CN111529558A - 一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用 - Google Patents

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CN111529558A CN202010433051.9A CN202010433051A CN111529558A CN 111529558 A CN111529558 A CN 111529558A CN 202010433051 A CN202010433051 A CN 202010433051A CN 111529558 A CN111529558 A CN 111529558A
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鲁曼霞
刘向前
杨阳
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Hunan University of Chinese Medicine
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Abstract

本发明公开了一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，所述细柱五加叶总提物的制备过程为：将细柱五加叶置于多功能提取罐，以水或甲醇作为溶剂，在20～80℃提取1～3次，合并后减压回收溶剂后即得总提物。本发明创新的发现，细柱五加叶总提物具有显著的降血糖活性，基于此，本发明提供了一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的全新用途，在制备成防治糖尿病的药物方面具有广阔的应用前景。

Description

一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用
技术领域
本发明属于药物应用领域，具体涉及一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用。
背景技术
目前，糖尿病是一种严重威胁人类健康的内分泌代谢性疾病，发病率呈逐年上升趋势。已成为全世界许多国家的常见病和多发病，其死亡率已居肿瘤、心血管之后的第三位。我国糖尿病患者数量居全球首位，而其中约95％为II型糖尿病患者。II型糖尿病为非胰岛素依赖性糖尿病，其病因及发病机理复杂，胰岛β细胞凋亡和胰岛素抵抗(IR)是II型糖尿病的研究核心。胰岛β细胞凋亡不仅是II型糖尿病发病的直接原因，同时也在II型糖尿病发生、发展中起了重要作用。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)参与免疫调控介导炎症和多种生理病理过程的基因转录。近年来研究显示，NF-κB与糖尿病及肥胖密切相关。国内外研究表明炎症也参与了胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能损伤，进而导致糖尿病的发生。炎症细胞因子白细胞介素IL-1β是导致I型和II型糖尿病胰岛β细胞凋亡的关键细胞因子。IL-1β作用于胰岛β细胞，不仅对胰岛素的合成和分泌产生影响，还可以通过诱导细胞内一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达增加，生成大量的NO造成胰岛β细胞的凋亡。IL-1β亦可通过激活NF-κB而上调β细胞跨膜蛋白Fas表达，而后激活pro-caspase-8，使其裂解产生有活性的caspase-8，进而激活caspase-3，最终引起胰岛β细胞凋亡。同时氧化应激可通过NF-κB-iNOS-NO信号通路诱导胰岛β细胞凋亡。氧化损伤主要由活性氧物质(reactive oxygenspecies,ROS)所致，在氧化损伤诱导β细胞凋亡的多种途径中，NF-κB的活化、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的激活已成为关注重点。
细柱五加具有抗炎、抗排异、提高免疫力、促进核酸形成、抗疲劳等作用。细柱五加叶研究较少，目前并没有发现其用于降血糖方面的任何相关报道。
发明内容
本发明创新的发现细柱五加叶总提物具有显著的降糖活性。基于此，本发明的目的在于提供了一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的全新用途。
为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，所述细柱五加叶总提物的制备过程为：将细柱五加叶置于多功能提取罐，以水或甲醇作为溶剂，在20～80℃提取1～3次，合并后减压回收溶剂后即得总提物。
作为优选，所述细柱五加叶总提物在制备防治糖尿病药物中的应用。
所述防治糖尿病药物为能够抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和PTP1B的活性的药物。
所述防治糖尿病药物为能够在葡萄糖刺激下促进胰岛素分泌的药物。
所述防治糖尿病药物为能够以浓度依赖的方式部分恢复细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的细胞活力的药物。
所述防治糖尿病药物为能够以浓度依赖性的方式降低细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的Caspase-3活性的药物。
所述防治糖尿病药物为能够以浓度依赖性的方式下调经细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的NO水平的药物。
所述防治糖尿病药物为能够以浓度依赖性的方式下调经细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的ROS水平的药物。
作为优选，所述防治糖尿病药物中，细柱五加叶总提物的质量百分含量为0.1～100％。
作为优选，所述防治糖尿病药物还包括药学上可接受的辅料或载体。
本发明所述的应用，可以和现有药学上可接受的辅料或载体联合，制得药学上可接受的任意剂型。
作为优选，所述防治糖尿病药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、口服液或注射剂。
有益效果：
(1)本发明的细柱五加叶总提物抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和PTP1B效果显著。
(2)本发明的细柱五加叶总提物在葡萄糖刺激下能够有效促进胰岛素分泌。
(3)本发明的细柱五加叶总提物能够以浓度依赖的方式部分恢复细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的细胞活力，并且可以将活力恢复到未被细胞因子处理组水平。
(4)本发明的细柱五加叶总提物能够以浓度依赖性的方式下调经细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的NO水平。
(5)本发明的细柱五加叶总提物能够以浓度依赖性的方式降低细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的Caspase-3活性。
(6)本发明的细柱五加叶总提物能够以浓度依赖性的方式下调经细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的ROS水平。
综上所述，本发明的细柱五加叶总提物具有显著的降血糖活性，在制备成防治糖尿病的药物方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中细柱五加叶总提物(甲醇提取物)对RIN-m5F细胞活性的影响结果图。
图2为实施例3中细柱五加叶总提物(水提物WA和甲醇提取物ME)对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响结果图；在细柱五加叶总提物存在下，将RIN-m5F细胞在基础(4mM)或刺激(20mM)葡萄糖浓度下培养；*P＜0.05，相对于载体处理的对照；条形表示SEM(n＝3)。
图3为实施例4中细柱五加叶总提物(甲醇提取物)对细胞因子诱导的细胞死亡的影响结果图；其中－表示未处理，+表示已处理，*与空白处理的对照相比，P<0.05；与细胞因子处理组相比，##P<0.01；条形表示SEM(n＝3)。
图4为实施例5中细柱五加叶总提物(甲醇提取物)对细胞因子诱导的RIN-m5F细胞中产生NO的影响结果图；其中－表示未处理，+表示已处理，*与空白处理的对照相比，P<0.05；与细胞因子处理组相比，##P<0.01；条形表示SEM(n＝3)。
图5为实施例6中细柱五加叶总提物(甲醇提取物)对细胞因子诱导的RIN-m5F细胞中的Caspase-3活性的影响结果图；其中－表示未处理，+表示已处理，*与空白处理的对照相比，P<0.05；与细胞因子处理组相比，##P<0.01；条形表示SEM(n＝3)。
图6为实施例7中细柱五加叶总提物(甲醇提取物)对细胞因子诱导的RIN-m5F细胞中的ROS水平的影响结果图；其中－表示未处理，+表示已处理，*与空白处理的对照相比，P<0.05；与细胞因子处理组相比，##P<0.01；条形表示SEM(n＝3)。
具体实施方式
细柱五加叶运用水或醇(甲醇和/或乙醇)提取，浓缩得到细柱五加叶总提物浸膏，其具体制备过程为：将细柱五加叶置于多功能提取罐(本领域常规提取设备均可)，分别以水、甲醇作为溶剂，在30～80℃提取1～3次，合并后减压回收溶剂后得总提物(水提物或甲醇提取物)。
对总提物运用高效液相色谱同时检测方法，采用Phe-nomenex Columbus C18110A色谱柱(250mm×4.60mm，5.0μm)；柱温30℃；以乙腈-0.2％磷酸水为流动相，梯度洗脱：0～5min，45％A；5～14min，45％～50％A；14～28min，50％～60％A；28～40min，60％A；检测波长210nm；流速1m L/min，可同时测定。经检测，总提物包含impressic acid、acankoreanogein、acantrifoside A、acankoreoside D、acankoreoside B、3-O-β-D-glucopyranosyl 3α,11α-dihydroxylup-20(29)-en-28-oic acid、3α,11α,23-trihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid和3α,11α-dihydroxy-23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid，其总质量百分比不低于总提物的5～10％。
实施例1
α-葡萄糖苷酶抑制试验：阿卡波糖用作阳性对照(区别仅在于用阿卡波糖替换总提物)。
将20μLα-葡萄糖苷酶(0.25U)溶液和60μL总提物充分混合后，在37℃下温育18min，然后添加50μL对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液(5mM)，将混合物在37℃下进一步温育25min，加入120μL 0.1M Na2CO3终止反应。并在酶标仪405nm处测量吸光度，其结果如表1所示。
α-淀粉酶抑制试验：阿卡波糖用作阳性对照(区别仅在于用阿卡波糖替换总提物)。
将125μL总提物与125μLα-淀粉酶(3U/mL)在37℃下温育10min。再将125μL 2％淀粉溶液添加到试管中，并进一步温育30min。添加250μL48 mM二硝基水杨酸试剂来终止反应，并立即将其沸水浴15min。冷却至室温，蒸馏水稀释，并在540nm处测量吸光度，其结果如表1所示。
PTP1B抑制试验：熊果酸用作阳性对照(区别仅在于用熊果酸替换总提物)。
向微量滴定板(最终体积：100μL)中的96个孔中的每一个中加入10μL总提物和PTP1B(2.5ng/μL)，加入含50mM柠檬酸盐(pH 6.0)，0.1M NaCl，1mL的缓冲液亚甲基二胺四乙酸和2μL 100mM二硫苏糖醇。然后将样品在室温下孵育1h，并在540nm下测量吸光度，其结果如表1所示。
根据酶抑制活性的半数最大抑制浓度(IC50)值对结果进行比较。如表1所示，细柱五加叶总提物(水提物WA)对α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值为138.5±1.21μg/mL，其抑制活性强于阳性对照阿卡波糖(IC50432.27±0.55μg/mL)；对α-淀粉酶的抑制活性(IC50914.9±0.35μg/mL)与阿卡波糖(IC50854.43±0.81μg/mL)相近；对PTP1B的抑制活性，IC50值为106.6±0.33μg/mL，低于阳性对照熊果酸(IC50为11.41±0.27μg/mL)。细柱五加叶总提物(甲醇提取物ME)对α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值为77.19±0.19μg/mL，其抑制活性强于阳性对照阿卡波糖(IC50432.27±0.55μg/mL)；对α-淀粉酶的抑制活性(IC50134.10±0.25μg/mL)高于阿卡波糖(IC50854.43±0.81μg/mL)；对PTP1B的抑制活性，与阳性对照熊果酸相近。
表1细柱五加叶总提物对α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶和PTP1B抑制活性
Figure BDA0002501241440000051
由抑制曲线计算出50％抑制浓度(μg/mL)的数据，并表示为平均值±SEM(n＝3)。1,2在每个测定中用作阳性对照。与分析中的阳性对照相比，*P<0.05。WA为水提取物，ME为甲醇提取物。
实施例2
以含有10％牛血清白蛋白和1％的抗真菌抗生素的RPMI 1640为培养基培养大鼠胰岛β细胞瘤细胞(RIN-m5F)，细胞毒活性测定采用MTT法，将处在对数生长期的RIN-m5F细胞，调节其细胞密度为2×105个/孔，接种于48孔板中，将RIN-m5F细胞用不同浓度细柱五加叶甲醇提取物(25、50和100μg/mL)处理24小时，每孔加入300μL MTT溶液(0.5mg/mL)，继续培养4h，随后每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光度。细柱五加叶甲醇提取物对RIN-m5F细胞活性的影响如图1所示，Vehicle为空白对照，经不同浓度细柱五加叶甲醇提取物(25、50和100μg/mL)处理的所有样品细胞存活率均高于90％，未显示细胞毒性。细柱五加叶总提物(水提取物WA)同样无细胞毒性。
实施例3
葡萄糖刺激下的胰岛素分泌试验(GSIS)，以格列本脲(Gly)为阳性对照，收集对数期的RIN-m5F细胞以2×105/孔的浓度接种在48孔板中。然后在37℃下将孔用Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRB；5mM KCl，115mM NaCl；24mM NaHCO3，2.5mM CaCl2，25mM HEPES，1g/LBSA；pH 7.4)洗涤3次并预温育1h。加入葡萄糖培养基(RPMI-1640葡萄糖浓度4mM或葡萄糖浓度20mM)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h后，分组添加不同浓度的细柱五加叶总提取物(25、50和100μg/mL)，然后将细胞孵育12h。从每个孔中取出上清液并离心(在4℃以2000rpm离心5min)。然后用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(ALPCO Co，塞勒姆，新罕布什尔州，美国)测定胰岛素浓度。
如图2所示，在葡萄糖激发下，浓度为25、50、100μg/mL细柱五加叶总提物(水提物WA和甲醇提取物ME)对胰岛素释放明显高于空白对照(Vehicle)。
实施例4
组合细胞因子(Cytokines)IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡，将对数生长期的RIN-m5F细胞以2×105/孔的浓度接种到48孔板中。加入组合的细胞因子(重组人IL-1β10ng/mL和大鼠IFN-γ100ng/mL，R&D Systems，麦金利，MN，美国)以诱导RIN-m5F细胞死亡，然后用不同浓度的细柱五加叶总提取物(25、50和100μg/mL)处理24h。通过MTT测定法测量细胞因子诱导的细胞凋亡。添加300μLMTT溶液(0.5mg/mL)，孵育细胞4小时后，过滤上清液，并将甲臢晶体溶解在200μL的DMSO中。均匀摇动孵育10分钟，然后使用酶标仪(ThermoScientific TMMultiskan TMFC，美国)在570nm下测量吸光度。使用GraphPad Prism版本7.01(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)计算IC50值。
如图3所示，与空白组相比，经细胞因子处理的RIN-m5F细胞导致细胞活力显著降低至56.91±1.73％。在细柱五加叶甲醇提取物(ME Extract)浓度为100μg/mL样品处理下，细胞活力恢复至97.34±1.28％且高于阳性对照物重组L-NAME(人胰岛素N-硝基-L-精氨酸甲酯)(100μg/mL浓度下将细胞活力恢复至92.53±1.85％)。这些结果表明，细柱五加叶甲醇提取物样品能以浓度依赖的方式部分恢复细胞因子处理的RIN-m5F细胞中的细胞活力，并且可以将活力恢复到未被细胞因子处理组水平。
实施例5
通过测量全细胞提取物和细胞培养基中亚硝酸盐的浓度来确定NO水平。将对数生长期的RIN-m5F细胞制成细胞悬液，向孔板中加入100μL细胞悬液，以2×105/孔的浓度接种到48孔板中，37℃下于5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h。将孔板取出，将细柱五加叶总提取物浓度样品母液与无血清培养基混匀终浓度为25、50和100μg/mL培养液，放入培养箱中培养1h。然后加入IL-1β(10ng/mL)和IFN-γ(100ng/mL)继续孵育24h后，取出96孔板，吸取每孔内100μL的细胞上清液在黑暗中于室温与100μL Griess试剂混合10分钟。亚硝酸钠用于生成标准曲线。测量样品在520nm的光密度值。根据标准曲线回归方程和实验组计算出相应的NO含量。结果表示为NO与蛋白质的比率，表示为每克蛋白质的微摩尔NO。
如图4所示，与空白组相比，细胞因子诱导组中NO的产生显著增加至63.34±1.66％(P＜0.01)。但浓度为100μg/mL细柱五加叶甲醇提取物样品处理组，NO生成水平降至37.65±1.25％。它显示出比同浓度下阳性对照物重组人胰岛素N-硝基-L-精氨酸甲酯(39.85±1.33％)更好的抑制的NO产生效果。并且呈现出浓度依赖性的方式降低细胞因子处理的RIN-m5F细胞中的NO产生。
实施例6
将对数生长期的RIN-m5F细胞以2×105/孔的浓度接种到48孔板中。37℃下于5％CO2饱和湿度培养箱中培养。24h后弃旧培养液。分组处理，对照组加入培养液；实验组加入细柱五加叶总提取物浓度为25、50和100μg/mL培养液，继续孵育1h。然后加入IL-1β(10ng/mL)和IFN-γ(100ng/mL)继续孵育24h。胰蛋白酶消化细胞并收集细胞。并离心(在4℃以2000rpm离心5分钟)弃上清，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤，按每100万细胞加入50μL裂解液的比例加入裂解液，冰浴裂解15min。4℃16000g离心15min,并将上清转移至冰浴预冷的离心管中。再将Caspase-3比色测定试剂盒(Abcam Biotech，剑桥，MA，美国)用于RIN-m5F细胞裂解液(6孔板中每孔2×105)。基于发色团对硝基苯胺(p-NA)的分光光度法检测，从标记的底物DEVD-pNA上切割下来，然后可以通过微量滴定板读数器在405nm处定量p-NA的发光。
如图5所示，与用细胞因子处理过的细胞相比，在用细胞因子和细柱五加叶甲醇提取物样品同时处理过的RIN-m5F细胞中，Caspase-3活性明显降低(P<0.01)。并且呈现出浓度依赖性的方式降低细胞因子处理的RIN-m5F细胞中的Caspase-3活性。细柱五加叶甲醇提取物样品在浓度为100μg/mL时，细胞因子处理的RIN-m5F细胞中的Caspase-3活性明显低于阳性对照物重组人胰岛素N-硝基-L-精氨酸甲酯处理组。这些结果表明，细柱五加叶甲醇提取物样品通过限制caspase-3的活性来抑制细胞因子诱导的RIN-m5F细胞凋亡。
实施例7
将对数生长期的RIN-m5F细胞以2×105/孔的浓度接种到48孔板中。37℃下于5％CO2饱和湿度培养箱中培养。24h后弃旧培养液。分组处理，对照组加入培养液；实验组加入细柱五加叶总提物浓度为25、50和100μg/mL培养液，继续孵育1h。加入IL-1β(10ng/mL)和IFN-γ(100ng/mL)继续孵育24h。然后取出孔板，吸弃培养基，用无血清培养清洗孔底3次；向每孔内加500μL浓度为10μΜ的氧化敏感性探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，将24孔板放入37℃在FACS cantm流式细胞仪(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)中孵育20分钟。使探针和细胞充分接触，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；用流式细胞仪检测20000个细胞，然后通过Flow-Jo 7.6软件(Cell bio.，Lon.，UK)检查细胞内ROS的水平。
如图6所示，使用氧化敏感探针DCFH-DA分析细胞内ROS。分析暴露于细胞因子的RIN-m5F细胞显示ROS水平显著增加(60.01％)。细柱五加叶甲醇提取物样品在25、50和100μg/mL的浓度下，呈现浓度依赖性地将ROS的水平分别降低至54.15％，50.67％和46.68％。但是相比于阳性对照物抗坏血酸(浓度8μg/mL)时，细柱五加叶甲醇提取物样品(浓度100μg/mL)下调ROS的水平能力稍弱。
实施例8
(1)用高糖高脂肪饲料喂养6周大的成年雄性Sprague-Dawly(SD)大鼠(190-210克)3周，连续三天空腹腹膜内注射溶解于0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH4.0)中的STZ(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)进行单次处理，剂量为80mg/kg。继续喂养4周，从尾巴的侧静脉采血，并通过血糖仪(ACCU-
Figure BDA0002501241440000091
Advantage，Roche Diagnostics，曼海姆，德国)测量血糖，空腹血糖>220mg/dL的动物被认为患有糖尿病。
(2)分组及给药：雄性Sprague-Dawly(SD)大鼠(190-210克)每个笼子中将三只动物饲养在层流柜中，该柜具有12h的明/暗周期(06︰00-18︰00h)和温度(23.0±1℃)控制。每天评估食物和水的摄入量，每周测量体重(BW)。适应一周后，造模，选取造模成功的大鼠，根据体重分层随机分为(N)正常的非糖尿病组；(C)对照组，II型糖尿病组；(Gua)番石榴组，500mg/kg，阳性组；(ME 4)，细柱五加叶甲醇提取物4mg/kg；(ME 20)，细柱五加叶甲醇提取物20mg/kg；(ME 100)，细柱五加叶甲醇提取物100mg/kg，每组10只大鼠，各组大鼠每天灌胃给予相应药物。(N)正常的非糖尿病组10只，给予等量蒸馏水。各组大鼠给药体积均为10mL/kg大鼠体重，连续给药4周。
(3)血糖检测：利用血糖仪动态监测各组大鼠于不同给药时间时的空腹和随机血糖，分别于首次给药、连续给药1周、2周、3周、4周后，于给药前和给药后2小时，测定血糖水平。
(4)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)：给药4周后，各组大鼠禁食不禁水8小时，按照体重以2g/kg剂量给大鼠灌胃葡萄糖溶液，在0h、0.5h、1h、1.5h、2h检测大鼠血糖值，并计算曲线下面积(AUC)。
(5)胰岛素，血红蛋白，糖化血红蛋白(HbA1c)和C肽的测定：各组大鼠于末次给药后，禁食不禁水12h，麻醉大鼠，摘取眼球取血。将全血置于含肝素钠的离心管内混合均匀，按照试剂盒说明使用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(ALPCOCo)测定血浆胰岛素水平。使用血红蛋白比色检测试剂盒(Arbor化验，美国密歇根州安阿伯市)检测血红蛋白水平。血浆HbA1c(糖化血红蛋白A1c)水平使用大鼠糖化血红蛋白A1c ELISA试剂盒(Cusabio Biotech Co.，Ltd.，WH，HB，中国)测定。使用大鼠C肽ELISA试剂盒(ALPCO Co)测定血清C肽水平。
测试结果：
(1)体重，食物摄入量和食物利用率
表1显示了每日口服各种浓度的细柱五加叶甲醇提取物达4周后，正常和糖尿病大鼠的体重(BW)，食物摄入和食物效率比(FER)的变化。与非糖尿病组相比，所有糖尿病组均具有统计学意义(P<0.05)。II型糖尿病对照组的体重下降最多，并且食物摄入量最低。在糖尿病组中，高剂量组ME 100的FER高于II型糖尿病对照组和阳性对照组。且呈现浓度依赖性增加趋势。
表1体重、食物摄入量和食物利用率变化表
Figure BDA0002501241440000101
注：N：正常，非糖尿病群；C：对照组，II型糖尿病组；Gua：番石榴，500mg/kg，用作阳性对照；ME 4：细柱五加叶甲醇提取物4mg/kg；ME 20：细柱五加叶甲醇提取物20mg/kg；ME100：细柱五加叶甲醇提取物100mg/kg。数据表示为平均值±SEM(n＝10)。同一列中具有不同上标的a-i值在P<0.05时显着。1体重增加/食物摄入量。
(2)空腹血糖水平测定
表2显示了4周期间的空腹血糖水平。注射STZ后，糖尿病组之间空腹血糖水平没有显着变化。给药3周后，阳性对照组的血糖水平显著低于II糖尿病对照组(P<0.05)。ME 100组的血糖水平低于阳性对照组。但是，ME 100组的血糖水平明显高于正常组(P<0.05)。呈现给药量依赖型增加趋势，其最优剂量可作为进一步研究。
表2空腹血糖水平测定结果
Figure BDA0002501241440000111
注：N：正常，非糖尿病群；C：对照组，II型糖尿病组；Gua：番石榴，500mg/kg，用作阳性对照；ME 4：细柱五加叶甲醇提取物4mg/kg；ME 20：细柱五加叶甲醇提取物20mg/kg；ME100：细柱五加叶甲醇提取物100mg/kg。数据表示为平均值±SEM(n＝10)。同一列中具有不同上标的a-i值在P<0.05时显着。
(3)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果：
表3显示了口服葡萄糖后II型糖尿病大鼠的正常组和实验组的血糖水平。正常组的血糖水平在葡萄糖负荷后1h上升至峰值，并在2h时降低至接近正常水平。在糖尿病对照组中，血糖浓度在1h后达到峰值，并在接下来的1h内保持较高水平。即使阳性对照组的血糖水平在1h后下降，但在2h后仍未接近正常水平。ME 100组，与1h相比，在2h时血糖浓度显着下降到0h水平(P<0.05)。但相比于正常组还未下降至正常水平。
表3口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果
Figure BDA0002501241440000121
注：N：正常，非糖尿病群；C：对照组，II型糖尿病组；Gua：番石榴，500mg/kg，用作阳性对照；ME 4：细柱五加叶甲醇提取物4mg/kg；ME 20：细柱五加叶甲醇提取物20mg/kg；ME100：细柱五加叶甲醇提取物100mg/kg。数据表示为平均值±SEM(n＝10)。
(4)血浆中胰岛素，血红蛋白，HbA1c和血清C-peptide水平检测结果：
表4显示了正常和实验组在II型糖尿病大鼠中的血浆胰岛素、血红蛋白、HbA1c和血清C肽水平。与正常组相比，在II型糖尿病组中血红蛋白和血浆中HbA1c显着升高，而血浆胰岛素、C-peptide降低(P<0.05)。ME 100组与阳性对照组相比，血浆胰岛素、血红蛋白、HbA1c水平相近。
表4血浆中胰岛素，血红蛋白，HbA1c和血清C-peptide水平检测结果
Figure BDA0002501241440000131
注：N：正常，非糖尿病群；C：对照组，II型糖尿病组；Gua：番石榴，500mg/kg，用作阳性对照；ME 4：细柱五加叶甲醇提取物4mg/kg；ME 20：细柱五加叶甲醇提取物20mg/kg；ME100：细柱五加叶甲醇提取物100mg/kg。数据表示为平均值±SEM(n＝10)。
由以上实施例可以看出，细柱五加叶总提物(水提物WA和甲醇提取物ME)具有明显的降血糖活性，在制备成防治糖尿病的药物方面具有广阔的应用前景。

Claims (9)

1.一种细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于，所述细柱五加叶总提物的制备过程为：将细柱五加叶置于多功能提取罐，以水或甲醇作为溶剂，在20～80℃提取1～3次，合并后减压回收溶剂后即得总提物。
2.根据权利要求1所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述细柱五加叶总提物在制备防治糖尿病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物为能够抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和PTP1B的活性的药物。
4.根据权利要求2所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物为能够在葡萄糖刺激下促进胰岛素分泌的药物。
5.根据权利要求2所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物为能够以浓度依赖的方式部分恢复细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的细胞活力和以浓度依赖性的方式降低细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的Caspase-3活性的药物。
6.根据权利要求2所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物为能够以浓度依赖性的方式下调经细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导RIN-m5F细胞凋亡处理的RIN-m5F细胞中的NO水平和ROS水平的药物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物中，细柱五加叶总提物的质量百分含量为0.1～100％。
8.根据权利要求1-6任一项所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物还包括药学上可接受的辅料或载体。
9.根据权利要求1-6任一项所述的细柱五加叶总提物在制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述防治糖尿病药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、口服液或注射剂。
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