CN111548417A

CN111548417A - EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用

Info

Publication number: CN111548417A
Application number: CN202010260394.XA
Authority: CN
Inventors: 张洪涛; 易玲; 闫卓红; 王小珏
Original assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Current assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111548417B

Abstract

本发明公开了一种EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明公开的人源抗体具有如SEQ ID NO.6‑8所示的轻链CDR和SEQ ID NO.11‑12所示的重链CDR。该人源抗体可以特异性结合人EGFR和EGFRvIII两种蛋白，具有较高的亲和力，且其为全人源抗体，具有更低的免疫原性，本发明为以EGFR为靶点的相关癌症的治疗提供了一种新的抗体选择。

Description

EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种人EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用。

背景技术

EGFR(epidermal growth factor receptor)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。它是由原癌基因c-erbB1编码的一种多功能跨膜糖蛋白，分子量约为170kD，由1186个氨基酸组成，分为胞内区、胞外区和跨膜区，EGFR人体内分布非常广泛，在哺乳动物上皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞等细胞膜上均有表达，EGFR其它家族成员还包括HER2、HER3和HER4。EGFR及其家族成员在细胞生长、增殖、分化、存活和迁移中均起着非常重要生理调控作用。

EGFR在多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和前列腺癌)存在突变或高表达，与肿瘤发生、发展和恶性增值密切相关，并因此成为目前最为成功的肿瘤治疗靶点之一，适用于肺癌、消化道等多种肿瘤治疗。EGFR突变主要有四种形式，包括基因扩增、框内缺失、串联重复和点突变，EGFR突变体III(EGFR variantIII，EGFRvIII)最常见突变形式之一，成为神经系统肿瘤诊疗潜在靶点，也可见于多种类型肿瘤，目前为止，尚未在正常组织中检出EGFRvIII，EGFRvIII是相关肿瘤诊断的重要标识。特别是近年来，抗体药物治疗迅猛发展，业已成为肿瘤免疫治疗的重要工具，全球范围内，EGFR是热门靶点，至今已有多个EGFR抗体批准进入临床，包括西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗和尼妥珠单抗，它们对肿瘤治疗适应症和应用呈上升态势，在这些上市的EGFR单抗中，只有帕尼单抗(Panitumumab)可以同时中和EGFRvIII和野生型EGFR抗体，减弱细胞内活化信号，具有显著的体外和体内肿瘤活性。但目前这些抗体中，不少抗体仍具有鼠源蛋白成分，易产生抗鼠抗体反应，反复应用时会影响效能，鉴于人源抗体药物发展大趋势，制备特色人源EGFR单克隆抗体，在EGFR靶向的免疫导向治疗中，则具有更好应用价值和前景。目前全人源抗体的获得仍不易。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用，本发明所提供的人源抗体可以特异性结合EGFR和EGFRvIII两种蛋白，具有较高的亲和力，且该抗体为全人源抗体，具有更低的免疫原性，为EGFR为靶点相关癌症治疗提供一种新的抗体选择。

除非另外定义，在此使用的所有技术术语、注释以及其他科学术语或科学术语是旨在具有本发明涉及领域普通技术人员所通常理解的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了便于引用在此定义了具有通常理解含义的术语，并且在此包括这类定义不必解释成表示与本领域通常理解的具有显著差异。在此说明或引用的许多技术和步骤被本领域普通技术人员良好地理解并且使用常规方法一般性地使用。除非另外说明，通常地根据制造商限定的实验方案和/或参数来执行涉及使用可商购的试剂盒和试剂的步骤。

一方面，本发明提供一种抗EGFR或EGFRvIII的全人源抗体或其抗原结合片段，所述人源抗体或其抗原结合片段均具有如SEQ ID NO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及如SEQ ID NO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。

目前人源化抗体已经彻底取代鼠源抗体的治疗应用，主要是通过鼠源抗体的人源化实现，而全人源抗体则成为新一代治疗性抗体发展的大趋势。全人源抗体技术主要有转人Ig基因鼠、抗体库技术和单个B细胞技术。噬菌体库技术具有更好的可操作性，其中诱导性抗体库，有助于获得特定目标抗原针对性抗体，提高成功率。本发明选择肺癌患者为主体，入组了较大样本量，构建肺癌B细胞来源的噬菌体单链抗体库，从中筛选得到上述抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体。该人源抗体对EGFR和EGFRvIII均具有特异性结合能力，具有双特异性特点，且该人源抗体对EGFR和EGFRvIII蛋白具有较高的亲和力以及检测灵敏度，由于该人源抗体的序列均为人源序列，其应用于人体靶向EGFR相关的癌症治疗时，不容易引起体内的异源蛋白免疫反应，本发明为靶向EGFR提供了一种新的抗体选择。

术语“抗体”特别地是指包含通过二硫键连接的至少两个重链和两个轻链的蛋白质。术语“抗体”包括天然产生的抗体以及抗体的重组形式，例如，在原核生物中表达的抗体、未糖基化的抗体、人源抗体和嵌合抗体。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包含三个或-在IgM-或IgE-型抗体的情况下-四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一个恒定结构域CH1与可变区相邻，并且可以通过铰链区连接第二个恒定结构域CH2。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布更保守的区域，称为框架区(FR)，其中每个可变区包含三个CDR和四个FR。然而，根据本发明的术语“抗体”还包括如重链抗体(即，抗体只由一个或多个(特别是两个)重链组成)和纳米抗体(即，抗体只由单个单体可变结构域组成)这样的抗体。

术语“人源抗体”特别地是指其中至少一个CDR源自人抗体并且其中恒定区(如果存在)和可变区的至少一个框架区源自人抗体或人抗体共有序列的抗体。优选地，重链可变区的所有CDR，或更优选地，重链可变区和轻链可变区的所有CDR，源自人抗体。此外，优选重链可变区的所有框架区，或更优选地，重链可变区和轻链可变区的所有框架区源自人抗体或人抗体共有序列。CDR优选源自相同的非人抗体。一个可变区的头三个或所有框架区优选源自相同的人抗体或人抗体共有序列，然而，重链可变区的框架区不是必须源自与轻链可变区的框架区相同的人抗体或人抗体共有序列。目前最优化的非异源蛋白抗体是，其全部序列均来自于人的免疫球蛋白基因，包括来自转人Ig转基因鼠和直接从人体获取的B细胞来源的抗体基因全序列，这样抗体称为“全人源”抗体，或简称为“人源”抗体。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述人源抗体或其抗原结合片段具有如SEQID NO.9所示的轻链可变区和SEQ ID NO.13所示的重链可变区。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述人源抗体的重链恒定区选自人IgG、人IgM、人IgE、人IgA或人IgD的重链恒定区。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述人IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

可选地，在本发明的一些实施方式中，人IgA为IgA1或IgA2。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述人源抗体的重链恒定区如SEQ IDNO.17的第141-470位所示。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述人源抗体的轻链恒定区选自人κ型轻链或人λ型轻链的恒定区。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述人源抗体的轻链恒定区如SEQ IDNO.15的第133-239位所示。

人源抗体的恒定区可以源自任何人抗体或人抗体共有序列。特别地，重链恒定区可以是任何类型的，如γ、δ、α、μ或ε型重链。人源抗体因此可以是任何同种型的，如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，包括任何亚类，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。优选地，人源抗体是IgG1或IgG2抗体，更优选IgG1抗体。此外，轻链恒定区也可以是任何类型的，如κ-或λ-型轻链。优选地，人源抗体的轻链是κ-链。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述EGFR突变体III的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段在制备以EGFR为靶点治疗癌症的药物中的应用。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述癌症为EGFR和/或EGFR突变体III表达呈阳性的癌症。

所述癌症包括但不限于胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、结肠癌、肝癌和膀胱癌；任何EGFR和/或EGFR突变体III表达呈阳性的癌症均可以适用本发明提供的人源抗体或其抗原结合片段进行治疗。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述胶质细胞瘤为神经胶质细胞瘤。

可选地，在本发明的一些实施方案中，结肠癌指转移性结直肠癌；

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述肺癌为非小细胞肺癌(包括腺癌和鳞癌等)。

另一方面，本发明提供一种治疗癌症的药物，其含有如上任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明提供一种检测EGFR或EGFRvIII的试剂，其含有如上任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明提供一种表达嵌合抗原受体的细胞，所述嵌合抗原受体具有靶向EGFR的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及具有如SEQ ID NO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.9所示的轻链可变区和SEQ ID NO.13所示的重链可变区。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述细胞为T-细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、中性粒细胞或干细胞等。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导功能域。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述跨膜结构域选自如下蛋白分子中的至少一种的跨膜结构域：CD5、CD3ε、CD4、CD28、CD137、CD9、CD154、CD45、CD37、CD16、CD22、CD134、CD33和CD8。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述共刺激信号传导功能域包含如下共刺激分子中的至少一种的细胞内结构域：OX40、CD134、CD5、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD154、CD79a、CD137、CD22、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD79b、CD28、ICOS、4-1BB和CD3ζ。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述共刺激信号传导功能域包括4-1BB的胞内共刺激元件和CD3ζ的胞内结构域。

另一方面，本发明提供一种抗体偶联物，其含有如上任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

本发明的抗体偶联物可以利用各种标记偶联技术，对抗体进行毒素、肿瘤治疗药物、酶、荧光素和同位素等标记。

与所述人源抗体或其抗原结合片段偶联的分子可以是成像剂，也可以是治疗剂，或其他分子。

成像剂例如可以是放射性元素、酶、当暴露于紫外等一定的光谱照射时能发出荧光的化学药品和其他物质。许多荧光材料是已知的并且可用作成像剂。这些成像剂包括例如荧光素、罗丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。

可检测的成像剂包括但不限于放射性标记物例如同位素³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²¹I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、²¹¹At、¹⁹⁸Au、⁶⁷Cu、²²⁵Ac、²¹³Bi、⁹⁹Tc和¹⁸⁶Re，可使用抗体成像领域内已知的常规化学作用将其连接至本发明的抗体。成像剂还包括荧光标记物和在本领域中常规用于MRI-CT成像的标记物。它们还包括酶标记物，例如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分例如生物素，其可通过结合至特定的关联(cognate)可检测部分例如经标记的抗生物素蛋白而被检测。

治疗剂可以是具有毒害癌症细胞、抑制癌症细胞生长，或者阻止或降低癌症细胞的分裂和/或转移的能力的分子，例如其包括但不限于：多花白树素(gelonin)、bouganin、皂草毒素蛋白(saporin)、篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A链、bryodin、白喉毒素(diphtheriatoxin)、局限曲菌素(restrictocin)、假单细胞外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)和它们的变异体。

治疗剂还可以是破坏DNA的分子，例如其包括但不限于：烯二炔类(例如刺孢霉素和esperamicin)以及非烯二炔类小分子试剂(例如博来霉素(bleomycin)、methidiumpropyl-EDTA-Fe(II))，以及包括但不限于：正定霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、远端霉素A(distamycin A)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素C(mitomycin C)，海鞘素(ecteinascidins)以及博来霉素/培洛霉素(pepleomycin)。

治疗剂还可以是破坏微管蛋白的试剂，例如包括但不限于：力索新(rhizoxin)/美登素(maytansine)、紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)和peloruside A。

另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码如上任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

在此用的术语“核酸分子”是指由天然碱基、糖和糖间(骨架)键连组成的核苷(nucleoside)或核苷酸(nucleotide)单体的序列。该术语也包括含有非天然发生的单体或其部分的修饰过的或取代过的序列。本发明的核酸分子可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并可包含天然碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。也可含修饰的碱基。这些修饰的碱基的例子包括含氮和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。

另一方面，本发明提供一种载体，其含有如上所述的核酸分子。

在此以其最通常的意思来使用术语“载体”并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其能够使所述核酸例如引入原核生物和/或真核生物细胞中，并且在合适的情况下，整合至基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。如在此所用的术语“质粒”通常涉及染色体外基因材料的构建体，通常是环状DNA双链，其可以独立于染色体DNA而进行复制。

另一方面，本发明提供一种重组细胞，其含有如上所述的载体。

术语“重组细胞”指的是可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明的术语“重组细胞”包含原核生物(例如，大肠杆菌)或真核生物细胞(例如，哺乳动物细胞，特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，如来自人、鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可以源自多个组织类型，并且包含初级细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝形式或两个或多个拷贝形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在重组细胞中表达。

可选地，在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞为真核细胞；可选地，在本发明的一些实施方案中，所述重组细胞为哺乳动物细胞，可选地，在本发明的一些实施方案中，所述重组细胞为HEK293细胞。

另一方面，本发明提供一种制备如上任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：

(a)培养如上所述的重组细胞；

(b)从步骤(a)的培养产物中回收所述人源抗体或其抗原结合片段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Western blot鉴定表达的EGFRvIII突变蛋白，M：蛋白分子量Marker；E2：微量纯化测试的蛋白表达样品；S1-S4：不同表达时间的培养基上清样品，依次是第三天、第四天、第五天、第六天。

图2为重组EGFRvIII突变蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果，M：蛋白分子量Marker，E1-E10：蛋白洗脱进程中是分管收集到的蛋白样品。

图3为野生型EGFR蛋白的SDS-PAGE分析结果，M：蛋白分子量Marker。

图4为抗EGFR人源全长抗体的非还原状态的SDS-PAGE分析结果，非还原状态呈现一条完整抗体条带，左：Marker，右：BTHG17-1全长抗体。

图5为抗EGFR人源全长抗体的还原状态的SDS-PAGE分析结果，还原状态呈现电泳抗体呈两条带，左：Marker，右：BTHG17-1全长抗体。

图6为抗EGFR人源全长抗体结合EGFRvIII和EGFR的敏感性测定结果，纵坐标：OD450值；横坐标：包被蛋白浓度(/ml)。

图7为抗EGFR人源全长抗体结合肿瘤细胞表面EGFR的流式细胞术检测结果，A：自左至右依次是A549、NCI1975和U87与标准EGFR抗体结合后，用抗鼠IgG-PE二抗染色的流式分析直方图，单独抗鼠IgG-PE二抗染色为对照；B：自左至右依次是A549、NCI1975和U87分别经BTHG17-1抗体或另一种同性质的BTHG17-2抗体染色后，抗人IgG-APC二抗染色的流式分析直方图，单独抗人IgG-APC二抗染色为对照。

图8为抗EGFR人源全长抗体的亲和力测定结果，曲线从上往下是：500nm，250nm，125nm，62.5nm，31.25nm，0nm。

图9为抗EGFR人源全长抗体的结合表位分析结果，Fortebio Octet分析，探头依次与BTHG17-1、EGFR蛋白和另外一个抗体克隆再结合情况，如图示纵向虚线右侧的折射线：自上至下依次为EGFR标准抗体、BTHG17-2和BTHG17-1折射图形线。

图10为基于BTHG17-1抗体构建的SCFV(EGFR)CART质粒结构，LTR：长末端重复序列，K：Kozak序列，L：人工信号肽，CD8：CD8-Hinge和CD8跨膜区，2A：2A多肽，IgG：IgG1-Fc；M：Marker。

图11为SCFV(EGFR)CART质粒转染293T细胞的GFP蛋白表达情况，左图为质粒转染293T细胞白光图像(200×)，右图为质粒转染293T细胞的荧光显微镜图，细胞转染率超过80％(200×)。

图12为稀释不同浓度的BTHG17-1抗体结合不同包被浓度EGFRvIII的ELISA测试数据。

图13为pcDNA3.1质粒载体的图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

制备抗原：EGFRvIII蛋白和EGFR蛋白

(1)制备EGFRvIII蛋白

在哺乳动物细胞平台进行EFGRvIII突变蛋白胞外区片段表达、纯化测试，EGFRvIII基因编码区缺失了野生型EFGR第2～7外显子区域，导致其蛋白(SEQ ID NO.3)较野生型EGFR蛋白缺少了267个氨基酸残基，胞外区的结构发生改变，使得EGFRvIII蛋白具有不依赖配体而自身持续磷酸化激活特性，促使下游信号通路持续激活。基于上述EGFRvIII蛋白的结构和活性特性，本实施例采用真核表达体系表达EGFRvIII蛋白，注重维护其结构特征，获得具有天然结构的突变蛋白，并以此作为抗原，后续用于获取对其具有特异性活性的抗体。EGFRvIII蛋白具体制备流程如下：

将密码子优化后的EGFRvIII基因序列(SEQ ID NO.2)构建至pcDNA3.1质粒载体(购自Invitrigen，见图13)上，将得到的EGFRvIII蛋白表达质粒转染HEK293细胞，收集培养基样品，进行蛋白分泌表达的Western blot分析，在理论分子量(425kDa)上方可见目的蛋白条带，蛋白表现为两条相邻条带(图1)。EGFRvIII蛋白表达质粒放大转染细胞，收细胞样品进行蛋白纯化，经SDS-PAGE分析，在理论分子量上方可见目的蛋白条带，约为72kDa(图2)。

(2)制备EGFR蛋白

采用人野生型EGFR蛋白的胞外区作为抗原时，其胞外区表达序列包含621氨基酸(SEQ ID NO.1中的第25-第645位)，在C-端添加His标签蛋白，N端添加信号肽(SEQ ID NO.1中的第1-第24位)，编码序列克隆入真核pcDNA3.1载体系统，表达宿主细胞为HEK293，收细胞样品进行蛋白纯化，作为抗原的EGFR蛋白理论计算分子量为69.8kDa，糖基化致使其在还原SDS-PAGE凝胶电泳中的实际迁移分子量，约为110kDa(图3)。

实施例2

噬菌体抗体库的建立和筛选：

(1)肺癌患者血液样本：110例确诊的不同分期胸部肿瘤患者，包括了主要的肺癌类型，其中肺癌102例，其中非小细胞肺腺癌54例、鳞癌28例，小细胞肺癌17例，大细胞肺癌3例；另入组8例乳腺癌。共计男性患者76名，女性患者34名。每位患者采集治疗前的外周静脉抗凝血液5ml，经红细胞裂解液处理(全血体积：红细胞裂解液体积为1:3)，得白细胞沉淀，Trizol裂解白细胞，冻存。所采集血样符合北京胸科医院伦理审批原则(审批编号：YJS-2019006)。

(2)噬菌体抗体库的建立：人白细胞裂解液提取总RNA，反转录后，以其为模板，用特异引物扩增可变区基因，PCR扩增获得重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL)，然后以VH和VL为模板，以19个氨基酸肽段RSSGGGGSGGGGGGSSRSS连接，经重叠PCR获得单链抗体(scFv)的基因序列，经酶切插入噬菌体载体，电转后获得一定容量的抗体库(本噬菌体抗体库库容≥10⁸)，加入辅助噬菌体过夜培养，上清液经PEG沉淀，用无菌PBS重悬噬菌体沉淀，完成噬菌体抗体库的构建。

(3)Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定：包被上述实施例1获得的EGFRvIII蛋白(抗原)，对噬菌体库进行筛选，采用”淘洗-扩增-富集”的循环方式，经2轮以上筛选得到阳性克隆，将ELISA检测的阳性克隆进行PCR，酶切分型后送测序，根据测序结果(SEQ ID NO.4)确定轻链和重链可变区氨基酸序列。后文实施例中，将具有该氨基酸序列的抗体命名为BTHG17-1-scFv抗体。获得的轻链和重链可变区序列通过IGBLAST软件分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，再进一步分析该抗体VH和VL特性；ABodyBuilder软件(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/abodybuilder/)在Kabat模型下进一步解析该抗体的VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)的3个CDR区位置。BTHG17-1-scFv抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列信息如下(SEQ ID NO.5，结构：VL-linker-VH)：

DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKAGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPITFGQGTRLEIKRSSGGGGSGGGGGGSSRSSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRSKWYNEYAVSVESRITINPDTFKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARLVGEGLLDYWGQGTLVTVSS。

下划线处的序列分别为CDR1、CDR2和CDR3，斜体为linker序列。

实施例3

针对EGFR的人源全长抗体的表达和纯化：

(1)以实施例2筛选获得的阳性phage菌液或质粒为模板，经扩增获得轻链和重链可变区基因，分别插入到包含抗体恒定区编码序列(轻链恒定区为人κ型轻链恒定区，如SEQID NO.15的第133-239位所示；重链恒定区为人IgG1恒定区，如SEQ ID NO.17的第141-470位所示)的pcDNA3.1载体，测序得到含有正确序列的人源全长抗体表达质粒；

BTHG17-1全长抗体的轻链(K链)氨基酸序列(斜体信号肽，波浪线为轻链可变区，下划线为轻链恒定区，氨基酸序列见SEQ ID NO.15，编码序列见SEQ ID NO.14)如下：

MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKAGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

BTHG17-1全长抗体的重链(IgG1)氨基酸序列(斜体信号肽，波浪线为重链可变区，下划线为重链恒定区，氨基酸见SEQ ID NO.17，编码序列见SEQ ID NO.16)如下：

MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEW LGKTYYRSKWYNEYAVSVESRITINPDTFKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARLVGEGLLDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

(2)提取上述人源全长抗体表达质粒进行HEK293瞬转表达鉴定，其过程如下：

于无血清CD培养基中传代HEK293细胞，将上述人源全长抗体表达质粒与转染试剂TF2混合后加入细胞中，转染后第1、3、5天添加293无血清加料液。摇瓶培养条件：5％CO₂，温度37℃，摇床转速175rpm；反应器培养条件：PH7.2，温度37℃，搅拌转数150rpm，溶氧40％，培养上清通过ProteinA亲和层析纯化抗体，得到针对EGFR和EGFRvIII的全人源全长抗体，命名为BTHG17-1全长抗体(或称BTHG17-1抗体)。紫外分光计测定显示蛋白表达浓度为0.76mg/ml，抗体纯度为98.5％；SDS-PAGE电泳结果显示，在非还原状态呈现一条完整抗体条带，分子量大于150kDa(图4)，还原状态有50kDa和25kDa，轻重链两条条带(图5)。

实验例1

ELISA测试BTHG17-1全长抗体结合EGFRvIII蛋白和EGFR蛋白的灵敏度和特异性

(1)将倍比稀释(1μg/ml-0.015625μg/ml)的BTHG17-1抗体，分别与三种包被浓度(0.002μg/ml、0.02μg/ml和0.2μg/ml)的EGFRvIII蛋白进行ELISA测试，结果显示该抗体用于检测包被的EGFRvIII蛋白时，可以有效检测浓度为0.002μg/ml的EGFRvIII蛋白(见图12)。

(2)进一步采用ELISA测定BTHG17-1全长抗体对野生型EGFR蛋白结合的鉴定试验：

包被1μg/ml的野生型EGFR蛋白(实施例1提供)以及EGFR vIII蛋白(实施例1提供)、HER2和PDL1蛋白(义翘神州)，分别检测不同浓度(浓度梯度分别为1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml)的BTHG17-1抗体对野生型EGFR蛋白、EGFR vIII蛋白、HER2和PDL1蛋白结合特异性和敏感性，结果显示，BTHG17-1抗体能够结合野生型EGFR蛋白和EGFRvⅢ蛋白，而不结合同一家族的HER2和PDL1蛋白，如图6所示，可以看出，本发明实施例的BTHG17-1抗体结合EGFR和EGFRvIII两种蛋白的敏感性接近，均为10ng/ml。

ELISA测定过程中的相关试剂信息如下：

使用的标准抗体：Cat:10001-MM08T，义翘神州公司；

HER2/ERBB2-Hi蛋白：Cat:10004-H08H，义翘神州公司；

PDL1-His蛋白：449-656S1-F6，ACRO Biosystems；

抗鼠IgG-PE二抗：购自Abcam，抗人IgG-APC二抗为Bioss产品；

包被液(BDOptEIACoatingBuffer，51-2713KC)：pH9.5的0.1M碳酸钠洗液(BDOptEIAWashBuffer，51-9003739)：20×浓缩洗液，用去离子水或者蒸馏水稀释成1×的工作液；

5％牛奶封闭液：5g牛奶加入100ml的1×PBS溶液中；

显色液A(BDOptEIASubstrateReagentA，51-2606KZ)：含有过氧化氢的缓冲液；显色液B(BDOptEIASubstrateReagentB，51-2607KZ)：含有3,3'，5,5'四甲基联苯胺(TMB)的有机溶剂。显色液A与显色液B按照1：1比例混匀后作为工作液；

终止液(BDOptEIAStopSolution，51-2608KZ)：1M硫酸。

实验例2

流式细胞术检测抗体与肿瘤细胞的结合

采用流式细胞术检测肺癌和神经胶质瘤细胞表面的EGFR表达，并验证BTHG17-1全长抗体与人肺腺癌细胞系A549、NCI1975和神经胶质瘤U87表达EGFR的结合情况。采用间接免疫荧光进行检测，流程如下：

在A549、NCI1975和U87细胞中加入抗体，包括EGFR标准抗体(义翘神州，Cat：10001-MM08T鼠源抗体)，BTHG17-1或另一种BTHG17-2抗体，随后加入荧光标记二抗染色，流式检测阳性率，在空白对照A549、NCI1975和U87细胞仅加入荧光二抗，进行流式细胞术检测。

流式细胞术的检测结果如图7所示，图7的A中，自左至右依次是A549、NCI1975和U87与标准EGFR抗体结合后，用抗鼠IgG-PE荧光二抗染色检测的直方图，对照为IgG-PE荧光二抗染色；图7的B中，自左至右依次是A549、NCI1975和U87分别经本BTHG17-1和另一抗体BTHG17-2两抗体染色后，抗人IgG-APC荧光二抗染色检测的直方图，对照以IgG-APC荧光二抗染色，结果显示，BTHG17-1抗体显示出对表达EGFR的肺癌A549、NCI1975和神经胶质瘤U87细胞具有优良的结合活性。

实验例3

抗体的亲和力以及表位分析

亲和力检测流程：Aminopropylsilane传感器(美国PALL公司)在平衡液中(0.1％BSA+0.02％Tween20的PBS溶液)预湿10分钟，将EGFRvIII蛋白用平衡液稀释为5μg/mL，加到避光96孔板第二列中，200μl/孔将BTHG17-1抗体从500nM起始，倍比稀释至31.3nM，并设0.0nM对照，加入避光96孔板的第四列中，200μl/孔，H4(列)为空白对照，加入200μL平衡液。将平衡液加入第一列与第三列中，200μL/孔。Fortebiooctet96仪器检测，将传感器在第一列中平衡60s获得基础平衡曲线，然后在第二列中进行抗体固化300s。在第三列中进行封闭10min，在第四列中结合抗体180s获得结合曲线，回到第一列中解离300s，获得解离曲线。FortebioOctet96分析软件对曲线进行拟合分析，获得亲和力数值。

亲和力检测结果：通过ForteBioOctet系统对抗体亲和力进行测定，获得BTHG17-1抗体对不同梯度浓度(0-500nM)EGFRvIII蛋白的结合和解离速率值，以不添加EGFRvIII蛋白的缓冲盐溶液作为对照。数据分析后，计算所获得BTHG17-1抗体的KD值为3.92×10^-8mol/L(图8)，其对野生型EGFR结合亲和力在相同水平，可见BTHG17-1抗体对EGFRvIII和EGFR两种蛋白都具有较高的亲和力。

BTHG17-1抗体与EGFR蛋白的结合位点分析：Fortebio Octet分析时，探头依次结合BTHG17-1、EGFR蛋白和另外一种EGFR抗体，另外一种EGFR抗体可以是BTHG17-1、EGFR标准抗体(义翘神州，Cat：10001-MM08T)或BTHG17-2抗体，结果显示，BTHG17-1抗体对EGFR标准抗体有明显再结合折射，而对BTHG17-1自身和BTHG17-2无再结合折射，显示BTHG17-1与BTHG17-2结合位点相同，这不同于标准抗体(义翘神州，Cat：10001-MM08T)的结合表位(图9)。为此，BTHG17-1与标准抗体具有表位不同的特点，预示BTHG17-1抗体可以与标准抗体联合，用于配对免疫检测。

实验例4

抗体在CAR-T细胞导向治疗中的应用

CAR是一种人工合成的嵌合抗原受体，以单个分子重新定向识别抗原，是一种用来修饰免疫细胞如T淋巴细胞的分子工程技术，其结构特点是胞外抗原结合部分(常利用单链抗体)与胞内CD3ζ链信号域融合，代表性的第二代CAR结构，融入了协同刺激分子，如在CD19-CAR-T细胞研究表明，CD137协同刺激分子优于CD28，表现出了延长修饰T细胞存活和促进记忆细胞形成作用。

可以利用本发明的人源的BTHG17-1-scFV抗体，构建连接有CD137分子胞内功能域的CAR结构，并融合CD3ζ链信号域，赋予细胞毒信号活性，该合成BTHG17-1-scFV-CAR融合蛋白，借助表达的BTHG17-1-scFV结构域靶向EGFR；在此基础上，还可以进一步共表达另一种单链抗体(PD-L1-ScFv)，所构建的双表达慢病毒载体质粒，通过2A肽序列连接两个表达基因，即BTHG17-1-scFV-CAR和PDL1-ScFv的同时表达，BTHG17-1-scFV-CAR和PDL1-ScFv-Fc借助CD8跨膜区，可共表达在细胞膜表面(图10)。该结构克隆入慢病毒表达载体GV401(吉凯公司)，载体质粒定名为SCFV(EGFR)CAR，经转染293T细胞，实验验证了BTHG17-1-scFV-CAR、PD-L1-ScFv和绿色荧光蛋白标签同时获得表达。具体转染过程为：(1)对数生长期的细胞制成细胞悬液，计数，接种于24-well培养板中(细胞数约为2×10⁴)，37℃、5％CO₂培养箱培养至细胞融合度达到约80％。(2)根据细胞转染预实验和Invitrogen lipofectamine 2000转染试剂使用说明书设计，加入适宜量的质粒和转染试剂。(3)4-6h后观察细胞状态，更换为新鲜的完全培养基。转染24-48h后观察质粒上荧光标记基因的表达情况，荧光率大于80％，拍完荧光后补加500μL正常培养基，待长满后收集细胞用于RNA提取或蛋白质检测。

验证试验通过PCR和对融合基因下游绿色荧光标签蛋白检测，分别在mRNA和蛋白水平评估目的蛋白表达，也即印证本发明抗体BTHG17-1-scFV在CAR结构中的有效表达。

蛋白水平表达的结果显示：质粒转染293T后，细胞内可观察到明显的强荧光，说明质粒转染正常，质粒荧光标记基因表达正常(图11)。

定量PCR检测实验步骤：

总RNA提取和反转录：(1)收取样品，Trizol裂解。收集转染293T细胞(6孔板80％细胞密度)，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mLTrizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移新的1.5mL EP管中；(2)每管加入200μL氯仿，用手上下颠倒EP管15s，室温静置10min。(3)4℃、12800rpm，离心15min。(4)吸取上层液体移新的1.5mLEP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min。(5)4℃、12800rpm离心12min后，弃上清。(6)加入1mL、75％乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀。(7)4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清。(8)4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，室温干燥。(9)待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水(加入体积视RNA沉淀量而定)至完全溶解，Nanodrop2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。使用Promega M-MLV试剂盒(M1701)进行反转录，获得cDNA。

Real-time PCR检测中目的基因(BTHG17-1-scFV编码基因)引物为：GAGGAGTACGATGTTTTGGAC和CTGTACTGAGACCCTGGTAAA。具体结果如下表2所示：

表2

说明：con：为293T细胞样品(对照组)；OE：为目的基因质粒转染293T后样品；2^-ΔΔCt法计算说明：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。2^-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平。

经Real time PCR检测，可以看出，293T细胞中，OE组CART表达丰度是CON组的1275008.456倍(p<0.05)，目的基因获得高效表达。荧光定量PCR结果显示：构建质粒在mRNA层面印证了目的蛋白的表达。

综上，本发明实施例通过采集110例胸部肿瘤(肺癌102例，乳腺癌8例)患者外周血，成功构建肺癌患者B细胞的单链抗体噬菌体库，抗体库库容≥10⁸，从中筛选获得本发明单克隆抗体BTHG17-1。经噬菌体展示后筛选的该阳性克隆，依据其序列构建的全长轻重链表达载体质粒，共转染HEK293表达，经亲和层析途径容易获得其纯化全抗体。借助抗原-抗体免疫反应，测定该抗体结合突变体EGFRvIII和野生性EGFR蛋白和检测EGFR的敏感性，并基于生物膜干涉技术测定了抗体的亲和力，采用流式细胞术检测了BTHG17-1对肿瘤细胞系EGFR蛋白的结合活性，验证了结合肺癌和神经胶质瘤细胞的活性。ELISA测定抗体结合抗原敏感性10ng/ml，亲和力在10^-8mol/L水平，所获得EGFR单抗，具有EGFR和EGFRvIII结合的双特异性以及较高亲和力，本发明为以EGFR为靶点的免疫导向治疗研究等领域提供一种新型的全人源抗体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京胸科医院

北京市结核病胸部肿瘤研究所

<120> EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 645

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser

645

<210> 2

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaattcgcca ccatgagacc ctctggaacc gcaggagcag cacttcttgc tctgcttgct 60

gctttgtgcc ctgctagcag agctctggaa gagaagaagg ggaactacgt ggtgaccgac 120

cacggatcct gtgtcagagc ctgtggagcc gattcttacg agatggagga ggacggagtc 180

aggaagtgca agaagtgcga ggggccttgt aggaaggtgt gcaacggaat cgggatcgga 240

gagttcaagg actccctctc catcaacgcc accaacatca agcacttcaa gaactgcacc 300

tccatctccg gcgacctcca catcctgccc gtggccttca ggggggattc cttcacccac 360

acccctcctt tggacccaca agagttggac atcctgaaga ccgtgaagga gatcaccggg 420

ttcctcctga ttcaggcctg gcctgagaac aggactgacc tccacgcctt tgagaacctc 480

gagatcatcc ggggcaggac aaagcagcac gggcagtttt ccttggccgt cgtctcactg 540

aacatcacaa gcctgggcct caggagtctc aaggagatca gcgacgggga tgtgatcatt 600

agcggcaaca agaacctgtg ctacgccaac acaattaact ggaagaagct gtttgggaca 660

agcgggcaga agacaaagat tattagcaac cggggggaaa acagctgcaa ggccacaggc 720

caggtctgcc acgccctctg cagccccgag ggctgctggg gccctgagcc acgcgattgt 780

gtctcatgtc ggaacgtcag ccggggccgc gaatgtgtgg ataaatgcaa cctgctggaa 840

ggggaaccac gggagtttgt ggagaacagt gagtgtattc agtgccaccc cgagtgcctg 900

ccacaggcca tgaatattac ttgcacaggg cgggggccag ataactgcat tcagtgcgcc 960

cactacattg acggcccaca ctgcgtgaag acatgccccg ccggcgtgat gggcgagaat 1020

aacacactgg tgtggaaata cgccgatgcc ggccacgtgt gccatctgtg ccatcccaac 1080

tgcacttatg gctgcactgg gcccggcctg gagggctgcc ccactaacgg gcccaaaatt 1140

ccccatcacc accatcacca tcatcacgat tacaaagatg atgacgacaa atgaaagctt 1200

<210> 3

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys

1 5 10 15

Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val

20 25 30

Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly

35 40 45

Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn

50 55 60

Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile

65 70 75 80

Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu

85 90 95

Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly

100 105 110

Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln

130 135 140

Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg

145 150 155 160

Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys

165 170 175

Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr

180 185 190

Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys

195 200 205

Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys

210 215 220

Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg

225 230 235 240

Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg

245 250 255

Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu

260 265 270

Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys

275 280 285

Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys

290 295 300

Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly

325 330 335

Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile

340 345 350

Pro Ser

<210> 4

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatattgtga tgacccagac tccagactcc ctggccgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataaaaa ttacttagct 120

tggtaccagc agaaagcagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtagt 300

ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaac gttctagtgg tggcggtggt 360

tcgggcggtg gtggaggtgg tagttctaga tcttcccagg tacagctgca gcagtcaggt 420

ccaggactgg tgaagccctc gcagaccctc tcactcacct gtgccatctc cggggacagt 480

gtctctagca acagtgcttc ttggaactgg atcaggcagt ccccatcgag aggccttgag 540

tggctgggaa agacatacta caggtccaag tggtataatg aatatgcagt gtctgtggag 600

agtcgaataa ccatcaaccc agacacattc aagaaccaat tctccctgca gctgaactct 660

gtgactcccg aggacacggc tgtgtattat tgtgcccgtt tagtaggaga aggcctcctt 720

gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctca 759

<210> 5

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Arg Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val

130 135 140

Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser

145 150 155 160

Val Ser Ser Asn Ser Ala Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser

165 170 175

Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr

180 185 190

Asn Glu Tyr Ala Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp

195 200 205

Thr Phe Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu

210 215 220

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Leu

225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Trp Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ala Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Phe Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgat 60

attgtgatga cccagactcc agactccctg gccgtgtctc tgggcgagag ggccaccatc 120

aactgcaagt ccagccagag tgttttatac agctccaaca ataaaaatta cttagcttgg 180

taccagcaga aagcaggaca gcctcctaag ctgctcattt actgggcatc tacccgggaa 240

tccggggtcc ctgaccgatt cagtggcagc gggtctggga cagatttcac tctcaccatc 300

agcagcctgc aggctgaaga tgtggcagtt tattactgtc agcaatatta tagtagtccg 360

atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa 720

<210> 15

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 16

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtcag 60

gtacagctgc agcagtcagg tccaggactg gtgaagccct cgcagaccct ctcactcacc 120

tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc aacagtgctt cttggaactg gatcaggcag 180

tccccatcga gaggccttga gtggctggga aagacatact acaggtccaa gtggtataat 240

gaatatgcag tgtctgtgga gagtcgaata accatcaacc cagacacatt caagaaccaa 300

ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg ctgtgtatta ttgtgcccgt 360

ttagtaggag aaggcctcct tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa taa 1413

<210> 17

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val

35 40 45

Ser Ser Asn Ser Ala Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Tyr Ala Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr

85 90 95

Phe Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

Claims

1.抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体或其抗原结合片段均具有如SEQ ID NO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及如SEQ IDNO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO.9所示的轻链可变区和SEQ IDNO.13所示的重链可变区。

3.根据权利要求2所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体的重链恒定区选自人IgG、人IgM、人IgE、人IgA或人IgD的重链恒定区；

优选地，所述人IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；

优选地，所述人IgA为人IgA1或人IgA2；

优选地，所述人源抗体的重链恒定区如SEQ ID NO.17的第141-470位所示；

优选地，所述人源抗体的轻链恒定区选自人κ型轻链或人λ型轻链的恒定区；

优选地，所述人源抗体的轻链恒定区如SEQ ID NO.15的第133-239位所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。

5.根据权利要求1-3任一项所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述EGFRvIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段在制备以EGFR为靶点治疗癌症的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述癌症为EGFR和/或EGFR突变体III表达呈阳性的癌症；

所述癌症选自胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、结肠癌、肝癌或膀胱癌；

优选地，所述胶质细胞瘤为神经胶质细胞瘤；

优选地，所述结肠癌指转移性结直肠癌；

优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

8.一种治疗癌症的药物，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

9.一种检测EGFR或EGFRvIII的试剂，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

10.一种表达嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有靶向EGFR的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及如SEQ ID NO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。

11.根据权利要求10所述的表达嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.9所示的轻链可变区和SEQ ID NO.13所示的重链可变区。

12.根据权利要求10或11所述的表达嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述细胞为T-细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、中性粒细胞或干细胞。

13.根据权利要求10或11所述的表达嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导功能域；

优选地，所述跨膜结构域选自如下蛋白分子中的至少一种的跨膜结构域：CD5、CD3ε、CD4、CD28、CD137、CD9、CD154、CD45、CD37、CD16、CD22、CD134、CD33和CD8；

优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；

优选地，所述共刺激信号传导功能域包含如下共刺激分子中的至少一种的细胞内结构域：OX40、CD134、CD5、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD154、CD79a、CD137、CD22、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD79b、CD28、ICOS、4-1BB和CD3ζ；

优选地，所述共刺激信号传导功能域包括4-1BB的胞内共刺激元件和CD3ζ的胞内结构域。

14.一种抗体偶联物，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

15.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。

16.一种载体，其特征在于，其含有权利要求15所述的核酸分子。

17.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求16所述的载体。

18.根据权利要求17所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为真核细胞；优选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞，优选地，所述重组细胞为HEK293。

19.一种制备权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，其包括：

(a)培养权利要求17或18所述的重组细胞；