。获取时间为2018年11月。

按照常规操作离心去除脂肪后，采用磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒提取乳样品中的DNA，利用超微量核酸定量仪测定确认DNA的纯度，保证260／280ｎｍ在1.5~2范围，260/230nm在1.7以上，并测定DNA的浓度，用1×的TE将所有样品DNA稀释至20ng/μL备用。

（二）DNA条形码结合HRM检测方法的建立

（1）选取DNA条形码引物

DNA条形码引物选自国家标准《GB/T 35918-2018 动物制品中动物源性检测基因条形码技术Sanger测序法》中的微型基因条码序列：

FISHCOILBC_ts	5'-CTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3'
		REVshort1	5'-GGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC-3'

根据NCBI所公布的NC_005044（山羊）、NC_001941（绵羊）、EU177861（奶牛）和NC_006295（水牛）的基因序列，选取基因条形码引物扩增的完整核苷酸序列。使用u-Melt软件拟合熔解曲线，判断目标序列区分情况，进一步确认多个目标序列利用高分辨熔解曲线区分的可能性。

（三）PCR-HRM扩增

（1）PCR 扩增

PCR体系和反应程序如下：预变性、变性、退火、延伸、保存。

（2）高分辨熔解曲线分析

高分辨率熔解曲线分析使用MyGo Pro（version 3.3）软件进行。熔解结束后，根据荧光值随着温度的变化趋势，绘制出熔解曲线，其中荧光值对温度的负倒数（dF/dT）的峰值表示PCR扩增产物的熔解温度；为了更明显的区分和突出熔解曲线之间的细小差异，将每一个测试归一化熔解曲线的荧光值减去所有测试样品荧光值的平均值，绘制差异化视图，差异化曲线可以将不同基因型的差异更加放大，从而更方便区分不同的物种。进一步根据熔解曲线形状的相似性，将样品分组，进行PCA聚类分析。

(四)可行性分析

（1）理论拟合高分辨熔解曲线

用u-melt在线工具拟合牛，水牛，山羊、绵羊四个物种的条形码DNA的高分辨熔解曲线，结果显示在图1A，得到4条独立特异的熔解曲线，曲线相互之间可以相互区分，证明理论上可以通过高分辨熔解曲线区分四个物种。

（2）实验获得高分辨熔解曲线

应用磁珠法提取乳制品中的DNA，采用微型条形码扩增提取得到的DNA，进一步熔解获得高分辨熔解曲线，如图1B所示，四个物种对应四条熔解曲线，各熔解曲线具有特异性，且熔解曲线间区分程度明显，实验证明四个物种可以通过高分辨熔解曲线进行区分。

（3）琼脂糖凝胶电泳

扩增产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小，调整电泳仪电压100V，电泳约30min置凝胶成像分析系统观察结果。图1D结果显示，电泳条带明显，牛、水牛、绵羊、山羊扩增产物的片段大小相等，为192bp，符合预期大小。

（4）测序

委托上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序结果与NCBI上已知序列进行对比。结果显示实验获得的扩增序列与NCBI公布的序列一致，证明所获得的扩增产物是目标DNA。

(五)多组分混合DNA模板检测

（1）15种可能组合的测定

预先将15种可能组合的模板混合，执行相同的PCR-HRM实验程序，导出实验数据并绘制得到差异化熔解曲线，实验结果图2显示，15种不同的目标序列具有不同的曲线特征，相同目标序列的熔解曲线具有相似特征，且熔解曲线位置相近。根据差异化熔解曲线特征及位置来确定目标物是否一致，是否存在掺假现象。

（2）不同掺假比例的测定

预先将目标DNA按照不同比例混合，如山羊:牛（100%:0，95%:5%，80%:20%，50%:50%，20%:80%，10%:90%，0:100%，），对混合后的模板执行相同的PCR操作，进一步进行高分辨熔解曲线分析。结果如图3A所示，同一目标模板设置6个复孔，6个重复样品被划为一个聚类，随着牛掺入山羊中的比例增大，对应的聚类位置逐渐靠近100%牛的聚类。以掺假比例和PC1数值绘制图3B，得出掺假比例和PC1具有明显的线性关系）（R²=0.942），因此可以通过高分辨熔解曲线实现掺假定量的目的，确认掺假程度是否符合标准。

（3）建立不同掺假比例的标准图库

根据不同掺假比例得到的实验数据，建立标准曲线，可以从标准曲线中推断掺假比例的大小。

(六)市售样品的实际检测与验证

使用所建立的微型条形码PCR-HRM方法对市售产品进行真实性鉴定。如对牛奶和山羊奶进行掺伪检测，确定其真实性。结果如图4显示，样品6含有牛奶单一成分，与标签所示一致。其他样品均含有牛奶和羊奶两种成分。如样品8的分析测序峰图，其中出现了部分套峰，为两组分现象，截取部分套峰片段进行分析，正反向测序结果均显示，出现套峰的位置为牛羊完整DNA序列中碱基不匹配的位置，证明了该样品为混掺样品，含有牛羊两种成分，与PCA分析结果一致。实验结果与测序验证结果一致，证明本发明所建立的微型条形码PCR-HRM实验方法可用于市售样品的乳源真实性检测，具有实际应用价值。

序列表

<110> 陕西科技大学

<120> 基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法

<130> 2020.5.27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

ctcaacyaat cayaaagata tyggcac 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成()

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

ggyatnacta traagaaaat tattac 26

Claims (6)

1.一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

具体包括以下步骤：

（1）根据样品中的不同动物源性成分的可能存在情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，在NCBI查找微型基因条形码对应的DNA序列，使用u-Melt软件在线拟合高分辨熔解曲线，判断是否可以达到区分目的，若可能存在的动物源性成分种类在GB/T 35918-2018所列的微型基因条形码可区分的范围内，则扩增片段长度为192bp；

（2）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解可能存在的动物源性成分对应的标准品DNA，制定高分辨熔解数据库；

（3）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解实际样品中的DNA，将其放入步骤（2）所得的标准高分辨熔解数据库中分析比对，区分和鉴别样品中动物源性成分。

2.根据权利要求1所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

所述步骤（2）中，用于扩增的引物序列为：

上游引物：

FISHCOILBC_ts：5'-CTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3'；

下游引物:

REVshort1：5'-GGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC-3'。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

所述PCR扩增体系为：5.00μL 2×Tap PCR Master Mix，1.00μL（20ng/µL） DNA模板，10μM的正向引物和反向引物各0.20μL，0.50μL 20×EvaGreen染料，最后用超纯水将反应体系补足至10.00μL；

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；执行40个循环，包括94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。

4.根据权利要求3所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，其特征在于：

所述高分辨熔解程序为：初始温度65℃停留60s，熔解梯度为4℃/s，终止温度95℃停留1s，熔解梯度为0.05℃/s。

5.一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒，其特征在于：

包括微型基因条形码引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品的PCR扩增产物对应的高分辨熔解曲线，所述对照品选自不同动物种类的基因组DNA或对应各动物种类的基因组DNA的组合。

6.根据权利要求5所述的一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒，其特征在于：

所述不同动物种类的基因组DNA 为山羊、绵羊、牛和水牛的基因组DNA。

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