CN111517997A - 一种乙基硫酸酯人工抗原、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙基硫酸酯人工抗原、制备方法及应用，本发明以2‑氨基乙醇硫酸氢酯为原料制备乙基硫酸酯人工抗原，在氨基上引入2‑(4‑(溴甲基)苯基)乙酸连接臂，制备得到乙基硫酸酯半抗原，该半抗原与N‑羟基琥珀酰亚胺及N,N‑环己基碳二酰亚胺反应得到活性酯，该活性酯与蛋白发生偶联反应得到乙基硫酸酯人工抗原。本发明只需要一步就能得到半抗原，工艺简洁、原料来源不受限，而且还保留了ETS的特征结构，具有很好的特异性；本发明引入的连接臂能更大限度的发挥抗原的免疫原性，增强免疫效果，刺激动物产生抗体，可以有效弥补ETS因为本身结构过于简单而难以刺激机体产生抗体的缺点。

Description

一种乙基硫酸酯人工抗原、制备方法及应用

技术领域

本发明具体涉及一种乙基硫酸酯人工抗原、制备方法及应用。

背景技术

乙醇，俗称酒精，是世界性的滥用物质之一。统计表明，驾驶员喝酒后驾车，发生事故的可能性是平时的15倍，30％的道路交通事故是由酒后开车、醉酒驾车引起的。驾驶员死亡档案中有59％与酒后驾车有关。触目惊醒的数字告诉我们，酒后驾车严重危害着交通安全，害人害己害社会。

目前交警通常使用呼气式酒精检测仪，对驾驶员进行酒精测验。但是呼气式酒精检测仪存在许多问题，影响酒检结果的准确性。因为影响呼气式酒精检测仪检测结果的不确定因素较多，比如，呼气式酒精检测技术要求采集人体由肺部深处呼出来的气体，所以呼气的方式、时间长短、气流量的大小、呼气在空气中的扩散程度等都会影响检测的准确性；比如呼气酒精检测仪需要用力长达2.5秒进行深度呼气，在实际操作时不好掌握；比如，在呼吸测试前，驾驶者过度换气或者高频的深呼吸，会使呼出气体中的酒精浓度降低20％，如果在测试前屏住呼吸20秒钟，会使呼出气体中的酒精浓度提高15％，因此，驾驶者的呼吸方式也会影响检测检查结果的准确性。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种乙基硫酸酯人工抗原、制备方法及应用，本发明制备得到的人工抗原、抗体可以用于制成胶体金侧向层析检测试纸条，进而用于酒驾的检测。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种乙基硫酸酯半抗原，其具有如式(Ⅰ)所示的结构：

一种乙基硫酸酯人工抗原，其具有如式(Ⅱ)所示的结构：其中，p为载体蛋白，n表示一个载体蛋白上偶联的半抗原的个数；n的取值范围为5～100；

进一步地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白和鸡卵清白蛋白中的任意一种。

一种制备乙基硫酸酯半抗原的方法，该方法用于制备以上所述的半抗原，包括如下步骤：

将2-氨基乙醇硫酸氢酯加入反应容器中，然后再加入N,N-二甲基甲酰胺、碳酸钾、2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，室温下搅拌反应2-24小时；反应结束后，蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，得到乙基硫酸酯半抗原；其中，2-氨基乙醇硫酸氢酯：2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸＝1:1～1:4，此比例为物质的量之比。

一种制备乙基硫酸酯人工抗原的方法，该方法用于制备以上所述的乙基硫酸酯人工抗原，包括如下步骤：

(1)乙基硫酸酯半抗原的制备：

将2-氨基乙醇硫酸氢酯加入反应容器中，然后再加入N,N-二甲基甲酰胺、碳酸钾，2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，室温下搅拌反应2-24小时；反应结束后，蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，得到乙基硫酸酯半抗原；其中，2-氨基乙醇硫酸氢酯：2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸＝1:1～1:4，此比例为物质的量之比。

(2)乙基硫酸酯人工抗原的制备：

a.称取乙基硫酸酯半抗原于另一反应容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为A液；其中，乙基硫酸酯半抗原：N-羟基琥珀酰亚胺：N,N-二环己基碳二亚胺＝1:1:1～1:7:7，此比例为物质的量之比；

b.制备pH为7.2～7.4的PBS缓冲液；

c.称取载体蛋白溶于步骤b中所述的PBS缓冲液中，得到的溶液记为B液；B液中，载体蛋白浓度为2-20mg/ml；

d.搅拌下，将A液滴加到B液，得到的混合液在4℃条件下静置过夜，得到乙基硫酸酯人工抗原混合液；A液：B液＝(1～5000):1000，此比例为体积比；

e.将乙基硫酸酯人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤b中的PBS缓冲液透析，透析结束后，离心取上清液即得到乙基硫酸酯人工抗原。

一种抗体，该抗体是采用以上所述的乙基硫酸酯人工抗原免疫动物而获得。

进一步地，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。

一种抗体在检测酒驾中的应用，所述抗体为以上所述的抗体。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以2-氨基乙醇硫酸氢酯为原料制备乙基硫酸酯人工抗原，进而制备得到特异性强的抗体，该抗体能够特异性识别乙基硫酸酯；乙基硫酸酯(EtS)是乙醇经非氧化途径代谢，生成的非氧化代谢产物，它具有极高的专属性和特异性，是乙醇摄入的重要生物标志物。因此能够通过检测乙基硫酸酯，进而能够得到酒精的含量，用于酒驾的检测中，检测结果准确度较高。本发明能够用于酒精的尿液检测，与呼气式检测相比，乙基硫酸酯(EtS)可检测的时间会更久，一般呼气式检测方法需要在喝酒后2小时内检测，这样检测结果较为准确，但是超过2小时，饮酒者体内酒精含量下降，检测结果不准确。因为乙基硫酸酯是酒精在人体内的代谢产物，一般喝酒后20分钟后开始升高，22小时左右达到最高值，完全代谢掉需要24-48小时，所以理论上酒后48小时内都可以通过尿液检测ETS，而且影响因素更少，所以检测结果更准确。

(2)本发明以2-氨基乙醇硫酸氢酯为原料制备乙基硫酸酯人工抗原，在氨基上直接引入2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸连接臂，制备得到乙基硫酸酯半抗原，该半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺及N,N-环己基碳二酰亚胺反应得到活性酯，该活性酯与蛋白发生偶联反应得到乙基硫酸酯人工抗原。本发明只需要一步就能得到半抗原，大大节约了时间成本和人工成本，工艺简洁、生产成本低、原料来源不受限，而且还保留了ETS的特征结构，具有很好的特异性；另外本发明引入的连接臂能更大限度的发挥抗原的免疫原性，增强免疫效果，刺激动物产生抗体，可以有效弥补ETS因为本身结构过于简单而难以刺激机体产生抗体的缺点，本发明所制备的人工抗原具有良好的特异性，可进行动物免疫，得到相应的抗体，能够用于快速检测试剂盒的生产。

(3)本发明制备的乙基硫酸酯人工抗原及抗体可以被用来利用免疫检测方法检测样本中是否含有乙基硫酸酯以及其衍生类药物，这里的样本是指哺乳动物或者人的体液样本，例如唾液、尿液、汗液，或者哺乳动物或者人的组织样本，例如肝脏、脾等组织。免疫检测方便，准确，价格低廉，操作简单，具有很好的应用价值。

附图说明

图1是乙基硫酸酯半抗原的合成路线图。

图2是乙基硫酸酯人工抗原的合成路线图。

图3是乙基硫酸酯半抗原、乙基硫酸酯人工抗原、牛血清白蛋白的紫外扫描图谱。

图4是横向流动测试试纸的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。

以下实施例中所使用的物质(包括反应原料、其他试剂等)及仪器等均能够通过商业途径获得。

实施例1

(1)乙基硫酸酯半抗原的制备

称取100mg(0.71mmol)2-氨基乙醇硫酸氢酯，加入到50ml单口圆底烧瓶中，然后再加入5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，276mg(2mmol)碳酸钾和300mg(1.31mmol)2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，加入搅拌子，室温下搅拌反应20小时；反应结束后，减压蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，TLC：层析液为二氯甲烷：甲醇＝1:1(体积比)，产物比移值Rf＝0.3～0.4；得到半抗原(2)86mg，具体合成路线如图1所示。

(2)乙基硫酸酯人工抗原的制备

a.称取50mg(0.17mmol)乙基硫酸酯半抗原于50ml圆底烧瓶中，加入2.5ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入39mg(0.34mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和70mg(0.34mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为A液。

b.称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。

c.称取0.25g牛血清白蛋白溶于50ml步骤b中所述的pH为7.2～7.4的PBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。

d.在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到乙基硫酸酯人工抗原混合液。

e.将乙基硫酸酯人工抗原混合液移入透析袋(截留分子量为14000)中，用步骤b中PBS缓冲液透析9次，透析结束后，离心取上清液即得到乙基硫酸酯人工抗原(4)，具体合成路线如图2所示。

将牛γ球蛋白(BGG)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡卵清白蛋白(OVA)中的任一种替换牛血清白蛋白(BSA)进行以上所述的步骤，同样地，可以制备得到不同的乙基硫酸酯人工抗原。

(3)乙基硫酸酯人工抗原的鉴定：

(a)紫外扫描图谱

乙基硫酸酯半抗原，乙基硫酸酯人工抗原及牛血清白蛋白的紫外扫描图，如图3所示。由图3可知，本发明成功制备了乙基硫酸酯人工抗原。

(b)偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸光系数ε：用pH为7.2～7.4的PBS缓冲液来配制乙基硫酸酯半抗原溶液，得到乙基硫酸酯半抗原浓度分别为0,5,10,20,30,40μg/ml的PBS溶液，通过紫外扫描图3可知乙基硫酸酯半抗原的最大吸收波长为283nm，在283nm处测吸光度值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数ε＝A/(bc)，其中，A为吸光度，b为吸收池厚度，单位为cm，此处b＝1cm；c为吸光物质的摩尔浓度，单位为mol/L；本发明计算得ε＝1611L/(mol*cm)。

偶联物蛋白浓度的测定：用pH为7.2～7.4的PBS缓冲液分别配制牛血清白蛋白浓度为0，1，2，4，8，10，20mg/ml的牛血清白蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光度值，绘制牛血清白蛋白浓度与吸光度值的关系曲线。将乙基硫酸酯人工抗原溶液按一定比例稀释，在655nm处测得乙基硫酸酯人工抗原的吸光度值，从曲线上得到乙基硫酸酯人工抗原溶液中的相应蛋白浓度值。本发明计算得乙基硫酸酯人工抗原溶液中蛋白浓度为c＝3.224mg/ml。

偶联比测定：将偶联物即乙基硫酸酯人工抗原溶液，用pH为7.2～7.4的PBS缓冲液稀释到浓度为100μg/ml，在265nm处测得吸光度值A₁；将牛血清白蛋白用pH为7.2～7.4的PBS缓冲液稀释到浓度为100μg/ml，在278nm处测得吸光度值A₂，则偶联比率γ为：γ＝[(A₁－A₂)/ε]/(c*100×10^-3/65000)，其中ε为乙基硫酸酯半抗原摩尔吸光系数L/(mol*cm)，65000为牛血清白蛋白的分子量，c*100×10^-3为乙基硫酸酯人工抗原溶液中牛血清白蛋白浓度(μg/ml)，本发明计算得γ≈14。

实施例2

(1)乙基硫酸酯半抗原的制备

称取100mg(0.71mmol)2-氨基乙醇硫酸氢酯，加入到50ml单口圆底烧瓶中，然后再加入5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，138mg(1mmol)碳酸钾和200mg(0.87mmol)2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，加入搅拌子，室温下搅拌反应20小时；反应结束后，减压蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，TLC：层析液为二氯甲烷：甲醇＝1:1(体积比)，产物比移值Rf＝0.3～0.4；得到半抗原(2)40mg，具体合成路线如图1所示。

(2)乙基硫酸酯人工抗原的制备

a.称取40mg(0.14mmol)乙基硫酸酯半抗原于50ml圆底烧瓶中，加入2ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入24mg(0.21mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和43mg(0.21mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为A液。

b.称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。

c.称取0.25g牛血清白蛋白溶于50ml步骤b中所述的pH为7.2～7.4的PBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。

d.在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到乙基硫酸酯人工抗原混合液。

e.将乙基硫酸酯人工抗原混合液移入透析袋(截留分子量为14000)中，用步骤b中PBS缓冲液透析6次，透析结束后，离心取上清液即得到乙基硫酸酯人工抗原，具体合成路线如图2所示。本实施例中，乙基硫酸酯半抗原，乙基硫酸酯人工抗原及牛血清白蛋白的紫外扫描图和图3一致，说明本发明成功制备了乙基硫酸酯人工抗原。

将牛γ球蛋白(BGG)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡卵清白蛋白(OVA)中的任一种替换牛血清白蛋白(BSA)进行以上所述的步骤，同样地，可以制备得到不同的乙基硫酸酯人工抗原。

实施例3

(1)乙基硫酸酯半抗原的制备

称取100mg(0.71mmol)2-氨基乙醇硫酸氢酯，加入到100ml单口圆底烧瓶中，然后再加入10mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，552mg(4mmol)碳酸钾和600mg(2.62mmol)2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，加入搅拌子，室温下搅拌反应20小时；反应结束后，减压蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，TLC：层析液为二氯甲烷：甲醇＝1:1(体积比)，产物比移值Rf＝0.3～0.4；得到半抗原(2)，具体合成路线如图1所示。

(2)乙基硫酸酯人工抗原的制备

a.称取50mg(0.17mmol)乙基硫酸酯半抗原于100ml圆底烧瓶中，加入10ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入1.1mmolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1.0mmol N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为A液。

b.称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。

c.称取0.5g牛血清白蛋白溶于50ml步骤b中所述的pH为7.2～7.4的PBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。

d.在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到乙基硫酸酯人工抗原混合液。

e.将乙基硫酸酯人工抗原混合液移入透析袋(截留分子量为14000)中，用步骤b中PBS缓冲液透析7次，透析结束后，离心取上清液即得到乙基硫酸酯人工抗原，具体合成路线如图2所示。本实施例中，乙基硫酸酯半抗原，乙基硫酸酯人工抗原及牛血清白蛋白的紫外扫描图和图3一致，说明本发明成功制备了乙基硫酸酯人工抗原。

将牛γ球蛋白(BGG)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡卵清白蛋白(OVA)中的任一种替换牛血清白蛋白(BSA)进行以上所述的步骤，同样地，可以制备得到不同的乙基硫酸酯人工抗原。

抗体的制备

可以用以上所制备的乙基硫酸酯人工抗原来免疫动物，例如鼠，兔，或其他哺乳动物来生产多克隆抗体，也可以用杂交瘤细胞来产生单克隆抗体，这些方法是本领域现有公知的技术，在此不再赘述，可以参见一些教科书或免疫手册来获得本发明的抗体或抗体片段(制备和使用抗体-实用手册(Making AND Using Antibodies-A practical handbook).CRC Press,2007)。由上述乙基硫酸酯人工抗原制备得到的抗体可以特异识别人工抗原或者半抗原或者小分子物质，而不能识别其它无关的抗原或者小分子物质。这里所谓“特异性”是指该抗体仅能识别或结合某一特定类型的抗原，而不识别或结合其他类型的抗原。

乙基硫酸酯人工抗原及抗体的应用

研究表明，乙醇在体内除氧化脱氢代谢分解为二氧化碳和水外，还有一部分在体内经非氧化途径代谢，生成一系列非氧化代谢产物，包括脂肪酸乙酯(FAEE)、乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)和乙基硫酸酯(EtS)等，这些代谢产物均可作为有效的生物标记物，用于酒驾的检测中。

本发明合成的乙基硫酸酯半抗原或者乙基硫酸酯人工抗原以及利用他们产生的抗体(此处抗体指的是：单克隆抗体或者多克隆抗体)可以被用来利用免疫检测方法检测样本中是否含有乙基硫酸酯以及其衍生类药物，这里的样本一般是指哺乳动物或者人的体液样本，例如唾液、尿液、汗液，或者哺乳动物或者人的组织样本，例如肝脏、脾等组织。所述的“免疫检测方法”一般是利用抗体与抗原结合的原理进行的免疫分析或者检测方法，这种免疫检测方法包括酶联免疫(ELISA)方法，也包括横向流动(lateral flow)测试试纸(包括荧光法和胶体金法)的方法，也可以包括竞争方法。

横向流动测试试纸它可以用吸水或者非吸水性材料制成，一个测试条可以使用多种材料，用于液体的传递。测试条的一种材料可以叠加在另一种测试条材料上，例如，滤纸叠加在硝化纤维上。或者，测试条中至少含有一种材料的一个区域位于另一种至少含有一种不同材料的区域之后。在这种情况下，各区域之间液体是流通的，它们之间可以相互叠加或者不叠加。测试条上的材料可以固定在例如塑料衬片的支持物上或者硬质表面，以加强测试条可持力。测试条各区域可按如下排列：加样区，至少一个试剂区，至少一个检测结果区，至少一个控制区，至少一个掺假检测区和液体吸收区。如果检测区包括一个控制区，优选控制区位于检测结果区的被分析物检测区之后。所有这些区或其组合可以在含有一种材料的单一试纸条上。另外，这些区由不同的材料制成，并按液体传递的方向连接在一起。例如，不同区域可以直接或者间接进行液体传递。在本实施例中，不同的区可以沿液体传递的方向，一个区域的末端和另一个区域始端相连，或沿液体传递方向相互叠加，或者通过其他材料相连接，例如连接介质材料(优选吸水性材料例如滤纸，玻璃纤维，无纺布或硝酸纤维素)。连接材料能够使包含各区域的末端与始端相接的材料、包含各区域的末端与始端相接但液体不流通的材料、或包含各区域相互重叠(例如但不限于从头到尾重叠)但液体不流通的材料，形成液体流通。横向流动测试试纸的一般结构如图4所示。

除此之外，也可以将本发明的乙基硫酸酯人工抗原制备的抗体用于免疫治疗因为乙基硫酸酯引起的各种疾病，例如，用于治疗乙基硫酸酯成瘾的一种免疫试剂。这样抗体就作为一种药物试剂来使用。

用实施例1制备的乙基硫酸酯人工抗原及抗体制成胶体金侧向层析检测试纸条，胶体金侧向层析检测试纸条的制备采用本领域现有公知的技术制备即可；用此试纸条对乙基硫酸酯标准品进行检测，检测样品的使用量为50μl；具体检测数据如表1所示，其中，m表示单个样品重复检测的次数；结果阴性、阳性两列的数字分别表示：检测结果为阴性的次数、检测结果为阳性的次数，由此进一步地，可以得到检测结果的准确率；例如乙基硫酸酯的浓度为0ng/mL表示阴性，30次检测结果全部为阴性，即阴性的检测次数为30，则准确率为100％。

表1检测结果

表1中检测结果表明本发明所制备的乙基硫酸酯人工抗原、抗体具有较高的特异性，试纸条在对乙基硫酸酯的检测中具有很高的灵敏度，本实施例中，灵敏度为50ng/ml，完全符合市场检测的需求。

交叉反应实验：用实施例1制备的乙基硫酸酯人工抗原及抗体作为主要原料制成胶体金侧向层析检测试纸条，对表2中物质的标准品进行检测，样品使用量为50μl。

表2交叉反应结果

注：“+”表示有交叉反应，“-”表示没有反应。

结果显示本发明制备得到的乙基硫酸酯人工抗原，抗体具有高度特异性，与其他药物没有交叉反应。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种乙基硫酸酯半抗原，其特征是，其具有如式(Ⅰ)所示的结构：

2.一种乙基硫酸酯人工抗原，其特征是，其具有如式(Ⅱ)所示的结构：其中，p为载体蛋白，n表示一个载体蛋白上偶联的半抗原的个数；

3.根据权利要求2所述的一种乙基硫酸酯人工抗原，其特征是，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白和鸡卵清白蛋白中的任意一种。

4.一种制备乙基硫酸酯半抗原的方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求1所述的半抗原，包括如下步骤：

将2-氨基乙醇硫酸氢酯加入反应容器中，然后再加入N,N-二甲基甲酰胺、碳酸钾、2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，室温下搅拌反应2-24小时；反应结束后，蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，得到乙基硫酸酯半抗原；其中，2-氨基乙醇硫酸氢酯：2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸＝1:1～1:4，此比例为物质的量之比。

5.一种制备乙基硫酸酯人工抗原的方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求2-3任一项所述的乙基硫酸酯人工抗原，包括如下步骤：

(1)乙基硫酸酯半抗原的制备：

将2-氨基乙醇硫酸氢酯加入反应容器中，然后再加入N,N-二甲基甲酰胺、碳酸钾，2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸，室温下搅拌反应2-24小时；反应结束后，蒸干溶剂，用薄层色谱法纯化，得到乙基硫酸酯半抗原；其中，2-氨基乙醇硫酸氢酯：2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸＝1:1～1:4，此比例为物质的量之比；

(2)乙基硫酸酯人工抗原的制备：

a.称取乙基硫酸酯半抗原于另一反应容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为A液；其中，乙基硫酸酯半抗原：N-羟基琥珀酰亚胺：N,N-二环己基碳二亚胺＝1:1:1～1:7:7，此比例为物质的量之比；

b.制备pH为7.2～7.4的PBS缓冲液；

c.称取载体蛋白溶于步骤b中所述的PBS缓冲液中，得到的溶液记为B液；B液中，载体蛋白浓度为2-20mg/ml；

d.搅拌下，将A液滴加到B液，得到的混合液在4℃条件下静置过夜，得到乙基硫酸酯人工抗原混合液；A液：B液＝(1～5000):1000，此比例为体积比；

e.将乙基硫酸酯人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤b中的PBS缓冲液透析，透析结束后，离心取上清液即得到乙基硫酸酯人工抗原。

6.一种抗体，其特征在于，该抗体是采用权利要求2-3中任一项所述的乙基硫酸酯人工抗原免疫动物而获得。

7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。

8.一种抗体在检测酒驾中的应用，其特征在于，所述抗体为权利要求6所述的抗体。

Images