RU2624865C1 - Способ получения экстракта из лишайника рода cladonia, обладающего бактерицидными свойствами - Google Patents

Abstract

Изобретение относиться к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения экстракта из лишайников рода Cladonia Hill ex P. Browne, смеси лишайниковых кислот и лихенинов, обладающего бактерицидными свойствами. Способ получения экстракта из лишайника рода Cladonia, обладающего бактерицидными свойствами, включает очистку лишайника от механических примесей, измельчение слоевища лишайника, настаивание с карбонатом натрия, кипячение раствора, фильтрацию, при этом измельченную до порошкообразного состояния лишайниковую массу заливают 10-кратным по отношению к массе объемом 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа, после чего полученный раствор охлаждают и засыпают измельченным карбонатом натрия в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы, затем раствор настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С, после настаивания раствор нагревают до кипения и фильтруют в горячем виде. Вышеописанный способ является исчерпывающим и позволяет получить экстракт с высокими бактерицидными свойствами. 3 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к фармации, и предназначено для получения экстракта (смеси лишайниковых кислот и лихенинов), обладающего бактерицидными свойствами, из лишайника рода Cladonia Hill ex P. Browne.

Органические специфические гипоаллергенные вещества лишайников (лихенины, или, лишайниковый крахмал, и лишайниковые кислоты), не синтезирующиеся другими организмами, потенциально являются перспективными для поиска и получения новых биологически активных веществ, способных подавлять рост и снижать жизнеспособность болезнетворных и постоянно мутирующих микроорганизмов, приспособившихся к уже известным видам антибиотических средств [Муравьева Д.А. Фармакогнозия. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.]. Лишайниковые вещества практически не имеют побочных эффектов, не вызывают аллергических реакций, раздражения и ожогов кожных покровов, не несут раздражающего эффекта для ЦНС. Их применение не ограничено хроническими заболеваниями печени и почек, желудочно-кишечного тракта, ОРЗ, ОРВИ [Аньшакова В.В. Разработки на основе лишайникового сырья (твердофазные биопрепараты) / В.В. Аньшакова, А.В. Степанова, А.Ш. Смагулова и др. // Вестник спортивной науки. – 2013. - №6. - С. 28-30; Грибова Н.А. Применение новой пищевой добавки для приготовления кондитерских изделий / Н.А. Грибова, Н.Л. Султаева // Сервис в России и за рубежом. – 2014. - №2 (49). - С. 109-115; Степанова А.В. Токсикологическая и гигиеническая оценка БАД «Ягель Детокс» / А.В. Степанова, В.В. Аньшакова // Фундаментальные исследования. Биологические науки. - №9. - 2014. - С. 105-109].

Известно несколько способов получения экстрактов, обладающих бактерицидными свойствами, из слоевищ лишайников различных видов.

Известен способ получения экстракта из дубового мха (Evernia prunastri (L.) Ach.), включающий измельчение сырья, экстракцию гексаном и этиловым спиртом, однократное настаивание в течение 5 часов при температуре кипения этилового спирта, фильтрацию, 2-3-кратное промывание отработанного сырья С₂Н₅ОН и концентрирование [Патент 2348683 РФ, МПК С11В 1/10, С11В 9/02, бюл. №7, 10.03.2009 г. Способ получения экстракта из дубового мха].

Недостатками данного способа являются его нерентабельность и малый выход конечного продукта - смеси органических кислот, фосфолипидов и глицеридов с побочными продуктами экстракции. Использование гексана в больших количествах по отношению к массе обрабатываемого сырья повышает себестоимость предложенного способа, а малый выход экстракта не предполагает промышленное внедрение. На втором этапе обработки лишайникового сырья требуется большое количество этилового спирта (соотношение массы сырья к объему спирта составляет 1:9) и последующая промывка С₂Н₅ОН, что также повышает себестоимость данного способа.

Известен способ получения сухого экстракта Cetraria islandica (L.) Ach. этиловым спиртом с концентрацией от 35% до 45% [Патент 2321419 РФ, МПК А61K 36/09, А61K 9/20, бюл. №10, 10.04.2008 г. Экстракт Cetraria islandica (L.) Ach. сухой, таблетированная форма].

К недостатку данного способа следует отнести сложность его выполнения, поскольку заморозка и разморозка, повышающая конечный продукт экстракции, являются достаточно энергоемкими процессами.

Наибольшее влияние на процесс извлечения оказывают степень измельчения сырья, время и количество экстракций. С увеличением времени и кратности этилового спирта заметна тенденция к уменьшению доли полисахаридов в экстрактивных веществах. Интенсификация процесса ведет к неконтролируемому изменению нативного комплекса биологически активных веществ за счет разрушения гемицеллюлоз, так экстракция 70% и 96% растворами этанола приводит к увеличению токсичности раствора. Поэтому способ не является достаточно универсальным и в каждом разном случае дает разный выход экстрактивных веществ.

Известен способ получения усниновой кислоты экстракцией смеси лишайников родов Usnea и Cladonia органическими растворителями (хлороформом, четыреххлористым углеродом, ацетоном, гексаном, петролейным эфиром, нефрасом и смесью перечисленных растворителей) с последующим выделением целевого продукта путем упаривания органического растворителя и осаждения из экстракта в системе хлороформ-спирт (1:10) или из гексана [Патент 2317076 РФ, МПК А61K 31/343, А61К 36/09, бюл. №5, 20.02.2008 г. Способ получения усниновой кислоты].

К недостатку данного способа следует отнести то, что исходное сырье - сумма из более чем 10 видов лишайников родов Usnea и Cladonia - собрано в разных экотопах, и установление того вида лишайника, который является главным источником основного действующего вещества, что будет экскретироваться, весьма затруднительно, а сбор всех, задействованных в способе видов, в других экологических условиях практически невозможен. Использование нескольких органических растворителей и последующее их выпаривание делает способ затратным.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения лихенина [Патент 2129159 РФ, МПК С12Р 19/02, С12Р 19/04, С08В 37/00, Бюл. №5, 20.04.1999 г. Способ получения лихенина из лишайника], включающий стадии очистки лишайника от механических примесей, измельчение его до частиц размером 10-15 мм, отстаивание слоевища лишайника в воде при комнатной температуре в течение 24 часов и нейтрализацию лишайниковых кислот раствором Na₂CO₃, промывку растительной массы водой до нейтральной реакции и повторное измельчение таллома до частиц размером 3-5 мм. После этого лихенин экстрагируют, фильтруют, очищают и сушат распылением или сублимацией. Данный способ взят за прототип.

Общим с заявляемым способом является получение лихенина, а именно очистка лишайника от механических примесей, измельчение слоевища лишайника, настаивание с карбонатом натрия (Na₂CO₃), кипячение раствора и фильтрация.

К недостаткам прототипа следует отнести продолжительность его исполнения. В общей сложности на проведение экстрагирования требуется 2 суток, а для нейтрализации лишайниковых кислот требуется 20-кратный по отношению к массе сырья объем Na₂CO₃ в трех повторностях, после чего этот раствор сливают и больше не используют, что повышает себестоимость способа. В итоге полученный экстракт содержит только растворенный лехинин без лишайниковых кислот и не обладает бактерицидными свойствами.

Задачей предлагаемого способа является получение экстракта (смеси лишайниковых кислот и лихенинов) из лишайника рода Cladonia Hill ex P. Browne, обладающего бактерицидными свойствами.

Поставленную задачу достигают тем, что слоевище лишайника предварительно промывают проточной водой, измельчают до порошкообразного состояния, кипятят в течение 1 часа в 10-кратном по отношению к полученной массе измельченного лишайника объеме 96% этилового спирта, затем полученный раствор охлаждают и засыпают измельченным Na₂CO₃ в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы, затем настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С, после настаивания раствор нагревают до кипения и фильтруют в горячем виде.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. Сухой лишайник, предварительно очищенный от механических примесей, и слоевище которого промыто, измельчают до порошкообразного состояния.

Измельченную лишайниковую массу заливают 10-кратным по отношению к массе объемом 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа для экстракции спирторастворимых лишайниковых кислот. Так как не все кислоты способны растворятся в спиртовой среде и большинство из них (усниновая, эверновая, физодовая, атранорин и др.) растворяются в бензоле, хлороформе, амиловом спирте, ледяной уксусной кислоте, едких щелочах и барите, то для преобразования лишайниковых кислот в водорастворимые формы без потери их бактерицидных свойств получают их натриевые соли. Для этого спиртовой раствор после кипячения охлаждают в холодильнике до 17°С и засыпают измельченным Na₂CO₃ в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы. Реакция проходит на холоде, поэтому раствор настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С. Так как натриевые соли и лихенины хорошо растворяются в горячем этиловом спирте, далее раствор нагревают до кипения и в горячем виде фильтруют.

Возможность осуществления заявляемого способа показана следующим примером. Сухой лишайник из рода Cladonia (Cl. arbuscula (Wallr.) Hale et WL Culb.) в количестве 10 грамм, предварительно очищенный от механических примесей и промытый в проточной воде, измельчают до порошкообразного состояния. Измельченную лишайниковую массу заливают 100 мл 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа для экстракции спирторастворимых лишайниковых кислот и лихенинов, после чего раствор охлаждают в холодильнике до 17°С. Для исчерпывающей экстракции нерастворимых лишайниковых кислот в приготовленный охлажденный раствор добавляют 10 грамм измельченного Na₂CO₃ для получения растворимых натриевых солей лишайниковых кислот. После пятичасового настаивания при температуре 5-7°С раствор нагревают до кипения для максимального извлечения солей лишайниковых кислот из слоевища. Далее в горячем виде фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Полученный таким способом экстракт - смесь натриевых солей лишайниковых кислот и лихенинов, обладающий бактерицидными свойствами - имеет темно-коричнево-зеленый цвет из-за растворенных в спирте пигментов слоевища лишайника, не обезвоживается и хранится в герметично закрытой посуде в холодильнике. Используется в разведенном виде в соотношении 5 мл экстракта на 250 мл дистиллированной воды.

Для подтверждения бактерицидных свойств полученного экстракта было проведено опрыскивание изолированных помещений одинаковых по площади (18 м²) и объему пространства (54 м³), но различающихся обсемененностью микроорганизмами. По степени биологического загрязнения воздуха помещения условно были разделены на три группы: сильный, средний и незначительный уровни загрязнения.

Высев микроорганизмов в изолированной среде проводили по методу Коха в чашки Петри, по пять чашек на каждое исследуемое нами помещение (первую чашку использовали как контроль, четыре последних - экспериментальные), после чего культивировали в течение 3 суток в термостате при температуре 37°С.

После добавления полученных нами экстрактов лишайника по 15, 20, 25, 30 мл в каждую из экспериментальных чашек Петри, полученных из исследуемых нами помещений, и культивировании высевов сразу всех чашек каждого помещения (4 экспериментальных и 1 контрольная) в термостате при температуре 37°С еще в течение 3 суток, было замечено подавление развития и частичное уменьшение размера колоний микроорганизмов в каждой из экспериментальных чашек по сравнению с контролем (табл. 1).

Полученные данные сравнивали с результатами аналогичного эксперимента, в котором использовали экстракт, полученный согласно способа прототипа [Патент 51708 Украина. МПК А01В 79/00, бюл. №14, 26.07.2010 г. Способ аэросанации изолированной среды с помощью экстрактов лишайников].

После приготовления экстракта лишайника Cladonia arbuscula, из жидкостного пневматического распылителя (производительность которого составляет 20 мл/мин) было проведено опрыскивание исследуемых помещений (из расчета 2,5-3,0 мл экстракта на 1 м³ помещения) и повторный высев микроорганизмов из воздуха каждые 2, 24, 36, 48 часа дезинфекционной выдержки. Полученные результаты представлены в таблицах 2, 3.

Таким образом, проведенные нами исследования доказывают тот факт, что предлагаемый способ получения экстракта из лишайника рода Cladonia Hill ex P. Browne, смеси лишайниковых кислот и лихенинов, является наиболее эффективным по сравнению с известными аналогами, и позволяет проводить исчерпывающую экстракцию веществ, обладающих повышенными бактерицидными свойствами и сразу готовых к применению. Положительный эффект предлагаемого способа заключается в его дешевизне, простоте и минимизации времени осуществления экстракции. Способ может быть использован для производства санирующих средств.

Claims (1)

1. Способ получения экстракта из лишайника рода Cladonia, обладающего бактерицидными свойствами, включающий очистку лишайника от механических примесей, измельчение слоевища лишайника, настаивание с карбонатом натрия, кипячение раствора, фильтрацию, и отличающийся тем, что измельченную до порошкообразного состояния лишайниковую массу заливают 10-кратным по отношению к массе объемом 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа, после чего полученный раствор охлаждают и засыпают измельченным карбонатом натрия в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы, затем раствор настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С, после настаивания раствор нагревают до кипения и фильтруют в горячем виде.