CN111494426A - 僵蚕醇提物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了僵蚕醇提物及其应用，僵蚕醇提物以体积分数为95％和65％的乙醇溶液作为提取溶剂提取制得，提取得到的产物具有安全性好，且不会引起炎症反应，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌均具有一定程度的抑制作用，可作为痤疮相关化妆品原料，有望开拓僵蚕的使用价值，为功效型中药化妆品的研发和推广提供思路以及理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取物领域，具体涉及僵蚕醇提物，还涉及僵蚕醇提物的应用。
背景技术
家蚕(Bombyx mori)是一种重要的经济昆虫，其在饲养过程中常被真菌、细菌、病毒等感染致病。在其真菌疾病中，由白僵菌引发的白僵病较为常见，感染白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill.)死亡后僵化的虫体即为白僵蚕，又名僵蚕。僵蚕作为一味传统中药，药用历史悠久，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效。其含有多种成分，现代药理学研究表明其具有广泛的药理学作用。目前对僵蚕的研究，多集中在其抗惊厥、降血糖等中药药效方面，其他方面的研究很少。
因此，有必要对僵蚕提取物进行安全性和功效进行研究，有利于开拓僵蚕的使用价值，为功效型僵蚕产品的研发和推广提供思路以及理论基础。
发明内容
有鉴于此，本发明使用乙醇作为溶剂对僵蚕进行提取，得到的僵蚕提取液进行过滤浓缩，最后喷干/冻干成粉，僵蚕醇提物BBE。然后通过CCK-8法测得BBE的IC50为295.77±127.46μg/mL，通过鸡胚绒毛尿囊膜实验得出0.5％的BBE不具有眼刺激性，表明BBE的安全性高。
为此，本发明提供如下技术方案：
僵蚕醇提物，由以下方法制备：将干燥的僵蚕粉分别用体积分数为95％和65％的乙醇溶液作为提取溶剂提取，分别收集提取液，合并提取液，浓缩去除乙醇，干燥，得僵蚕醇提物。
优选的，所述僵蚕粉为粒径小于50目的粉末。
优选的，所述乙醇溶液按1：20的料液比添加。
优选的，所述提取为在18～25℃下提取2h。
经僵蚕醇提物BBE进行DPPH自由基清除实验显示，BBE浓度为5mg/mL时，DPPH·清除率达到97.91％，且其清除活力具有浓度相关性，表明BBE具有抗氧化的潜力。通过ELISA法检测BBE对RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子IL-1β的影响。结果显示，该方法提取得到的BBE在安全浓度范围内，不能降低LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子IL-1β的水平，但也不会致使其升高，因此可以具有抗炎能力。
为此，本发明提供如下技术方案：所述僵蚕醇提物在制备抗氧化和抗炎的药物中的应用。
为了检测BBE是否具有抑菌活性，选取革兰氏阴性代表菌大肠杆菌、革兰氏阳性代表菌金黄色葡萄球菌、与皮肤病相关的痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌作为待测菌株，对BBE的抑菌活性进行分析。结果显示，BBE具有较好的抑菌功效，其对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，其次是痤疮丙酸杆菌，对大肠杆菌的抑制效果最弱，表明BBE具有成为痤疮相关化妆品原料的应用潜力。
为此，本发明提供如下技术方案：
所述僵蚕醇提物在制备大肠杆菌抑制剂中的应用。
所述僵蚕醇提物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用。
所述僵蚕醇提物在制备痤疮丙酸杆菌抑制剂中的应用。
所述僵蚕醇提物在制备糠秕马拉色菌抑制剂中的应用。
所述僵蚕醇提物在制备抗痤疮化妆品原料中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明对僵蚕用醇进行提取，获得提取物主要含脂肪和黄酮，在脂肪和黄酮共同作用下能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌等作用，然后对僵蚕提取物进行了安全性价，再对其进行功效筛选，期望能开拓僵蚕的使用价值，为功效型中药化妆品的研发和推广提供思路以及理论基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为BBE对HaCat细胞的存活率曲线。
图2为BBE对CAM的刺激观察(A：阴性对照；B：阳性对照；C：0.5％僵蚕醇提物对CAM的刺激作用)。
图3为BBE对DPPH·的清除率。
图4为BBE对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β的影响。
图5为BBE的抗细菌活性(A：BBE对大肠杆菌E.coli的抑制作用；B：BBE对金黄色葡萄球菌S.aureus的抑制作用)。
图6为BBE对痤疮丙酸杆菌P.acnes的抑制作用。
图7为BBE对糠秕马拉色菌M.furfur的抑制作用(A：阳性对照：0.5％的氟康唑处理；B：阴性对照：1mL丙酮处理；C：6mg/mL的BBE处理；D：5mg/mL的BBE处理；E：4mg/mL的BBE处理；F：3mg/mL的BBE处理)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、僵蚕醇提物的制备方法
将僵蚕烘干，磨粉，过50目筛；用95％和65％的乙醇作为提取溶剂，按照1：20的料液比分别室温提取2h，抽滤除去残渣并合并滤液，旋转蒸发仪浓缩提取液至没有乙醇味，最后使用冷冻干燥机冻干，得僵蚕醇提物BBE，BBE的主要成分为脂肪和黄酮。
实施例2、僵蚕醇提物BBE安全性实验
1、BBE对HaCat细胞毒性
将BBE配置成3000μg/mL的初始浓度，按照1.73的稀释因子将其稀释成8个浓度进行实验，具体步骤如下：
1)铺板：将对数生长期的HaCat细胞消化下来，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基配置成细胞悬液，在96孔板中接种100μL的细胞悬液，每孔1～2×104个细胞。将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养；
2)样品准备：取适量样品，加含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基溶解，将BBE配置成3000μg/mL的初始浓度，按照1.73的稀释因子将其稀释成8个浓度，并使用一次性注射器和0.22μm的过滤器对其进行过滤处理；
3)处理细胞：细胞贴壁后，将96孔板中的培养基吸出，加入100μL不同浓度的受试液。将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养。
4)24h后，吸出待测物质，按照每孔100μL加入培养基，再向每孔加入10μL CCK-8溶液，注意不要打出气泡，以免影响读数。将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养1h左右，使用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值。
以含10％胎牛血清培养基和细胞的孔为空白对照，按下式计算细胞死亡率，用GraphPad Prism 5计算出IC50。
细胞死亡率(％)＝1-(受试物OD值/空白对照OD值)×100％
结果如图1所示。结果显示，在3000μg/mL的浓度下，细胞存活率为(11±0)％，BBE对细胞产生了一定的刺激作用，但细胞仍能存活一小部分；在64.68μg/ml的浓度下，细胞存活率为(92±9)％，细胞大部分都存活。经GraphPad Prism 5分析，IC50为329.5μg/mL。
2、僵蚕醇提物BBE鸡胚绒毛尿囊膜试验
僵蚕醇提物BBE鸡胚绒毛尿囊膜试验，具体步骤如下：
1)鸡胚孵育：将种蛋以气室朝上的方式放置进孵化箱中，孵化箱温度设置为37.6℃，湿度为45％-60％，翻蛋频率3次/天-6次/天，在9日龄进行照蛋检查，观察其血管长势；
2)尿囊膜制备：用镊子小心翼翼的去除气室部分的蛋壳，暴露蛋壳膜，加入3-5滴生理盐水使蛋壳膜湿润，吸出多余的生理盐水，小心用尖头镊子将蛋壳膜撕开，暴露完整的尿囊膜；
3)在暴露出的尿囊膜上放置一个硅酮橡胶环，内加300μL BBE质量分数为0.5％样品，反应3min后，用生理盐水轻轻冲洗后，观察尿囊膜的反映情况，并按表1对其进行分值评价，再按表2对其进行刺激强度分级。同时利用生理盐水作为阴性对照，0.1M氢氧化钠作为阳性对照，
表1、鸡胚绒毛尿囊膜试验刺激反应评分
表2、眼刺激强度分级
结果如图2所示。结果显示，阴性对照组未引起血管的出血、凝血或血管融解(图2，A)，ES值为0，按表1判定其无刺激性。阳性对照组引起几乎所有血管都出血，有明显得凝血点出现，且有血管融解现象发生(图2，B)，ES值为18，按表1判定其具有强刺激性/腐蚀性。0.5％BBE组引起了小部分小血管融解，其他现象并未出现(图2，C)，ES值为3，按表1判定其无/轻刺激性。
实施例3、僵蚕醇提物BBE功效实验
1、BBE对DPPH·的清除作用
配制初始浓度为5mg/mL的BBE溶液，二倍稀释成6个浓度的样品进行实验，实验结果如图3。结果显示，BBE对DPPH·的清除活性具有浓度依赖性，随浓度的升高，其清除率也在升高。当BBE的浓度从0.156mg/mL增加到5mg/mL时，其清除率也从(10.15±5.62)％增加到了(97.91±1.82)％。经计算，其半数清除浓度HSC50为3.167mg/mL。结果表明，BBE具有较强的DPPH·清除能力。
2、BBE对经LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β的影响
根据BBE的IC50选择了200μg/mL、150μg/mL、10μg/mL、50μg/mL四个浓度进行试验。未经处理的巨噬细胞作为空白对照，地塞米松(DEX)作为阳性对照。结果如图4，LPS组的IL-1β的含量显著高于空白对照组，表明RAW264.7巨噬细胞刺激成功。阳性对照组的IL-1β的含量显著低于LPS组，这与的预期相符。而BBE组相较LPS组未显示出明显变化。表明BBE不能抑制RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子IL-1β，也不会刺激其产生更多IL-1β。
3、BBE对E.coli和S.aureus的抑制作用
利用营养肉汤稀释法检测BBE对E.coli和S.aureus的抑制作用。结果如图5，结果显示BBE对E.coli的抑制作用不强，且抑制率不具有浓度相关性，为(26.76±3.77)％。而BBE对S.aureus则有一个相对较好的抑制作用。BBE的浓度为2.5mg/mL时，对S.aureus的抑制率达到了(93.05±2.52)％。随着BBE浓度的降低，对S.aureus的抑制率也有了一定的下降，表明相比E.coli，BBE对S.aureus具有较强的抑制作用。
4、BBE对P.acnes的抑制作用
利用营养肉汤稀释法检测BBE对P.acnes的抑制作用。结果如图6，结果显示BBE的浓度为2.5mg/mL时，对P.acnes的抑制率为(66.19±10.2)％。随着BBE浓度的降低，对P.acnes的抑制率也有了一定的下降。表明BBE对P.acnes的抑制率具有浓度相关性。
5、BBE对M.furfur的抑制作用
利用琼脂稀释法检测BBE对M.furfur的抑制作用。结果表明0.5％的氟康唑进行处理后，完全抑制了M.furfur的生长(图7，A)。1mL的丙酮并不能抑制M.furfur的生长(图7，B)，说明作为BBE的助溶剂被加入培养基的丙酮对实验结果不会产生影响。6mg/mL、5mg/mL的BBE完全抑制了M.furfur的生长(图7，C和D)。4mg/mL的BBE抑制了一部分M.furfur的生长(图7，E)。3mg/mL的BBE不能抑制M.furfur的生长(图7，F)。说明一定浓度的BBE对M.furfur具有抑制作用。
上述结果表明BBE对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌均具有一定程度的抑制作用。皮肤表面供养了如痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、马拉色菌、表皮葡萄球菌等多种微生物，在合适条件下，这些微生物特别是痤疮丙酸杆菌大量增殖，引发炎症，导致痤疮的发生。因此，BBE既对几种关键菌有抑菌功效，且不会引起皮肤炎症，具有成为痤疮相关化妆品原料的应用潜力。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.僵蚕醇提物，其特征在于，由以下方法制备：将干燥的僵蚕粉分别用体积分数为95％和65％的乙醇溶液作为提取溶剂提取，分别收集提取液，合并提取液，浓缩去除乙醇，干燥，得僵蚕醇提物。
2.根据权利要求1所述僵蚕醇提物，其特征在于：所述僵蚕粉为粒径小于50目的粉末。
3.根据权利要求1所述僵蚕醇提物，其特征在于：所述乙醇溶液按1：20的料液比添加。
4.根据权利要求1所述僵蚕醇提物，其特征在于：所述提取为在18～25℃下提取2h。
5.权利要求1～4任一项所述僵蚕醇提物在制备大肠杆菌抑制剂中的应用。
6.权利要求1～4任一项所述僵蚕醇提物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用。
7.权利要求1～4任一项所述僵蚕醇提物在制备痤疮丙酸杆菌抑制剂中的应用。
8.权利要求1～4任一项所述僵蚕醇提物在制备糠秕马拉色菌抑制剂中的应用。
9.权利要求1～4任一项所述僵蚕醇提物在制备抗痤疮化妆品原料中的应用。
10.权利要求1～4任一项所述僵蚕醇提物在制备抗氧化和抗炎的药物中的应用。
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