CN111500558A - 具提升活性的葡萄糖苷酶 - Google Patents
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Abstract
本申请关于一种具提升活性的葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为将序列编号2第286个位置的酪氨酸突变成苯丙氨酸、或将第639个位置的天冬酰胺突变成谷氨酸的氨基酸序列。
Description
技术领域
本申请关于一种葡萄糖苷酶，尤指一种具提升活性的葡萄糖苷酶。
背景技术
纤维素是植物细胞壁的主要组成之一，也是地球上主要生物质能(biomass)的来源，因此，现今许多能够有效分解纤维素的酶蛋白在不同工业上的应用也十分广泛。纤维素是由葡萄糖为单位，以β-1,4-糖苷键(β-1,4-glycosidic bond)所键结而成的长链多糖，这些多糖体共同组织排列成紧密的结晶型纤维素，进而抵抗外界的分解作用。然而，生物界中许多草食动物以及微生物等需要通过将植物细胞壁中的多糖纤维素分解成可以被体内吸收的葡萄单糖，以作为生存能量来源。纤维素酶的催化机制主要是通过酸碱反应，将连接两个单糖的β-1,4-糖苷键进行水解作用，进而分解多糖纤维素。而纤维素酶基本上可分成三类，分别为内切葡聚糖酶(endo-glucanase,E.C.3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,E.C.3.2.1.91)以及葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,EC3.2.1.21)。内切葡聚糖酶能够随机地将长链纤维素切成许多小片段的寡糖；而外切葡聚糖酶则可从长链纤维素的还原端或非还原端进行分解，其主要产物为纤维二糖；至于葡萄糖苷酶则可把纤维二糖分解为单糖的葡萄糖。
葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌等，它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能有着重要的作用。目前在许多相关的研究中，为了得到更佳的酶，除了在自然界中筛选出来之外，就是将现有的酶蛋白加以改造。本申请即欲通过研究酶结构以找出对于酶活性具有关键性的氨基酸并进行基因改造，以有效提升葡萄糖苷酶的活性，进而增加葡萄糖苷酶的工业应用价值。
发明内容
本申请的目的在于改造现有葡萄糖苷酶，利用结构分析及点突变技术，以有效提升葡萄糖苷酶的活性，进而增加葡萄糖苷酶的工业应用价值。
为达上述目的，本申请的一较广义实施方式为提供一种葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为将序列编号2第286个位置的酪氨酸改以苯丙氨酸取代修饰的序列。
在一实施例中，编码该序列编号2的基因是从黑曲霉SH2(Aspergillus nigerSH2)所分离出来的AnBgl基因。
在一实施例中，该葡萄糖苷酶的氨基酸序列如序列编号6所示。
为达上述目的，本申请的另一较广义实施方式为提供一种葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为将序列编号2第639个位置的天冬酰胺改以谷氨酸取代修饰的序列。
在一实施例中，编码该序列编号2的基因是从黑曲霉SH2(Aspergillusniger SH2)所分离出来的AnBgl基因。
在一实施例中，该葡萄糖苷酶的氨基酸序列如序列编号8所示。
附图说明
图1表示野生型葡萄糖苷酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
图2表示点突变技术所采用的引物序列。
图3表示Y286F突变型葡萄糖苷酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
图4表示N639E突变型葡萄糖苷酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
图5表示野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E在BMMY的摇瓶活性比较。
图6表示相同蛋白量的野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E的活性比较。
图7表示野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E的耐温测试结果。
具体实施方式
体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的方式上具有各种的变化，其皆不脱离本申请的范围，且其中的说明及图式在本质上用于说明，而非用以限制本申请。
曲霉属(Aspergillus spp.)来源的葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)是广泛应用在饲料领域的葡萄糖苷酶之一，本申请根据基因库的基因序列，设计黑曲霉(Aspergillusniger)的葡萄糖苷酶基因引物，从实验室保存菌种黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的基因组钓取得到一段基因(称为AnBgl基因)。经比对，AnBgl基因与黑曲霉CBS 513.88(Aspergillus niger CBS 513.88)的葡萄糖苷酶A(beta-glucosidase A)基因有98％相似度，而氨基酸序列与黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖苷酶(Gene bank:AIE48478.1)相似度则为100％。
将从黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)钓取得到的葡萄糖苷酶基因AnBgl的氨基酸序列以SWISS-MODEL软件进行结构仿真，取得蛋白质仿真结构后进行BLAST蛋白质结构比对，发现结构最为接近的是有83％相似度的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的葡萄糖苷酶1(beta-glucosidase 1，蛋白质数据库PDB ID:4IIB)。接着，运用PyMOL软件将黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的葡萄糖苷酶AnBgl与比活(specific activity)较高的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的葡萄糖苷酶(PDB ID:4IIB)、以及黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的葡萄糖苷酶(AFU51372.1)的仿真结构进行蛋白质结构比对。
根据比对结果，在棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)与黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的葡萄糖苷酶蛋白结构中，作用活性区域第286位置上的氨基酸为苯丙氨酸(Phenylalanine)，而在黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的葡萄糖苷酶AnBgl蛋白结构上对应的氨基酸为第286个位置的酪氨酸(Tyrosine)，因此选择将黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的葡萄糖苷酶AnBgl第286个位置的酪氨酸进行点突变改为苯丙氨酸，而得到Y286F突变蛋白，以期提升葡萄糖苷酶AnBgl的活性。
另外，运用NetNGlyc 1.0Server来预测黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的葡萄糖苷酶AnBgl以及黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的葡萄糖苷酶氨基酸序列里Asn-Xaa-Ser/Thr的糖基化位置，再比对两者糖基化的氨基酸位置，挑选黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的葡萄糖苷酶在其结构外围的没有糖基化的序列，其在黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的葡萄糖苷酶AnBgl对应序列中包含第639个位置的天冬酰胺(Asparagine)，而在黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的葡萄糖苷酶对应位置的氨基酸则为谷氨酸(Glutamate)，因此选择将黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)的葡萄糖苷酶AnBgl第639个位置的天冬酰胺进行点突变改为谷氨酸，而得到N639E突变蛋白，以期提升葡萄糖苷酶AnBgl的活性。
以下将详述本申请改造葡萄糖苷酶的方法及其所得到的改良葡萄糖苷酶。
图1表示野生型葡萄糖苷酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，也即从黑曲霉SH2(Aspergillus niger SH2)钓取得到的葡萄糖苷酶基因AnBgl的核苷酸序列以及氨基酸序列。如图1所示，野生型葡萄糖苷酶基因AnBgl包含2526个碱基(核苷酸序列以序列编号1标示)以及841个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。此段基因两端乃以EcoRI与NotI限制酶位置衔接在pPICZ A载体上。
本申请葡萄糖苷酶基因AnBgl的两种突变基因利用点突变技术取得，以野生型基因AnBgl作为模板进行聚合酶连锁反应，当中所用的突变引物列于图2，其中Y286F意指葡萄糖苷酶AnBgl第286个位置的氨基酸由酪氨酸(Tyrosine)突变成苯丙氨酸(Phenylalanine)，且Y286F突变引物序列以序列编号3标示，而N639E意指葡萄糖苷酶AnBgl第639个位置的氨基酸由天冬酰胺(Asparagine)突变成谷氨酸(Glutamate)，且N639E突变引物序列以序列编号4标示。因此，本申请利用点突变技术取得葡萄糖苷酶AnBgl的两种突变基因分别是Y286F以及N639E。
图3及图4即表示本申请所构筑的两种突变型的核苷酸及氨基酸序列。图3表示Y286F突变型葡萄糖苷酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中核苷酸序列以序列编号5标示，氨基酸序列以序列编号6标示，且其第286个位置的氨基酸由酪氨酸(Tyrosine)突变成苯丙氨酸(Phenylalanine)。图4表示N639E突变型葡萄糖苷酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中核苷酸序列以序列编号7标示，氨基酸序列以序列编号8标示，且其第639个位置的氨基酸由天冬酰胺(Asparagine)突变成谷氨酸(Glutamate)。
将突变改造的DNA质体使用PmeI限制酶进行线性化之后，以电转(electroporation)方式送入酵母Pichia pastoris X33，然后将转型后的菌液涂到含有100μg/ml zeocin抗生素的YPD平板上，放置于30℃的培养箱进行两天的培养。之后挑选单一菌落至5ml YPD于30℃培养，再接种到50ml BMGY中30℃培养一天。接下来将菌体换至20ml的BMMY进行四天的诱导蛋白表达，每24小时取样并加1％甲醇进行诱导，菌液以3500rpm转速离心并收取上清液，进行蛋白量测量及葡萄糖苷酶活性检测。
葡萄糖苷酶的活性检测方法是利用葡萄糖苷酶催化水解硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)，释放具呈色效果的硝基苯酚(nitrophenol)，再进而推算出葡萄糖苷酶的活性。将0.2ml、5mM的硝基苯基-β-D-葡萄糖苷与以pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液(citric-phosphate buffer)适当稀释过的酶蛋白溶液混合之后，在60℃的水浴槽中作用10分钟，随后加入0.75ml、2M的碳酸钠溶液以终止反应。最后，在OD410波长下测定吸光值，再换算成葡萄糖苷酶的活性。
图5表示野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E在BMMY的摇瓶活性比较，其中D1-D4分别表示在第1天至第4天所分别收集的诱导酶蛋白上清液。由图5所示结果可知，在四天的甲醇诱导之下，突变蛋白Y286F及N639E的葡萄糖苷酶活性皆高于野生蛋白WT。
进一步调整野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E的蛋白浓度一致之后，再进行活性检测，并比较其相对活性数值。图6即表示相同蛋白量的野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E的活性比较。由图所示结果可知，在相同的酶蛋白量之下测定酶活性，突变蛋白Y286F及N639E的葡萄糖苷酶活性同样皆高于野生蛋白WT。
另外，本申请也进一步进行葡萄糖苷酶的耐温测试，其将经缓冲液调整的突变蛋白酶溶液，分别在65℃以及70℃条件下进行热处理2分钟后进行活性检测，并与原始蛋白酶溶液比较其耐温性。图7表示野生蛋白WT与突变蛋白Y286F及N639E的耐温测试结果。由图示结果可知，突变蛋白Y286F及N639E在65℃以及70℃处理2分钟之后的耐温性皆略高于野生蛋白WT。
综上所述，为了提升葡萄糖苷酶AnBgl的活性，本申请进一步分析其蛋白结构，挑选具改造潜力的氨基酸，进行合理地改造。结果显示，所改造的两种突变蛋白Y286F及N639E的活性皆高于野生蛋白，且两种突变蛋白Y286F及N639E的耐温性也略高于野生蛋白。因此，本申请提供的葡萄糖苷酶突变蛋白Y286F及N639E可有效提升葡萄糖苷酶的活性，故可进一步降低生产成本，并增加其工业应用价值。
虽然本发明已由上述实施例详细叙述而可由本领域技术人员任施匠思而进行各种修饰，但都不超出权利要求书所要保护的范围。
序列表
<110> 东莞泛亚太生物科技有限公司
<120> 具提升活性的葡萄糖苷酶
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2526
<212> DNA
<213> 黑曲霉SH2 (Aspergillus niger SH2)
<400> 1
gatgaattgg cctactcccc tccatactac ccatctccat gggctaacgg tcaaggtgat 60
tgggctgaag cttaccaaag agctgttgat attgtttctc aaatgacttt ggctgaaaag 120
gttaacttga ctactggtac tggttgggaa ttggaattgt gtgttggtca aactggtggt 180
gttccaagat tgggtattcc aggtatgtgt gctcaagatt ctccattggg tgttagagat 240
tctgactaca actctgcgtt ccctgccggt gtcaacgtgg ccgcaacctg ggacaagaat 300
ctggcttacc ttcgtggcca ggctatgggt caggagttta gtgacaaggg tgctgatatc 360
caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg acggcggtcg taactgggag 420
ggcttctccc ccgacccggc cctcagtggt gtgctctttg cagagacaat caagggtatt 480
caggatgctg gtgtggttgc aacggctaag cactacatcg cctacgagca ggagcatttc 540
cgtcaggcgc ctgaagctca aggctacgga ttcaatatta ccgagagtgg aagcgcgaac 600
ctcgacgata agactatgca tgagctgtac ctctggccct tcgcggatgc catccgtgca 660
ggtgccggtg ctgtgatgtg ctcgtacaac cagatcaaca acagctatgg ctgccaaaac 720
agctacactc tgaacaagct gctcaaggct gagctgggtt tccagggctt tgtcatgagt 780
gattgggcgg ctcaccatgc cggtgtgagt ggtgctttgg cgggattgga catgtctatg 840
ccgggagacg tcgattacga cagtggcacg tcttactggg gtaccaactt gaccatcagt 900
gtgctcaacg ggacggtgcc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg catcatggcc 960
gcctactaca aggtcggccg tgaccgtctg tggactcctc ccaacttcag ctcatggacc 1020
agagatgaat acggcttcaa gtactactat gtctcggagg gaccgtatga gaaggtcaac 1080
cagttcgtga acgtgcaacg caaccatagc gagttgatcc gccgtattgg agcagacagc 1140
acggtgctcc tcaagaacga tggcgctctt cccttgactg gaaaggagcg cttggtcgcc 1200
cttatcggag aagatgcggg ttccaatcct tatggtgcca acggctgcag tgaccgtggg 1260
tgcgacaatg gaacattggc gatgggctgg ggaagtggca ctgccaactt tccctacttg 1320
gtgacccccg agcaggccat ctcgaacgag gtgctcaaga acaagaatgg cgtattcact 1380
gcgaccgata actgggctat tgatcagatt gaggcgcttg ctaagaccgc cagtgtctct 1440
cttgtctttg tcaacgccga ctctggtgag ggttatatca atgtcgacgg aaacctgggt 1500
gaccgcagga acctgaccct gtggaggaac ggcgacaatg tgatcaaggc tgctgctagc 1560
aactgcaaca acacgatcgt tattattcac tctgtcggcc cagtcttggt taacgagtgg 1620
tacgacaacc ccaatgttac cgctattctc tggggtggtc ttcccggtca ggagtctggc 1680
aactccctcg ccgacgtgct ctacggccgt gtcaaccccg gtgccaagtc gcccttcacc 1740
tggggcaaga ctcgtgaggc ctaccaagat tacttgtaca ccgagcccaa caacggcaac 1800
ggagcgcccc aggaagactt cgtcgagggc gtcttcattg actaccgcgg atttgacaag 1860
cgcaacgaga ctcctatcta tgagttcggc tatggtctga gctacaccac cttcaactac 1920
tcgaaccttc aggtggaggt tctgagcgcc cctgcgtacg agcctgcttc gggcgagact 1980
gaggcagcgc cgactttcgg agaggtcgga aatgcgtcgg attacctcta ccccgatgga 2040
ctgcagagaa tcaccaagtt catctacccc tggctcaaca gtaccgatct tgaggcgtct 2100
tctggggatg ctagctatgg gcaggatgcc tcagactatc ttcccgaggg agccaccgat 2160
ggctctgcgc aaccgatcct gcctgccggt ggtggtgctg gcggcaaccc tcgcctgtac 2220
gacgagctca tccgcgtgtc ggtgactatc aagaacaccg gcaaggttgc gggtgatgaa 2280
gttcctcaac tgtatgtttc tcttggcggc cctaacgaac ccaagatcgt gctgcgtcaa 2340
ttcgagcgta tcacgctgca gccgtcgaaa gagacgcagt ggagcacaac tctgacgcgc 2400
cgtgaccttg cgaactggaa tgttgagacg caggactggg agattacgtc gtatcccaag 2460
atggtgtttg ccggaagctc ctcgcggaag ctgccgctcc gggcgtctct gcctactgtt 2520
cactaa 2526
<210> 2
<211> 841
<212> PRT
<213> 黑曲霉SH2 (Aspergillus niger SH2)
<400> 2
Asp Glu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asn
1 5 10 15
Gly Gln Gly Asp Trp Ala Glu Ala Tyr Gln Arg Ala Val Asp Ile Val
20 25 30
Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly
35 40 45
Trp Glu Leu Glu Leu Cys Val Gly Gln Thr Gly Gly Val Pro Arg Leu
50 55 60
Gly Ile Pro Gly Met Cys Ala Gln Asp Ser Pro Leu Gly Val Arg Asp
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val Ala Ala Thr
85 90 95
Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met Gly Gln Glu
100 105 110
Phe Ser Asp Lys Gly Ala Asp Ile Gln Leu Gly Pro Ala Ala Gly Pro
115 120 125
Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser Pro
130 135 140
Asp Pro Ala Leu Ser Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile
145 150 155 160
Gln Asp Ala Gly Val Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Ala Tyr Glu
165 170 175
Gln Glu His Phe Arg Gln Ala Pro Glu Ala Gln Gly Tyr Gly Phe Asn
180 185 190
Ile Thr Glu Ser Gly Ser Ala Asn Leu Asp Asp Lys Thr Met His Glu
195 200 205
Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ala
210 215 220
Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Gln Asn
225 230 235 240
Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln Gly
245 250 255
Phe Val Met Ser Asp Trp Ala Ala His His Ala Gly Val Ser Gly Ala
260 265 270
Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Asp Tyr Asp Ser
275 280 285
Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val Leu Asn Gly
290 295 300
Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Trp Thr Pro Pro Asn Phe
325 330 335
Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Lys Tyr Tyr Tyr Val Ser
340 345 350
Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn Gln Phe Val Asn Val Gln Arg Asn
355 360 365
His Ser Glu Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Asp Ser Thr Val Leu Leu
370 375 380
Lys Asn Asp Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg Leu Val Ala
385 390 395 400
Leu Ile Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Tyr Gly Ala Asn Gly Cys
405 410 415
Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly Trp Gly Ser
420 425 430
Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Ser
435 440 445
Asn Glu Val Leu Lys Asn Lys Asn Gly Val Phe Thr Ala Thr Asp Asn
450 455 460
Trp Ala Ile Asp Gln Ile Glu Ala Leu Ala Lys Thr Ala Ser Val Ser
465 470 475 480
Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val Asp
485 490 495
Gly Asn Leu Gly Asp Arg Arg Asn Leu Thr Leu Trp Arg Asn Gly Asp
500 505 510
Asn Val Ile Lys Ala Ala Ala Ser Asn Cys Asn Asn Thr Ile Val Ile
515 520 525
Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Glu Trp Tyr Asp Asn Pro
530 535 540
Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Gly Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly
545 550 555 560
Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Ala Lys
565 570 575
Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gln Asp Tyr Leu
580 585 590
Tyr Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Glu Asp Phe Val
595 600 605
Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Lys Arg Asn Glu Thr
610 615 620
Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asn Tyr
625 630 635 640
Ser Asn Leu Gln Val Glu Val Leu Ser Ala Pro Ala Tyr Glu Pro Ala
645 650 655
Ser Gly Glu Thr Glu Ala Ala Pro Thr Phe Gly Glu Val Gly Asn Ala
660 665 670
Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Asp Gly Leu Gln Arg Ile Thr Lys Phe Ile
675 680 685
Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu Ala Ser Ser Gly Asp Ala
690 695 700
Ser Tyr Gly Gln Asp Ala Ser Asp Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Thr Asp
705 710 715 720
Gly Ser Ala Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Asn
725 730 735
Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Ser Val Thr Ile Lys Asn
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Thr Gly Lys Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr Val Ser Leu
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Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Ile Val Leu Arg Gln Phe Glu Arg Ile
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Thr Leu Gln Pro Ser Lys Glu Thr Gln Trp Ser Thr Thr Leu Thr Arg
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Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asn Val Glu Thr Gln Asp Trp Glu Ile Thr
805 810 815
Ser Tyr Pro Lys Met Val Phe Ala Gly Ser Ser Ser Arg Lys Leu Pro
820 825 830
Leu Arg Ala Ser Leu Pro Thr Val His
835 840
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成引物(Synthetic primer)
<400> 3
tatgccggga gacgtcgatt tcgacagtgg ca 32
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成引物(Synthetic primer)
<400> 4
tatggtctga gctacaccac ctttgaatac tcgaacctt 39
<210> 5
<211> 2526
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 突变体(Mutant)
<400> 5
gatgaattgg cctactcccc tccatactac ccatctccat gggctaacgg tcaaggtgat 60
tgggctgaag cttaccaaag agctgttgat attgtttctc aaatgacttt ggctgaaaag 120
gttaacttga ctactggtac tggttgggaa ttggaattgt gtgttggtca aactggtggt 180
gttccaagat tgggtattcc aggtatgtgt gctcaagatt ctccattggg tgttagagat 240
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ctggcttacc ttcgtggcca ggctatgggt caggagttta gtgacaaggg tgctgatatc 360
caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg acggcggtcg taactgggag 420
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ctcgacgata agactatgca tgagctgtac ctctggccct tcgcggatgc catccgtgca 660
ggtgccggtg ctgtgatgtg ctcgtacaac cagatcaaca acagctatgg ctgccaaaac 720
agctacactc tgaacaagct gctcaaggct gagctgggtt tccagggctt tgtcatgagt 780
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agagatgaat acggcttcaa gtactactat gtctcggagg gaccgtatga gaaggtcaac 1080
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gaggcagcgc cgactttcgg agaggtcgga aatgcgtcgg attacctcta ccccgatgga 2040
ctgcagagaa tcaccaagtt catctacccc tggctcaaca gtaccgatct tgaggcgtct 2100
tctggggatg ctagctatgg gcaggatgcc tcagactatc ttcccgaggg agccaccgat 2160
ggctctgcgc aaccgatcct gcctgccggt ggtggtgctg gcggcaaccc tcgcctgtac 2220
gacgagctca tccgcgtgtc ggtgactatc aagaacaccg gcaaggttgc gggtgatgaa 2280
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<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 突变体(Mutant)
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Gly Gln Gly Asp Trp Ala Glu Ala Tyr Gln Arg Ala Val Asp Ile Val
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Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ala
210 215 220
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225 230 235 240
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<211> 2526
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<221>
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caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg acggcggtcg taactgggag 420
ggcttctccc ccgacccggc cctcagtggt gtgctctttg cagagacaat caagggtatt 480
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gcgaccgata actgggctat tgatcagatt gaggcgcttg ctaagaccgc cagtgtctct 1440
cttgtctttg tcaacgccga ctctggtgag ggttatatca atgtcgacgg aaacctgggt 1500
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gaggcagcgc cgactttcgg agaggtcgga aatgcgtcgg attacctcta ccccgatgga 2040
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gacgagctca tccgcgtgtc ggtgactatc aagaacaccg gcaaggttgc gggtgatgaa 2280
gttcctcaac tgtatgtttc tcttggcggc cctaacgaac ccaagatcgt gctgcgtcaa 2340
ttcgagcgta tcacgctgca gccgtcgaaa gagacgcagt ggagcacaac tctgacgcgc 2400
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atggtgtttg ccggaagctc ctcgcggaag ctgccgctcc gggcgtctct gcctactgtt 2520
cactaa 2526
<210> 8
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 突变体(Mutant)
<400> 8
Asp Glu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asn
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805 810 815
Ser Tyr Pro Lys Met Val Phe Ala Gly Ser Ser Ser Arg Lys Leu Pro
820 825 830
Leu Arg Ala Ser Leu Pro Thr Val His
835 840
Claims (6)
1.一种葡萄糖苷酶，其中，其氨基酸序列为将序列编号2第286个位置的酪氨酸改以苯丙氨酸取代修饰的序列。
2.如权利要求1所述的葡萄糖苷酶，其中，编码所述序列编号2的基因是从黑曲霉SH2所分离出来的AnBgl基因。
3.如权利要求1所述的葡萄糖苷酶，其中，所述葡萄糖苷酶的氨基酸序列如序列编号6所示。
4.一种葡萄糖苷酶，其中，其氨基酸序列为将序列编号2第639个位置的天冬酰胺改以谷氨酸取代修饰的序列。
5.如权利要求4所述的葡萄糖苷酶，其中，编码所述序列编号2的基因是从黑曲霉SH2所分离出来的AnBgl基因。
6.如权利要求4所述的葡萄糖苷酶，其中，所述葡萄糖苷酶的氨基酸序列如序列编号8所示。
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|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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|---|---|---|---|---|
| CN103443273A (zh) * | 2011-03-16 | 2013-12-11 | 天野酶株式会社 | 修饰型α-葡萄糖苷酶及其用途 |
| CN105745322A (zh) * | 2013-09-17 | 2016-07-06 | 易登尼有限公司 | 用于增加生物质糖化的改良的β-葡萄糖苷酶 |
-
2019
- 2019-01-31 CN CN201910099556.3A patent/CN111500558B/zh active Active
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|---|---|
| CN111500558B (zh) | 2022-01-25 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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