CN111481640B - 抗肝癌微乳纳米组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗肝癌微乳纳米组合物及其应用，以淫羊藿素及薏苡仁油作为原料药，薏苡仁油和短链油为油相，加入混合表面活性剂和助表面活性剂组成微乳纳米组合物。本发明采用短链油与薏苡仁油为混合油相和混合表面活性剂构建的微乳纳米组合物可以显著提高淫羊藿素与薏苡仁油的协同抗肝癌疗效，同时提高药物的载药量，降低辅料用量，促进药物吸收，提高制剂的稳定性。

Description

抗肝癌微乳纳米组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种淫羊藿素、薏苡仁油组成的微乳纳米组合物，该纳米组合物将水不溶性药物淫羊藿素与薏苡仁油制备成微乳制剂。本发明还涉及这种微乳纳米组合物在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

原发性肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率及高死亡率的特点。

目前，国内外关于肝癌的治疗方法主要是手术切除及放疗、化疗，毒副作用较大，患者的生存率较低，亟需研发高效低毒的抗肝癌药物应用于临床。以“祛邪扶正”为特色的传统中药在治疗肝癌方面有独特优势，其疗效不仅可靠，而且毒副作用小，增加了对机体用药的安全性，且与放、化疗并用可起到减毒增效的作用。

淫羊藿素是来源于中药淫羊藿中的一种黄酮成分，现代药理研究表明，淫羊藿素对肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤均有抑制作用，尤其抗肝癌效果较好，但因其难溶，口服吸收较差，生物利用率低，因此目前还没有相关制剂应用于临床。薏苡仁油是从薏苡仁中提取得到的一类油脂性成分，文献报道其对中晚期肿瘤患者具有一定的抗恶病质和止痛效果，可以提高患者免疫力及生活质量。应用于临床的康莱特注射液的主要成分就是薏苡仁油，其在临床用于原发性非小细胞肺癌及原发性肝癌的治疗，配合放、化疗有一定的增效作用。同样，薏苡仁油水溶性较差，口服难吸收，口服疗效不能充分发挥。

本课题组经过长期大量的实验研究发现薏苡仁油和淫羊藿素配伍制备成微乳后可以显著提高二者的协同抗肝癌活性，经处方优选过的薏苡仁油和淫羊藿素配伍制备而成微乳具有开发成抗原发性肝癌药物的应用前景。

经检索，现有技术已有对淫羊藿素或薏苡仁油抗肿瘤的相关制剂报道。有关薏苡仁油的中国专利申请有：一种薏苡仁油口服纳米粒及其制备方法(201410355208.5)，一种治疗前列腺疾病的薏苡仁油软胶囊及其应用(02137311.6)，一种薏苡仁油微乳的制备方法(2010101934956.6)，一种薏苡仁油自乳化剂及其制备方法(200710027400.1)等。有关淫羊藿素的专利有：一种淫羊藿素脂质体及其制备方法(201110061635.9)，一种淫羊藿苷元口服胶束制剂的制备方法(201810706803.7)，一种淫羊藿苷元制剂(201711043933.9)，一种淫羊藿苷元片剂(201510055573.9)，一种淫羊藿苷元口服制剂及其制备方法(201410472796.0)，淫羊藿苷元微乳剂及其制备方法(200910029928.1)，淫羊藿苷元脂质体及其制备方法(200910025047.2)等。

现有文献也有分别对淫羊藿素与薏苡仁油抗肝癌作用的报道。但不管是现有专利和还是现有文献，国内外目前尚无将淫羊藿素与薏苡仁油两者配伍并以微乳为载体显著提高抗肝癌效果的专利及文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肝癌作用的微乳纳米组合物，以及该纳米组合物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明将水不溶性药物淫羊藿素及薏苡仁油二者配伍并制备成微乳纳米制剂，采用短链油与薏苡仁油为混合油相和混合表面活性剂构建的微乳纳米组合物可以显著提高制剂的协同抗肝癌疗效，提高药物的载药量，降低辅料用量，促进药物吸收，提高制剂的稳定性。

本发明的第一个发明目的是通过以下的技术方案来实现的：

一种抗肝癌微乳纳米组合物，以淫羊藿素及薏苡仁油作为原料药，其中薏苡仁油兼做油相，加入短链油组成混合油相，采用混合表面活性剂和助表面活性剂组成的混合物作为药物的载体。

其中，各组分重量份如下：

淫羊藿素1-10份，薏苡仁油40-250份，短链油相10-90份，混合表面活性剂100-340份，助表面活性剂35-115份。

各组分重量份的优化比例是：

淫羊藿素3-8份，薏苡仁油100-200份，短链油相20-70份，混合表面活性剂155-285份，助表面活性剂55-95份。

各组分重量比的最优比例是：

淫羊藿素5-7份，薏苡仁油150-170份，短链油相30-50份，混合表面活性剂210-240份，助表面活性剂65-85份。

进一步的，组分中淫羊藿素和薏苡仁油的重量比为1：20～50；优选1：30。

上述的短链油采用甘油三丁酸酯、甘油三乙酸酯、甘油三丙酸酯中的一种；优选甘油三丁酸酯。

上述混合表面活性剂采用吐温80、蓖麻油聚烃氧酯35(ELP 35)、聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH 40)、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯(HS 15)、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(GTCC)中任意两种。

优选的，所述的混合表面活性剂选用聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯与聚氧乙烯40氢化蓖麻油或聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯与吐温80。

优选的，所述混合表面活性剂选用聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯与聚氧乙烯40氢化蓖麻油，其重量份比例优选：聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯：聚氧乙烯40氢化蓖麻油＝1：0.5～2。

上述的助表面活性剂采用PEG-400、PEG-300、异丙醇中的一种；优选PEG-400。

本发明基于中医药理论的指导，结合中药多组分多靶点及配伍给药的用药特点设计出一种多组分微乳纳米载药系统。配伍是中医药用药的一大特色，申请人通过大量的体内外筛选实验发现淫羊藿素与薏苡仁油在特定比例下配伍制备成微乳，抗肿瘤效果显著优于单一成分用药及两种成分直接配伍用药，显示出极强的协同抗肝癌作用。

本发明针对淫羊藿素、薏苡仁油的理化性质，采用适合中药多组分的微乳作为载体，通过大量的油相、表面活性剂、助表面活性剂的筛选试验克服了多组分难以制备成微乳的技术难点，将淫羊藿素和薏苡仁油作为药物，薏苡仁油和短链油做混合油相，选择适宜的混合表面活性剂及助表面活性剂，制备中药多组分载药的微乳给药系统，该给药系统既发挥了淫羊藿素、薏苡仁油配伍协同抗肿瘤作用，同时降低了辅料的用量，用药安全，且生产成本低。体内外药效学实验表明与单一成分相比，按最佳比例配伍制备的淫羊藿素、薏苡仁油组分微乳纳米组合物的抑瘤率最高。

上述组合物的制备步骤如下：

1)取混合油相加入至混合表面活性剂中，室温搅拌2-8h至完全混匀，取助表面活性剂至上述混合体系中，继续室温搅拌2-6h，备用；

2)取淫羊藿素加入至上述制备的混合体系中，磁力搅拌2-8h，直至无不溶物悬浮于体系，备用；

3)将去离子水恒速、缓慢并定量地滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌体系，直至出现透亮澄明的体系。

本发明的第二目的在于提供上述微乳纳米组合物在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明所制备的抗肝癌微乳纳米组合物的有益效果表现在如下几方面；

1、本发明克服了淫羊藿素和薏苡仁油的口服吸收较差、生物利用度低的缺陷，在中医药理论的指导下，充分应用了中医药配伍理论，将淫羊藿素与薏苡仁油制备成微乳，发挥协同的抗肿瘤药效。

2、本发明使用薏苡仁油和短链油作为混合油相，使用混合表面活性剂增溶，不仅提高了药物的溶解度及微乳的载药量，提高了微乳的稳定性，同时减少了辅料的用量，可降低口服剂量，节约制剂生产成本。

3、本发明所选用的表面活性剂及助表面活性剂，具有安全、无毒、无刺激性等优点，所制备成的微乳粒径较小，在10-100nm之间，有利于吸收，抗肿瘤效果较好。

4、本发明提供的制剂制备方法简单，无需特殊设备即可完成，容易实现工业化大生产。

附图说明

图1为实施例1制备的淫羊藿素、薏苡仁油微乳纳米组合物形成的溶液的粒径分布图。

图2是甘油三丁酸酯和淫羊藿素的结构图(A甘油三丁酸酯，B淫羊藿素)。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但应注意本发明的范围并不受这些实例的任何限制。

实施例1

处方：淫羊藿素5份，薏苡仁油162份，甘油三丁酸酯38份，HS15150份，RH4075份，PEG 40075份。

取薏苡仁油和短链油加入至混合表面活性剂中，室温搅拌2-8h至完全混匀，取助表面活性剂至上述混合体系中，继续室温搅拌2-6h，备用；然后取淫羊藿素加入至上述制备的混合体系中，磁力搅拌2-8h，直至无不溶物悬浮于体系，备用；最后将去离子水恒速、缓慢并定量地滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌体系，直至出现透亮澄明的体系。

实施例2

处方：淫羊藿素1份，薏苡仁油40份，甘油三丁酸酯10份，吐温8065份，ELP3535份，聚乙二醇30035份。

制备方法同实施例1。

实施例3

处方：淫羊藿素10份，薏苡仁油250份，甘油三乙酸酯90份，HS15225份，GTCC 115份，聚乙二醇300115份。

制备方法同实施例1。

实施例4

处方：淫羊藿素3份，薏苡仁油200份，甘油三丙酸酯70份，RH40190份，吐温8095份，异丙醇95份。

制备方法同实施例1。

实施例5

处方：淫羊藿素8份，薏苡仁油100份，甘油三乙酸酯20份，ELP3555份，HS15100份，异丙醇55份。

制备方法同实施例1。

实施例6

处方：淫羊藿素5份，薏苡仁油150份，-甘油三丁酸酯30份，HS15140份，吐温8070份，异丙醇65份。

制备方法同实施例1。

实施例7

处方：淫羊藿素7份，薏苡仁油170份，甘油三乙酸酯50份，ELP35160份，GTCC 80份，PEG 30085份。

制备方法同实施例1。

实施例8

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素5份，薏苡仁油162份，短链油38份，混合表面活性剂225份，助表面活性剂75份。

所述的混合表面活性剂选自下列二种的组合物：吐温80、蓖麻油聚烃氧酯35、聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯。

所述的助表面活性剂选自下列之一：聚乙二醇300、聚乙二醇400、异丙醇。

所述的短链油选自下列之一：甘油三丁酸酯、甘油三乙酸酯、甘油三丙酸酯。

实施例9

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素1份，薏苡仁油40份，短链油90份，混合表面活性剂100份，助表面活性剂115份。

所述的混合表面活性剂选自下列之二的组合物：吐温80、蓖麻油聚烃氧酯35、聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯

所述的助表面活性剂选自下列之一：聚乙二醇300、聚乙二醇400、异丙醇。

所述的短链油选自下列之一：甘油三丁酸酯、甘油三乙酸酯、甘油三丙酸酯。

实施例10

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素10份，薏苡仁油250份，短链油10份，混合表面活性剂340份，助表面活性剂35份。

所述的混合表面活性剂选自下列之二的组合物：吐温80、蓖麻油聚烃氧酯35、聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯

所述的助表面活性剂选自下列之一：聚乙二醇300、聚乙二醇400、异丙醇。

所述的短链油选自下列之一：甘油三丁酸酯、甘油三乙酸酯、甘油三丙酸酯。

实施例11

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素9份，薏苡仁油220份，短链油80份，混合表面活性剂250份，助表面活性剂105份。

实施例12

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素3份，薏苡仁油100份，短链油20份，混合表面活性剂285份，助表面活性剂95份。

实施例13

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素8份，薏苡仁油200份，短链油70份，混合表面活性剂155份，助表面活性剂55份。

实施例14

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素7份，薏苡仁油180份，短链油60份，表面活性剂195份，助表面活性剂90份。

实施例15

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素5份，薏苡仁油150份，短链油50份，混合表面活性剂210份，助表面活性剂65份。

实施例16

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素6份，薏苡仁油165份，短链油45份，混合表面活性剂240份，助表面活性剂85份。

实施例17

与实施例1基本相同，但各组分重量份如下：淫羊藿素7份，薏苡仁油170份，短链油30份，混合表面活性剂240份，助表面活性剂65份。

实施例18

本实施例具体说明淫羊藿素在不同辅料中的溶解度。

表1淫羊藿素在单油相中的溶解度(n＝3)

表2淫羊藿素在混合油相中的溶解度(n＝3)

由表1可知，油的链长和不饱和度对淫羊藿素的溶解度起着关键作用，其中短链饱和油显著增加淫羊藿素的溶解度，而淫羊藿素在不饱和油中的溶解度较低。短链饱和油增溶原理可能是短链油(以甘油三丁酸酯为例)中的三个羰基和淫羊藿素分子中的三个羟基恰好形成三个新的氢键，起到促溶作用(图2)。辛酸/葵酸三甘油酯(中链饱和油，20.09μg·mL^-1)和甘油三油酸酯(长链不饱和油，7.87μg·mL^-1)中也有三个羰基，但对淫羊藿素的促溶作用不大，原因可能是长碳链产生了空间位阻，影响羰基与羟基的分子间相互作用。

薏苡仁油含有大量的不饱和脂肪酸，包括甘油三亚油酸酯、1,2亚油酸-3-油酸甘油酯、甘油三油酸酯，这将不利于淫羊藿素的溶解，也有可能导致微乳载药量低，体系不稳定。为了解决此问题，我们测定了淫羊藿素在薏苡仁油-短链饱和油中的溶解度。结果(表2)显示，与单一油(薏苡仁油)的溶解度(11.62μg·mL^-1)相比，淫羊藿素在薏苡仁油-短链饱和油中的溶解度有较大的提高，这表明添加短链饱和油对淫羊藿素在薏苡仁油中有较大的增溶作用。但是，从表2可知，随着薏苡仁油在混合油相中的比例增大，淫羊藿素在薏苡仁油-甘油三乙酸酯和薏苡仁油-甘油三丙酸酯中的溶解度也随之下降，而淫羊藿素在薏苡仁油-甘油三丁酸酯中的溶解度几乎不变。此外，薏苡仁油既为药物又具有辅料作用，且与淫羊藿素配伍具有协同抗肿瘤作用。因此，为了在后续制剂中，薏苡仁油在混合油相中所占比例尽可能大，以减少其它油类辅料用量，选择甘油三丁酸酯与薏苡仁油配合使用。

对于表面活性剂，由表3可知，淫羊藿素在RH40、HS15、吐温80中的溶解度(110～150μg·mL^-1)，均高于其它表面活性剂。同时，从表4中还可知，与单一表面活性剂的溶解度相比，淫羊藿素在混合表面活性剂中溶解度(>215μg·mL^-1)有极大的提高，其中在比例为2:1的HS15-RH40混合表面活性剂中的溶解度最大(255.23μg·mL^-1)。因此，最优混合表面活性剂组合是重量比为2：1的HS15-RH40。

表3淫羊藿素在表面活性剂中的溶解度

表面活性剂	溶解度/μg·mL<sup>-1</sup>
		聚氧乙烯40氢化蓖麻油	112.22±0.34
聚乙二醇15羟基硬脂酸酯	150.97±7.52
		聚氧乙烯35蓖麻油	102.66±4.94
辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯	107.83±1.63
		吐温80	120.00±0.97

表4淫羊藿素在混合表面活性剂中的溶解度

实施例19

本实施例主要说明混合油相与混合表面活性剂有助于提高微乳的载药量，其中助表面活性剂使用PEG-400。

表5不同微乳处方的比较

由表5可知，采用薏苡仁油-甘油三丁酸酯作为混合油相，HS15-RH40作为混合表面活性剂，提高了微乳的载药量。

实施例20

在细胞水平上比较各组分及微乳纳米组合物对肿瘤细胞生长的抑制作用。

细胞株：人肝癌HepG2细胞株。

选用HepG2人肝癌细胞株为模型，通过MTT试验比较了淫羊藿素、薏苡仁油、组分配伍混悬液及微乳纳米组合物对细胞增殖的抑制作用，以半数抑制浓度IC₅₀和协同指数CI为指标，比较各组的抗肿瘤活性大小，结果见表6。

表6淫羊藿素、薏苡仁油、配伍混悬液及其微乳对HepG2细胞抑制作用(n＝6)

¹表明薏苡仁油混悬液给药浓度与淫羊藿素-薏苡仁油微乳(1:20)中的给药浓度一样。

²表明薏苡仁油混悬液给药浓度与淫羊藿素-薏苡仁油微乳(1:30)中的给药浓度一样。

³表明薏苡仁油混悬液给药浓度与淫羊藿素-薏苡仁油微乳(1:40)中的给药浓度一样。

⁴表明薏苡仁油混悬液给药浓度与淫羊藿素-薏苡仁油微乳(1:50)中的给药浓度一样。

体外抗肿瘤实验结果表明：与单个组分相比，淫羊藿素、薏苡仁油两组分配伍的混悬液的IC₅₀值虽有所降低，但协同指数CI值均大于1，并没有显示出配伍协同作用。而制备成微乳后，淫羊藿素-薏苡仁油微乳能够显著降低药物的IC₅₀值，当淫羊藿素-薏苡仁油微乳用量比例为1:30时，IC₅₀约为混悬液的1/4，协同指数下降至0.29，体现出显著的两组分协同配伍的抗肝癌效果。

实施例21

采用动物模型对淫羊藿素、薏苡仁油微乳纳米组合物的抗肿瘤作用进行药效评价。

将细胞密度调至为1×10⁷个/mL的HepG2细胞悬液接种于裸鼠右腿部皮下，每只0.2mL。接种后次日，称重，随机分组，每组6只。空白对照组：生理盐水，每日0.2mL/次；药物组：淫羊藿素混悬液，薏苡仁油混悬液、淫羊藿素+薏苡仁油(重量比1:30)混悬液、淫羊藿素+薏苡仁油(重量比1:30)组成的微乳纳米组合物，淫羊藿素给药剂量为2.5mg/kg，薏苡仁油给药剂量为75mg/kg，每日0.2mL/次。全部为灌胃给药。连续给药14d，期间每天称重，观察小鼠的一般活动、毛发等状况。停药次日，称重，脱颈处死小鼠，剥离腋下肿瘤。计算瘤重及抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。

实验结果：淫羊藿素混悬液，薏苡仁油混悬液、淫羊藿素+薏苡仁油(重量比1:30)混悬液、淫羊藿素+薏苡仁油(重量比1:30)组成的微乳纳米组合物抑瘤率分别为：50.1％、40.6％、57.4％、78.9％。结果表明与生理盐水组比较，本发明所得到的淫羊藿素-薏苡仁油微乳纳米组合物对体内小鼠肿瘤的生长均有显著性抑制作用，且微乳纳米组合物的抗肿瘤效果要远优于混悬液。说明将本药物组合物中的有效组分制备成微乳，可以更好地发挥协同抗肿瘤作用。

Claims (6)

1.一种抗肝癌微乳纳米组合物，其特征在于，以淫羊藿素及薏苡仁油作为原料药，薏苡仁油与短链油作为混合油相，加入混合表面活性剂和助表面活性剂组成；各组分重量份如下：

淫羊藿素1-10份，薏苡仁油40-250份，短链油相10-90份，混合表面活性剂100-340份，助表面活性剂35-115份；

组分中淫羊藿素和薏苡仁油的重量比为1：20~50；

所述的短链油采用甘油三丁酸酯、甘油三丙酸酯中的一种。

2.根据权利要求1所述的微乳纳米组合物，其特征在于，组分中淫羊藿素和薏苡仁油的重量比为1：30。

3.根据权利要求1所述的微乳纳米组合物，其特征在于，所述的短链油采用甘油三丁酸酯。

4.根据权利要求1所述的微乳纳米组合物，其特征在于，所述的混合表面活性剂选用聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯与聚氧乙烯40氢化蓖麻油，其重量份配比为聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯：聚氧乙烯40氢化蓖麻油=2：1。

5.根据权利要求1所述的微乳纳米组合物，其特征在于，所述的助表面活性剂采用PEG-400、PEG-300、异丙醇中的一种。

6.权利要求1-5任一项所述微乳纳米组合物在制备抗肝癌口服药物中的应用。

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