CN111534458A - 无色杆菌tbc-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用 - Google Patents
无色杆菌tbc-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种无色杆菌TBC‑1及其在降解1,3,6,8‑四溴咔唑中的应用，本发明无色杆菌TBC‑1在20～50℃、pH值为5～9的条件黑暗振荡培养，在7d内即可使1,3,6,8‑四溴咔唑的降解效率达到80％。本发明所述无色杆菌TBC‑1可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中1,3,6,8‑四溴咔唑的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的1,3,6,8‑四溴咔唑，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株新型高效1,3,6,8-四溴咔唑降解菌--无色杆菌(Achromobactersp.)TBC-1，及其在微生物降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用。
(二)背景技术
1,3,6,8-四溴咔唑(1,3,6,8-TetrabroMocarbazole)，是卤代咔唑类化合物，分子式为C12H5Br4N。纯的1,3,6,8-四溴咔唑在常温下为白色或极淡的黄色粉末，容易产生皮肤刺激和严重的眼刺激，熔点为229℃。相对密度为2.405g/cm3。正常环境和温度下较为稳定，不溶于水，易溶于丙酮，乙腈，正己烷。
卤代咔唑是一类与多氯二苯并呋喃具相似结构的新型持久性有机污染物。自1984年在美国的布法罗河沉积物中首次发现卤代咔唑后，卤代咔唑已先后在北美的河流及湖泊沉积物、欧洲的土壤、河流沉积物以及海边沉积物中检出。到目前为止，环境中检测到的卤代咔唑已达20多种。环境中的卤代咔唑主要分布在沉积物以及土壤表层或相对较为浅层的地方。近年来在环境中不断检测出氯代咔唑和溴代咔唑，根据卤代咔唑毒理性质的初步研究发现，其具有持久污染性和生物积累性，与二恶英毒性类似。这类物质对生态系统与人类健康是否会造成影响已越来越受到关注。
生物修复技术近年来在环境领域中属热门的技术之一，其具有的优势也受到广泛地青睐，生物降解是引起有机污染物分解的最重要的环境过程之一。生物降解主要包括微生物降解和植物降解两大类。但相较于植物降解的高成本和长周期来说，微生物降解则具有生长速度快、种类繁多、易于培养等优点。化合物的生物降解依赖于微生物通过酶催化反应分解有机物，当微生物代谢时，一些有机物可以作为食物源提供能量和细胞生长所需的碳源。微生物对有机物的降解可大致分为多环芳烃(PAHs)、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃等。
大部分研究显示，微生物对咔唑的降解是通过侧面双加氧生成邻氨基苯甲酸，从而生成邻苯二酚，邻苯二酚再通过邻位或间位开环后进入三羧酸(TCA)循环。
本研究中从苏州某制药厂内多处采集土壤样品，经过多次的富集培养，最终筛选并纯化出一株1,3,6,8-四溴咔唑高效降解菌，通过对其进行菌种鉴定和降解特性的研究，发现该菌株可能对1,3,6,8-四溴咔唑具有较强的降解能力。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新型高效无色杆菌1,3,6,8-四溴咔唑降解菌TBC-1以解决水体土壤环境中残留的1,3,6,8-四溴咔唑的降解问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--无色杆菌(Achromobacter sp.)TBC-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年12月30日，保藏编号为CCTCC NO:M 20191125，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还涉及所述无色杆菌TBC-1在微生物降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用，具体的，所述应用是将无色杆菌TBC-1接种至含1,3,6,8-四溴咔唑的无机盐培养基中，在25～50℃、100～200rpm、黑暗条件下进行降解(优选培养7天)，降解产物主要为邻氨基苯甲酸和邻苯二酚，并进一步确定邻苯二酚是由邻氨基苯甲酸降解得到的，其次还包含少量的其他化合物，例如，2’-氨基联苯-2,3-二醇等。
进一步，所述降解在30℃、150rpm、黑暗条件下进行。
进一步，所述无机盐培养基组成为：NaCl 1.0g/L，K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，MgSO4 0.1g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为超纯水，pH5～9；所述微量元素溶液组成：MnSO4·H2O 0.13g/L，ZnCl2 0.23g/L，CuSO4·H2O 0.03g/L，CoCl2·6H2O0.42g/L，Na2MoO4·2H2O 0.15g/L，AlCl3·6H2O 0.05g/L，溶剂为超纯水。
进一步，所述无色杆菌TBC-1以含菌细胞悬液形式加入，所述含菌细胞悬液按如下方法制备：
(1)斜面培养：将无色杆菌TBC-1接种于斜面培养基，20～40℃培养2～3天(优选30℃培养3天)，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为超纯水，pH自然；
(2)扩大培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，在30℃、180r/min培养1d；取菌液以体积浓度0.5％的接种量接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至OD600为1.0-2.0(优选OD600为1.5)，在4℃离心机中以8000r/min离心6min，沉淀加入无机盐培养基洗涤两次，最后用同体积无机盐培养基重悬，获得含菌细胞悬液；LB液体培养基组成：酵母粉10g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，溶剂为去离子水，自然pH值。
进一步，所述含菌细胞悬液OD600为1.0-2.0，体积接种量为5％。
本发明还提供一种所述无色杆菌TBC-1在降解水体或土壤中1,3,6,8-四溴咔唑的应用。
本发明所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明无色杆菌TBC-1在20～50℃、pH值为5～9的条件黑暗振荡培养，在7d内即可使1,3,6,8-四溴咔唑的降解效率达到80％。
本发明所述无色杆菌TBC-1可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中1,3,6,8-四溴咔唑的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的1,3,6,8-四溴咔唑(30℃中性条件下，本发明所述无色杆菌TBC-1能够在7天内降解80％的1mg/L 1,3,6,8-四溴咔唑)，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
(四)附图说明
图1为本发明无色杆菌TBC-1的电镜图。
图2为1,3,6,8-四溴咔唑的标准曲线图。
图3为无色杆菌TBC-1在不同培养时间对1,3,6,8-四溴咔唑的降解曲线图。
图4为无色杆菌TBC-1在1,3,6,8-四溴咔唑浓度为1mg/L纯培养条件下的生长曲线图。
图5为温度对1,3,6,8-四溴咔唑降解效率的影响图。
图6为pH值对1,3,6,8-四溴咔唑降解效率的影响图。
图7为1,3,6,8-四溴咔唑初始浓度对降解效率的影响图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株TBC-1的筛选与鉴定
1)培养基
无机盐培养基的配制：NaCl 1.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 1.5g，MgSO4 0.1g，1ml微量元素溶液，超纯水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，pH值为7.5，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl20.23g，CuSO4·H2O 0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，AlCl3·6H2O 0.05g，用超纯水定容至1000ml。
富集培养液：在无机盐培养基中加入1,3,6,8-四溴咔唑，使得1,3,6,8-四溴咔唑的终浓度为1mg/L。
LB液体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，去离子水定容至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。
LB固体培养基的配制：酵母粉10.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20.0g，超纯水定容至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。
2)菌株分离纯化
污泥样品采自苏州某制药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养(30℃，180rpm)1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(30℃，180rpm)1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。
取最后一次培养所得的培养液1ml进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4)，取各个稀释后的培养液100μl涂布于含1mg/L1,3,6,8-四溴咔唑的无机盐固体培养基平板上，置于恒温培养箱中30℃培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含1mg/L1,3,6,8-四溴咔唑的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养(30℃，180rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中30℃培养3d，通过反相高效液相色谱法检测各富集培养液中1,3,6,8-四溴咔唑的残留量，最后筛选获得一株能高效降解1,3,6,8-四溴咔唑的菌株，记为菌株TBC-1。
反相高效液相色谱检测条件：流动相为乙腈，分析柱为Grace Alltima C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)反向柱，流速为1.5ml/min，进样量为20μl，柱温为25℃。
3)菌株TBC-1鉴定
将上述获得的菌株TBC-1进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株TBC-1的电镜照片如图1所示，主要生物学特征为：菌落无色半透明，呈不太光滑的圆形，表面湿润，向上凸起，边缘扩散，呈淡黄色，革兰氏染色呈阳性，氨苄青霉素、卡那霉素，庆大霉素、氯霉素、链霉素。该菌株最适宜的生长条件：pH值为7.0，温度30℃。
菌株TBC-1经16S rDNA序列分析(Genbank登陆号为KT716268)，核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
通过形态特征和分子生物学鉴定，将菌株TBC-1鉴定为Achromobacter属，因此命名为无色杆菌(Achromobacter sp.)TBC-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2019年12月30日，保藏编号为CCTCC NO:M 20191125。
实施例2：含菌细胞悬液的制备
(1)斜面培养：将无色杆菌TBC-1接种于斜面培养基，30℃培养2～3天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20.0g，超纯水1000ml，pH自然；
(2)扩大培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取单菌落接种至5mL LB液体试管中，放置在30℃摇床内180r/min培养1d，取0.5mL菌液接种至含100mL LB液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床内30℃摇床内180r/min生长至对数期(OD600约1.5)。将锥形瓶中的菌液全部转移至灭菌离心管中，在4℃离心机中以8000r/min离心6min。取出沉淀加入无机盐培养基洗涤两次，最后用同体积无机盐培养基重悬，获得含菌细胞悬液(测得其OD600约为1.5)；所述无机盐培养基组成同实施例1。
实施例3：对1,3,6,8-四溴咔唑的降解实验
1、1,3,6,8-四溴咔唑标准曲线
将1,3,6,8-四溴咔唑标准品用无菌水溶解，制成浓度为2.5mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L的1,3,6,8-四溴咔唑标准品，采用实施例1中反相液相色谱测试峰面积，以1,3,6,8-四溴咔唑浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。
2、温度对1,3,6,8-四溴咔唑降解的影响
取4个250ml锥形瓶，各加入100ml无机盐培养基(同实施例1)，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后加入终浓度1mg/L的1,3,6,8-四溴咔唑，再分别接种实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别于22℃，30℃，38℃，46℃，54℃、180rpm摇床黑暗培养，每小时定时取样采用反相高效液相色谱测定(测定条件同实施例1)1,3,6,8-四溴咔唑峰面积，根据1,3,6,8-四溴咔唑标准曲线获得残留量，进而获得降解率，结果见图5所示。
3、pH对1,3,6,8-四溴咔唑降解的影响
取6个250ml锥形瓶，各加入100ml不同pH(5，6，7，8，9)的无机盐培养基(同实施例1)，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后加入终浓度1mg/L的1,3,6,8-四溴咔唑，分别加入实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别于30℃，150rpm摇床黑暗培养，每小时定时取样采用反相高效液相色谱测定(测定条件同实施例1)1,3,6,8-四溴咔唑峰面积，根据1,3,6,8-四溴咔唑标准曲线获得残留量，进而获得降解率，结果见图6。
3、时间对1,3,6,8-四溴咔唑降解的影响
取3个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基(pH值为7.0，组成同实施例1)，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后，分别加入终浓度1mg/L的1,3,6,8-四溴咔唑，分别接种实施例2方法获得的含菌细胞悬液5mL，相应的设置3个不含该菌种的实验作为空白对照，然后一同置于摇床(30℃，180rpm)中黑暗振荡培养。在培养时间为0、1、2、3、4、5、6、7、8h时定时取样，采用紫外分光光度计来检测培养液中菌体在600nm处的吸光度值，绘制生长曲线，结果见图4所示。采用反相高效液相色谱测定(测定条件同实施例1)1,3,6,8-四溴咔唑峰面积，根据1,3,6,8-四溴咔唑标准曲线获得残留量，进而获得降解率，图3所示。
图4可以看出OD600从0.07增加到0.18，说明菌体生长良好。观察图3，可以发现，培养7d后，无色杆菌TBC-1对1mg/L的1,3,6,8-四溴咔唑的降解效率约为80％。
4、浓度对1,3,6,8-四溴咔唑降解的影响
取5个250ml锥形瓶，各加入100ml不同pH7的无机盐培养基(同实施例1)，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后加入不同终浓度(0.1、0.5、1、5、10mg/L)的1,3,6,8-四溴咔唑，分别接种实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，再分别于30℃，150rpm摇床黑暗培养，分别于4、6、8、12、16、20、24天时取样，采用反相高效液相色谱测定(测定条件同实施例1)1,3,6,8-四溴咔唑峰面积，根据1,3,6,8-四溴咔唑标准曲线获得残留量，进而获得降解率，结果见图7。
图7实验结果表明无色杆菌TBC-1对低浓度的1,3,6,8-四溴咔唑具有较好的降解能力，而且此菌种为新型1,3,6,8-四溴咔唑降解菌，因此，该菌对研究1,3,6,8-四溴咔唑的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中1,3,6,8-四溴咔唑的降解尤其是集中修复具有较大的积极意义。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 无色杆菌TBC-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> 无色杆菌(Achromobacter sp.)
<400> 1
cctggctcag attgaacgct agcgggatgc cttacacatg caagtcgaac ggcagcacgg 60
acttcggtct ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaatgt atcggaacgt gcctagtagc 120
gggggataac tacgcgaaag cgtagctaat accgcatacg ccctacgggg gaaagcaggg 180
gatcgtaaga ccttgcacta ttagagcggc cgatatcgga ttagctagtt ggtggggtaa 240
cggctcacca aggcgacgat ccgtagctgg tttgagagga cgaccagcca cactgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttggaca atgggggaaa 360
ccctgatcca gccatcccgc gtgtgcgatg aaggccttcg ggttgtaaag cacttttggc 420
aggaaagaaa cgttccgggt taataccccg ggaaactgac ggtacctgca gaataagcac 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta atcggaatta 540
ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttcgg aaagaaagat gtgaaatccc agagcttaac 600
tttggaactg catttttaac taccgagcta gagtgtgtca gagggaggtg gaattccgcg 660
tgtagcagtg aaatgcgtag atatgcggag gaacaccgat ggcgaaggca gcctcctggg 720
ataacactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tggggccttc gggccttggt agcgcagcta 840
acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac 900
ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga aaaaccttac 960
ctacccttga catgtctgga atgccgaaga gatttggtag tgctcgcaag agaaccggaa 1020
cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg aaagggcact ctaatgagac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttatgggt agggcttcac 1200
acgtcataca atggtcggga cagagggtcg ccaacccgcg agggggagcc aatcccagaa 1260
acccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt 1320
aatcgcggat cagcatgtcg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccatggga gtgggtttta ccagaagtag ttagcctaac cgcaaggagg gcgattacca 1440
cggtaggatt catgactggg gtgaagtcgt aacaa 1475
Claims (9)
1.无色杆菌(Achromobacter sp.)TBC-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年12月30日，保藏编号为CCTCC NO:M 20191125，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述无色杆菌TBC-1在微生物降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是将无色杆菌TBC-1接种至含1,3,6,8-四溴咔唑的无机盐培养基中，在25～50℃、100～200rpm、黑暗条件下进行降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在30℃、150rpm、黑暗条件下进行。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养基组成为：NaCl 1.0g/L，K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，MgSO4 0.1g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为超纯水，pH5～9；所述微量元素溶液组成：MnSO4·H2O 0.13g/L，ZnCl2 0.23g/L，CuSO4·H2O 0.03g/L，CoCl2·6H2O 0.42g/L，Na2MoO4·2H2O 0.15g/L，AlCl3·6H2O 0.05g/L，溶剂为超纯水。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无色杆菌TBC-1以含菌细胞悬液形式加入，所述含菌细胞悬液按如下方法制备：
(1)斜面培养：将无色杆菌TBC-1接种于斜面培养基，20～40℃培养2～3天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为超纯水；
(2)扩大培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，在30℃、180r/min培养1d；取菌液以体积浓度0.5％的接种量接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至OD600为1.0-2.0，离心，沉淀用无机盐培养基重悬，获得含菌细胞悬液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述含菌细胞悬液OD600为1.0-2.0。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述含菌细胞悬液体积接种量为5％。
9.一种权利要求1所述无色杆菌TBC-1在降解水体或土壤中1,3,6,8-四溴咔唑的应用。
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