CN111467407A - 黑老虎果实提取物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黑老虎果实提取物的新用途，具体公开了黑老虎果实醇提取物在制备抗腹泻药物中的应用。本发明以乙醇或甲醇对黑老虎果实进行超声提取，再采用大肠埃希菌、番泻叶刺激建立小鼠腹泻模型以研究黑老虎果实提取物抗腹泻作用。通过腹泻潜伏时间，小鼠腹泻率和腹泻指数检测得知，黑老虎果实提取物具有明显有抗腹泻作用，为制备抗腹泻药物提供了依据。

Description

黑老虎果实提取物的新用途

技术领域

本发明涉及黑老虎果实提取物的利用，具体涉及黑老虎果实提取物的抗腹泻作用，能用于制备抗腹泻药物。

背景技术

黑老虎(Kadsura coccinea.)为五味子科南五味子属常绿木质藤本植物，别名冷饭团、过山龙藤、血藤泡、布福娜等，多生于我国江西、湖南、广东、福建、广西、四川、贵州、云南等地。药用部位包括根、茎及果实。

据《中国植物志》记载，黑老虎根药用，能行气活血，消肿止痛，治胃病，风湿骨痛，跌打瘀痛，并为妇科常用药。现代医学研究中，对黑老虎根的研究也多，如，王楠等研究发现从黑老虎根中分离得到的部分羊毛脂烷型三萜类化合物具有体外抗肿瘤活性和抗血小板聚集活性作用；王来友等发现黑老虎根提取物具有调节酒精性脂肪肝和保肝的作用等；黄小春等对不同产地黑老虎根薄层色谱进行研究。

而黑老虎果实可食用部分通常只有果实总重的30-40％，每粒果肉外包裹厚厚的果皮，除了果肉作为水果食用外，果皮通常被丢弃。目前，人们对黑老虎果实的认识、加工、利用不够，对其研究很少，查阅文献，未见黑老虎果实提取物抗腹泻作用的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种黑老虎果实提取物的新用途，具体为黑老虎果实提取物抗腹泻方面的应用。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：黑老虎果实提取物在制备抗腹泻药物中的应用，其中，该提取物为醇提取物。

上述提取物是按如下步骤制备得到：

a.于破碎后的黑老虎果实中加入低级醇提取，得滤液；具体地，是指于破碎后的黑老虎果实中加入低级醇，超声提取后离心、过滤，滤液备用，滤渣再加入低级醇，超声提取后离心、过滤，取滤液，合并二次的滤液；其中，低级醇为乙醇或甲醇；

b.将滤液减压回收低级醇后冷冻干燥，即得黑老虎果实提取物。

上述步骤a中低级醇的质量浓度为40-70％，加入量为1g黑老虎果实或1g滤渣加3-6ml低级醇；较佳的，低级醇的质量浓度为40-55％或55-70％。

上述步骤a中超声提取的温度为15℃-45℃，提取次数为1-2次，每次提取时间为30-60min。

上述步骤b中减压回收低级醇的温度为50℃-55℃。

本发明先对黑老虎果实以乙醇/甲醇进行超声提取，再采用大肠埃希菌、番泻叶刺激建立小鼠腹泻模型以研究黑老虎果实提取物抗腹泻作用。通过腹泻潜伏时间、小鼠腹泻率和腹泻指数检测可知，黑老虎果实提取物高剂量能明显增加细菌性腹泻模型小鼠腹泻潜伏时间，能明显减少腹泻指数；黑老虎果实低、中、高剂量能明显减少番泻叶致小鼠腹泻模型稀便数量，降低腹泻率。表明黑老虎果实提取物具有明显抗腹泻作用，为制备抗腹泻药物提供依据，并可进一步考虑用于制作治疗动物腹泻的饲料添加剂。

具体实施方式

实施例1黑老虎果实提取物的制备

取新鲜的黑老虎果实，洗净，切碎，按1g黑老虎果实加3ml乙醇的比例加入70％质量浓度的乙醇，于15℃超声提取1次，每次提取60min，离心，过滤，滤液备用，滤渣再按1g滤渣加6ml乙醇的比例加入40％质量浓度的乙醇，于45℃超声提取2次，每次提取30min，离心，过滤，取滤液，合并二次的滤液；将合并后的滤液于55℃减压回收乙醇，冷冻干燥，即得黑老虎果实提取物。

实施例2黑老虎果实提取物的制备

取新鲜的黑老虎果实，洗净，切碎，按1g黑老虎果实加6ml甲醇的比例加入40％质量浓度的甲醇，于45℃超声提取2次，每次提取30min，离心，过滤，滤液备用，滤渣再按1g滤渣加3ml甲醇的比例加入70％质量浓度的甲醇，于15℃超声提取1次，每次提取60min，离心，过滤，取滤液，合并二次的滤液；将合并后的滤液于50℃减压回收甲醇，冷冻干燥，即得黑老虎果实提取物。

实施例3黑老虎果实提取物的制备

取新鲜的黑老虎果实，洗净，切碎，按1g黑老虎果实加5ml乙醇的比例加入55％质量浓度的乙醇，于30℃超声提取2次，每次提取45min，离心，过滤，滤液备用，滤渣再按1g滤渣加5ml乙醇的比例加入55％质量浓度的乙醇，于30℃超声提取1次，每次提取45min，离心，过滤，取滤液，合并二次的滤液；将合并后的滤液于52℃减压回收乙醇，冷冻干燥，即得黑老虎果实提取物。

实施例4黑老虎果实提取物的抗腹泻作用

采用大肠埃希菌、番泻叶刺激建立小鼠腹泻模型以研究黑老虎果实提取物抗腹泻作用。

1.1供试品

黑老虎果实提取物，按实施例1的方法制备得到。

1.2阳性对照品

肠炎宁胶囊，批号：190203，海南葫芦娃药业集团股份有限公司产品。

1.3实验动物

雄性ICR小鼠210只，雌性ICR小鼠40只，体重：18.0-22.0g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，动物质量合格证号：1107272011000001，1107272011000003，1107272011000329，在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2015-0016。

1.4主要试剂

羧甲基纤维素钠，批号：20170915，阿拉丁产品。

1.5主要仪器

ME2002E型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。

2试验方法

2.1黑老虎果实提取物对小鼠细菌性腹泻模型的影响

ICR小鼠60只，雄性，体重：18.0-22.0g，按体重随机分为6组，分别为：正常对照组、模型对照组、肠炎宁胶囊组、黑老虎果实提取物低、中、高剂量组，每组10只。各组小鼠每天灌胃给予相应药物，给药体积为20mL/kg，1次/日，连续给药7天，正常对照组和模型对照组小鼠每天灌胃给予同体积蒸馏水。除正常对照组其余小鼠于末次给药后30min腹腔注射5×108CFU/mL的大肠埃希菌溶液，注射体积为20mL/kg。观察并记录各组小鼠注射大肠埃希菌后4h内排便情况。

2.1.1检测指标：

2.1.1.1腹泻潜伏时间：记录小鼠腹腔注射大肠埃希菌的时间到首次出现腹泻的时间间隔，未出现腹泻小鼠时间间隔记录为240min。

2.1.1.2腹泻率：记录小鼠腹腔注射大肠埃希菌后出现腹泻动物数，计算腹泻率。腹泻率＝腹泻动物数/该组动物总数×100％。

2.1.1.3腹泻指数：根据各组小鼠4h内排便情况计算腹泻指数。腹泻指数＝稀便率×平均稀便级。式中，稀便率为每只动物所排的稀便数与总便数之比。稀便级表示每只动物稀便的程度，以稀便污染滤纸的直径定级，分为4级：小于1cm为1级，1-1.9cm为2级，2-3cm为3级，大于3cm为4级。平均稀便级＝所有稀便级/稀便次数。

2.2黑老虎果实提取物对番泻叶致小鼠腹泻模型的影响

ICR小鼠60只，雄性，体重：18.0-22.0g，按体重随机分为6组，分别为：正常对照组、模型对照组、肠炎宁胶囊组、黑老虎果实提取物低、中、高剂量组，每组10只，各组小鼠每天灌胃给予相应药物，给药体积为20mL/kg，1次/日，连续给药7天，正常对照组和模型对照组小鼠每天灌胃给予同体积蒸馏水。除正常对照组其余小鼠于末次给药后30min灌胃给予1g/mL的番泻叶提取液，灌胃体积为20mL/kg，灌胃后将小鼠单个置于自制铁丝笼中，下方垫滤纸，滤纸间隔30min更换1次，记录小鼠首次出现腹泻时间与6h内稀便数量。

2.2.1检测指标：

2.2.1.1腹泻潜伏时间：记录小鼠给予番泻叶提取液的时间到首次出现腹泻的时间间隔，未出现腹泻小鼠时间间隔记录为360min。

2.2.1.2稀便数量：记录小鼠给予番泻叶提取液后6h稀便数量。

2.3黑老虎果实提取物对小鼠小肠推进的影响

ICR小鼠50只，雌雄各半，体重：18.0-22.0g，按性别体重随机分为5组，分别为：正常对照组、肠炎宁胶囊组、黑老虎果实提取物低、中、高剂量组，每组10只，各组小鼠每天灌胃给予相应药物，给药体积为20mL/kg，1次/日，连续给药7天，正常对照组小鼠每天灌胃给予同体积蒸馏水，各组小鼠末次给药后30min灌胃给予5％碳末，0.2mL/只，30min后处死小鼠，计算小肠碳末推进率。

2.3.1检测指标：

2.3.1.1小肠碳末推进率：给予碳末30min后处死小鼠，取出自幽门至回盲部的小肠，测其全长和碳末前沿至幽门的距离，计算推进率。碳末推进率(％)＝碳末在肠内推进距离/小肠全长×100％。

2.4剂量设置

据前期研究设置黑老虎果实提取物低、中、高剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。肠炎宁胶囊临床推荐用量6g，根据人与动物体表面积换算动物等效剂量为6g*0.0026/0.02kg＝0.78g/kg。

表1试验分组和剂量设计

2.5统计学方法

采用SPSS16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P≤0.05，计量资料采用均数±标准差

表示，用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性，如果符合正态性和方差齐性(P>0.05)，用单因素方差分析(ANOVA)和LSD test进行统计分析；如果不符合正态性和方差齐性(P<0.05)，则用Kruskal-Wallis检验，如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。

3.实验结果

3.1黑老虎果实提取物对小鼠细菌性腹泻模型的影响

如表2所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠腹泻潜伏时间明显减少(P＜0.01)，腹泻指数明显增加(P＜0.01)。黑老虎果实提取物高剂量组小鼠腹泻潜伏时间明显增加(P＜0.05)，腹泻指数明显减少(P＜0.05)。黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠腹泻率分别为：40％、40％、20％。

表2黑老虎果实提取物对小鼠细菌性腹泻模型的影响(

n＝10)

注：与正常对照组比较，++P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05。

3.2黑老虎果实提取物对番泻叶致小鼠腹泻模型的影响

如表3所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠腹泻潜伏时间明显减少(P＜0.05)，稀便数量明显增加(P＜0.01)。与模型对照组比较，黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠稀便数量明显减少(P＜0.05)；肠炎宁胶囊组小鼠腹泻潜伏时间明显减少(P＜0.05)。

表3黑老虎果实提取物对番泻叶致小鼠腹泻模型的影响(

n＝10)

注：与正常对照组比较，+P<0.05，++P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05。

3.3黑老虎果实提取物对小鼠小肠推进的影响

如表4所示，与正常对照组比较，黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠小肠碳末推进率无明显差异，表明本发明的黑老虎果实提取物对小鼠小肠蠕动功能无影响。

表4黑老虎果实提取物对小鼠小肠推进的影响(

n＝10)

4.讨论

通过上述大肠埃希菌、番泻叶刺激小鼠腹泻实验可知，黑老虎果实提取物能明显增加小鼠腹泻潜伏时间(尤其是黑老虎果实提取物高剂量组)，减少腹泻指数，同时减少小鼠稀便数量，降低腹泻率。表明，黑老虎果实提取物具有明显有抗腹泻作用，为制备抗腹泻药物提供了依据。

Claims (7)

1.黑老虎果实提取物在制备抗腹泻药物中的应用，其中，该提取物为醇提取物。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述提取物是按如下步骤制备得到：

a.于破碎后的黑老虎果实中加入低级醇提取，得滤液；

b.将滤液减压回收低级醇后冷冻干燥，即得黑老虎果实提取物。

3.如权利要求2所述的应用，其中，所述步骤a中提取是指于破碎后的黑老虎果实中加入低级醇，超声提取后离心、过滤，滤液备用，滤渣再加入低级醇，超声提取后离心、过滤，取滤液，合并二次的滤液。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述低级醇的质量浓度为40-70％，加入量为1g黑老虎果实或滤渣加3-6ml低级醇。

5.如权利要求3所述的应用，其中，所述超声提取的温度为15℃-45℃。

6.如权利要求3所述的应用，其中，所述超声提取次数为1-2次，每次提取时间为30-60min。

7.如权利要求2所述的应用，其中，所述步骤b中减压回收的温度为50℃-55℃。