CN111548433A - 一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括，称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，得碱提滤液，pH值调至6.8～7.0，再加入胃蛋白酶，50～60℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，将灭活的酶解液pH值调至6.4～6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，得吸附滤液，加入蛋白沉淀剂，搅拌、离心，弃沉淀，得鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分数4％‑4.5％的无水乙酸钠，搅拌，用NaOH溶液调节pH至5.8～6.2，加入乙醇，搅拌，静置，离心后取沉淀在60～70℃条件下干燥，得硫酸软骨素。本发明首次以鮰鱼鱼骨为原料提取硫酸软骨素，提取方法工艺生产操作方便，生产周期短，得率高。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及到一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，简称CS)，是一种聚阴离子酸性粘多糖，属糖胺聚糖类物质，由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结成双糖聚合物，一般呈白色或微黄色的粉末，略带碱味，无臭，无味，具有吸湿性，易溶于水，难溶于甲醇，乙醇，乙醚，丙酮和冰醋酸等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸软骨素广泛存在于人和动物的骨骼、软骨、肌腱、韧带等组织中，发挥着许多重要的生理功能。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，目前临床上主要用于骨关节炎、心脑血管疾病及眼科疾病的预防和治疗，且长期服用毒副作用小，是很有开发潜力的药物。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。
随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果。目前硫酸软骨素的分离方法主要有碱法提取、盐法提取、酶法提取、超声辅助法等，但这些方法存在步骤繁琐，操作困难，生产周期长，成本高，产品纯度和得率都偏低，质量不稳定的问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括，称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，并间歇搅拌，过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤，合并两次滤液，得碱提滤液；将碱提滤液pH值调至6.8～7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1～1.2％的胃蛋白酶，50～60℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，灭酶处理得酶解液；将灭活的酶解液pH值调至6.4～6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液；向吸附滤液中加入占吸附滤液质量百分比为10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，弃沉淀，得鱼骨浸提液；取鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分数4％-4.5％的无水乙酸钠，搅拌，用NaOH溶液调节pH至5.8～6.2，加入乙醇，搅拌，4℃静置12h，离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，得硫酸软骨素。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述鮰鱼鱼骨粉，其制备方法为：将鮰鱼鱼骨于80～100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，其中，所述NaOH溶液的浓度为1mol/L，NaOH溶液与鮰鱼鱼骨粉体积质量比以mL：g计为6:1。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述胃蛋白酶，其酶活为474U/mg。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述灭酶处理得酶解液，其中，灭酶处理温度为90℃，灭酶处理时间为10min，用冷水迅速降至室温。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，其中，活性炭的加入量为清液体积的5～6％，搅拌转速为60～80r/min，静置时间为0.5～1h。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述向吸附滤液中加入占吸附滤液质量10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，其中，蛋白沉淀剂为三氯乙酸，搅拌转速为60～80r/min，时间为1～2min，离心转速为5000r/min，离心时间为20min。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述加入乙醇，搅拌，其中，乙醇浓度为80～90Wt％的乙醇，搅拌转速为40～60r/min，时间为1～3min。
作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所述离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，其中，离心转速为5000r/min，离心时间为20min，干燥方法为真空干燥或冷冻干燥中的一种。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，通过“稀碱-酶”法提取硫酸软骨素，用蛋白酶将蛋白聚糖和胶原蛋白等水解成短肽或氨基酸，酶法反应条件温和，但硫酸软骨素结构不易被破坏，蛋白酶无法使糖昔键及其周围的化链彻底断裂，将影响产品纯度，因此，本发明采用稀碱法先除去长肽链，再结合酶法进行提取，可有效提高生产效率，同时又能减少碱液使用量，降低生产成本。
(2)本发明从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，以鮰鱼鱼骨粉为原料，通过稀碱处理后，优选胃蛋白酶作为水解酶，并优选酶解参数，结合后续的活性炭吸附工艺、蛋白沉淀工艺和特定的醇沉工艺，各工艺协同作用，硫酸软骨素的纯度和得率均达到最佳。同时，本发明意外发现，采用胃蛋白酶更有利于鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，提取效果更佳，可能由于胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性，倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键，而鮰鱼鱼骨中与硫酸软骨素相结合的蛋白质中氨基端或羧基端为芳香族氨基酸的蛋白质较多，所以胃蛋白酶的提取效果更佳。
(3)本发明首次以鮰鱼鱼骨为原料提取硫酸软骨素，高值化利用加工下脚料，既节约了资源、保护了环境，又开阔了硫酸软骨素的来源，同时提高鮰鱼的利用率，本发明的提取方法工艺生产操作方便，生产周期短，得率高。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明中胃蛋白酶(1:10000)：474U/mg飞净型号：PHYGENE PH1492；本发明中胰蛋白酶(1:250)：250N.F.U/mg飞净型号：PHYGENE PH9033；本发明中木瓜蛋白酶：≥3units/mg麦克林型号：MACKLIN P815680；其他原料，如无特殊说明，均为普通市售。
实施例1
本实施例提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括：
(1)将鮰鱼鱼骨于100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。
(2)称取10g(1)中制得的鱼骨粉，与NaOH溶液(1mol/L)按料液比1:6(g:ml)于50℃水浴中恒温浸取6h，提取过程中间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min；之后过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤；合并两次的滤液，得碱提滤液。
(3)将(2)中制得的碱提滤液pH值调至7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1.1％的胃蛋白酶(酶活为474U/mg)，50℃条件下反应2h，制得粗酶解液，90℃灭酶处理10min，用冷水迅速降至室温，得酶解液。
(4)将(3)中制得的酶解液pH值调至6.5，加入活性炭(活性炭的加入量为酶解清液体积的5％)，60r/min搅拌吸附1h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液。
(5)将(4)中制得的吸附滤液中加入占其质量10％的三氯乙酸，60r/min搅拌1min，5000r/min离心20min后，弃沉淀，得鱼骨浸提液。
(6)取100ml(5)中制得的鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分比4.0％无水乙酸钠，搅拌使体系溶解，使用NaOH溶液(1mol/L)调节pH至5.8，于清液中加入乙醇(90Wt％)以体积比清液∶乙醇为1∶3，60r/min搅拌3min，4℃静置12h，5000r/min离心20min后，弃上清液，取沉淀60℃干燥得硫酸软骨素。
实施例2
本实施例提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括：
(1)将鮰鱼鱼骨于100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。
(2)称取10g(1)中制得的鱼骨粉，与NaOH溶液(1mol/L)按料液比1:6(g:ml)于50℃水浴中恒温浸取6h，提取过程中间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min；之后过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤；合并两次的滤液，得碱提滤液。
(3)将(2)中制得的碱提滤液pH值调至7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1.1％的胰蛋白酶，50℃条件下反应2h，制得粗酶解液，90℃灭酶处理10min，用冷水迅速降至室温，得酶解液。
(4)将(3)中制得的酶解液pH值调至6.5，加入活性炭(活性炭的加入量为酶解清液体积的5％)，60r/min搅拌吸附1h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液。
(5)将(4)中制得的吸附滤液中加入占其质量10％的三氯乙酸，60r/min搅拌1min，5000r/min离心20min后，弃沉淀，得鱼骨浸提液。
(6)取100ml(5)中制得的鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分比4.0％无水乙酸钠，搅拌使体系溶解，使用NaOH溶液(1mol/L)调节pH至5.8，于清液中加入乙醇(90Wt％)以体积比清液∶乙醇为1∶3，60r/min搅拌3min，4℃静置12h，5000r/min离心20min后，弃上清液，取沉淀60℃干燥得硫酸软骨素。
实施例3
本实施例提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括：
(1)将鮰鱼鱼骨于100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。
(2)称取10g(1)中制得的鱼骨粉，与NaOH溶液(1mol/L)按料液比1:6(g:ml)于50℃水浴中恒温浸取6h，提取过程中间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min；之后过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤；合并两次的滤液，得碱提滤液。
(3)将(2)中制得的碱提滤液pH值调至7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1.1％的木瓜蛋白酶，50℃条件下反应2h，制得粗酶解液，90℃灭酶处理10min，用冷水迅速降至室温，得酶解液。
(4)将(3)中制得的酶解液pH值调至6.5，加入活性炭(活性炭的加入量为酶解清液体积的5％)，60r/min搅拌吸附1h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液。
(5)将(4)中制得的吸附滤液中加入占其质量10％的三氯乙酸，60r/min搅拌1min，5000r/min离心20min后，弃沉淀，得鱼骨浸提液。
(6)取100ml(5)中制得的鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分比4.0％无水乙酸钠，搅拌使体系溶解，使用NaOH溶液(1mol/L)调节pH至5.8，于清液中加入乙醇(90Wt％)以体积比清液∶乙醇为1∶3，60r/min搅拌3min，4℃静置12h，5000r/min离心20min后，弃上清液，取沉淀60℃干燥得硫酸软骨素。
本发明中硫酸软骨素纯度以氨基葡萄糖含量为指标，根据标准曲线求出样品中的盐酸氨基葡萄糖含量，经换算得到样品的硫酸软骨素纯度。本发明中硫酸软骨素的得率，其计算方法：先将样品酸水解成氨基葡糖，然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛进行衍生显红色，在525nm波长处测定吸收度，以盐酸氨基葡糖作对照品，计算氨基葡糖含量，根据分子量之比换算成硫酸软骨素的含量。
实施例1～实施例3制得的硫酸软骨素的得率和纯度见表1。
表1
从表1可以看出，实施例1的工艺硫酸软骨素的得率和纯度均达到最佳水平。
实施例4
在实施例1的基础上，将胃蛋白酶依次替换为：
试验1：胃蛋白酶：胰蛋白酶按照质量比1:1复配；
试验2：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按照质量比1:1复配；
试验3：胰蛋白酶：木瓜蛋白酶按照质量比1:1复配；
试验4：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按照质量比1:2复配；
试验5：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按照质量比2:1复配；
试验6：胰蛋白酶：木瓜蛋白酶按照质量比1:2复配。其他条件均与实施例1相同，测定硫酸软骨素的得率和纯度见表2。
表2
用蛋白酶将蛋白聚糖和胶原蛋白等水解成短肽或氨基酸，酶法反应条件温和，对设备要求不高，硫酸软骨素结构不易被破坏，但鉴于蛋白酶无法使糖昔键及其周围的化链彻底断裂，将影响产品纯度。因此，采用稀碱法先除去长肽链，再结合酶法进行提取，可有效提高生产效率，同时又能减少碱液使用量，降低生产成本。本发明意外发现，采用胃蛋白酶更有利于鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，提取效果更佳，可能由于胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性，倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键，而鮰鱼鱼骨中与硫酸软骨素相结合的蛋白质中氨基端或羧基端为芳香族氨基酸的蛋白质较多，所以胃蛋白酶的提取效果更佳。
实施例5
本实施例与实施例1相比，酶添加量为1.5％，其他条件与实施例1相同。
实施例6
本实施例与实施例1相比，酶添加量为0.7％，其他条件与实施例1相同。
实施例7
本实施例与实施例1相比，酶解时间为1h，其他条件与实施例1相同。
实施例8
本实施例与实施例1相比，酶解时间为3h，其他条件与实施例1相同。
实施例9
本实施例与实施例1相比，酶解温度为40℃，其他条件与实施例1相同。
实施例10
本实施例与实施例1相比，酶解温度为60℃，其他条件与实施例1相同。
实施例11
本实施例与实施例1相比，酶解pH为6，其他条件与实施例1相同。
实施例12
本实施例与实施例1相比，酶解pH为6.5，其他条件与实施例1相同。
测定实施例5～12中硫酸软骨素的得率和纯度，结果见表3。
表3
实施例12
本实施例提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括：
(1)将鮰鱼鱼骨于100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。
(2)称取10g(1)中制得的鱼骨粉，与NaOH溶液(1mol/L)按料液比1:6(g:ml)于50℃水浴中恒温浸取6h，提取过程中间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min；之后过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤；合并两次的滤液，得碱提滤液。
(3)将(2)中制得的碱提滤液pH值调至7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1.1％的胃蛋白酶(酶活为474U/mg)，50℃条件下反应2h，制得粗酶解液，90℃灭酶处理10min，用冷水迅速降至室温，得酶解液。
(4)将(3)中制得的酶解液pH值调至6.5，加入活性炭(活性炭的加入量为酶解清液体积的5％)，60r/min搅拌吸附1h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液。
(5)将(4)中制得的吸附滤液中加入占其质量10％的三氯乙酸，60r/min搅拌1min，5000r/min离心20min后，弃沉淀，得鱼骨浸提液。
(6)取100ml(5)中制得的鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分比4.5％无水乙酸钠，搅拌使体系溶解，使用NaOH溶液(1mol/L)调节pH至6.0，于清液中加入乙醇(90Wt％)以体积比清液∶乙醇为1∶2.5，60r/min搅拌3min，4℃静置12h，5000r/min离心20min后，弃上清液，取沉淀60℃干燥得硫酸软骨素。
实施例1、实施例12制得的硫酸软骨素的得率和纯度见表4。
表4
实施例13
在实施例1的基础上，将乙酸钠添加量分别为3.5％、4.0％、4.5％、5.0％，其他条件均与实施例1相同，结果见表5。
表5
从表5可以看出，当乙酸钠添加量为4.0％时，硫酸软骨素得率最高，当乙酸钠质量浓度大于4.0％时，硫酸软骨素的提取率从1.26％下降到0.98％，这可能由于当乙酸钠浓度过大时导致一些蛋白质和有机盐溶出率增大，降低了硫酸软骨素的提取率。
实施例14
在实施例1的基础上，在步骤(6)中调节提取液pH分别为5.6、5.8、6.0、6.2，其他条件均与实施例1相同，结果见表6。
表6
从表6可以看出，当pH为5.8时，硫酸软骨素提取率最高。当pH处于5.8时，硫酸软骨素分子表面净电荷数最少，分子间吸引力增加，硫酸软骨素分子聚集产生沉淀。当pH大于5.8时，硫酸软骨素的提取率从1.28％降低到1.03％，可能由于pH的变化会影响某些蛋白质的聚沉，杂质的溶出率增加，降低了硫酸软骨素的提取率。
发明人进一步研究发现，硫酸软骨素是一种聚阴离子的高分子化合物，分子中含有-SO3H和-COOH等阴离子基团，乙酸钠加入后钠离子平衡了阴离子基团的电荷，分子间吸引力增大，硫酸软骨素易于聚集沉降；同时，盐离子破坏了硫酸软骨素与水分子之间强烈的吸附作用，使之溶解度降低而大量聚集沉降析出，两者协同作用，进一步提高硫酸软骨素得率。同时，本发明优选提取液的pH值5.8，此条件下净电荷数减少，分子间吸引力增加，硫酸软骨素分子聚集产生沉淀更佳；当不在此范围内时，效果不佳。
本发明提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，通过“稀碱-酶”法提取硫酸软骨素，用蛋白酶将蛋白聚糖和胶原蛋白等水解成短肽或氨基酸，酶法反应条件温和，但硫酸软骨素结构不易被破坏，蛋白酶无法使糖昔键及其周围的化链彻底断裂，将影响产品纯度，因此，本发明采用稀碱法先除去长肽链，再结合酶法进行提取，可有效提高生产效率，同时又能减少碱液使用量，降低生产成本。本发明从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，以鮰鱼鱼骨粉为原料，通过稀碱处理后，优选胃蛋白酶作为水解酶，并优选酶解参数，结合后续的活性炭吸附工艺、蛋白沉淀工艺和特定的醇沉工艺，各工艺协同作用，硫酸软骨素的纯度和得率均达到最佳。同时，本发明意外发现，采用胃蛋白酶更有利于鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，提取效果更佳，可能由于胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性，倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键，而鮰鱼鱼骨中与硫酸软骨素相结合的蛋白质中氨基端或羧基端为芳香族氨基酸的蛋白质较多，所以胃蛋白酶的提取效果更佳。
发明人进一步研究发现，硫酸软骨素是一种聚阴离子的高分子化合物，分子中含有-SO3H和-COOH等阴离子基团，乙酸钠加入后钠离子平衡了阴离子基团的电荷，分子间吸引力增大，硫酸软骨素易于聚集沉降；同时，盐离子破坏了硫酸软骨素与水分子之间强烈的吸附作用，使之溶解度降低而大量聚集沉降析出，两者协同作用，进一步提高硫酸软骨素得率。同时，本发明优选提取液的pH值5.8，此条件下净电荷数减少，分子间吸引力增加，硫酸软骨素分子聚集产生沉淀更佳；当不在此范围内时，效果不佳。
本发明首次以鮰鱼鱼骨为原料提取硫酸软骨素，高值化利用加工下脚料，既节约了资源、保护了环境，又开阔了硫酸软骨素的来源，同时提高鮰鱼的利用率，本发明的提取方法工艺生产操作方便，生产周期短，得率高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：包括，
称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，并间歇搅拌，过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤，合并两次滤液，得碱提滤液；
将碱提滤液pH值调至6.8～7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1～1.2％的胃蛋白酶，50～60℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，灭酶处理得酶解液；
将灭活的酶解液pH值调至6.4～6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液；
向吸附滤液中加入占吸附滤液质量百分比为10～12％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，弃沉淀，得鱼骨浸提液；
取鱼骨浸提液，加入占鱼骨浸提液质量百分数4％-4.5％的无水乙酸钠，搅拌，用NaOH溶液调节pH至5.8～6.2，加入乙醇，搅拌，4℃静置12h，离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，得硫酸软骨素。
2.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述鮰鱼鱼骨粉，其制备方法为：将鮰鱼鱼骨于80～100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。
3.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，其中，所述NaOH溶液的浓度为1mol/L，NaOH溶液与鮰鱼鱼骨粉体积质量比以mL：g计为6:1。
4.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min。
5.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述胃蛋白酶，其酶活为474U/mg。
6.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述灭酶处理得酶解液，其中，灭酶处理温度为90℃，灭酶处理时间为10min，用冷水迅速降至室温。
7.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，其中，活性炭的加入量为清液体积的5～6％，搅拌转速为60～80r/min，静置时间为0.5～1h。
8.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述向吸附滤液中加入占吸附滤液质量10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，其中，蛋白沉淀剂为三氯乙酸，搅拌转速为60～80r/min，时间为1～2min，离心转速为5000r/min，离心时间为20min。
9.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述加入乙醇，搅拌，其中，乙醇浓度为80～90Wt％的乙醇，搅拌转速为40～60r/min，时间为1～3min。
10.如权利要求1所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，其中，离心转速为5000r/min，离心时间为20min。
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