CN111466282A - 以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应 - Google Patents

Abstract

本发明提供了以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，是通过测定苜蓿品种接种根瘤菌株形成的地上生物量干重，分析生物量增长量效应，鉴别划分结瘤正向促生效应、结瘤无促生效应和结瘤负向促生效应，筛选正向促生效应的紫花苜蓿品种与根瘤菌株共生结瘤组合。本发明以生物量干重鉴别苜蓿与根瘤菌共生结瘤促生效应，提高了鉴定精准性和鉴定效率，结果稳定可靠，紧密结合生产实际，易于应用；此方法在精准鉴定筛选苜蓿品种与根瘤菌株接种组合的同时，利用形成的地上生物量干重的增长量效应明确划分了结瘤正向促生效应、结瘤无促生效应和结瘤负向促生效应，对苜蓿品种与根瘤菌株结瘤正向促生效应的精准筛选利用具有重要的指导意义。

Description

以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应

技术领域

本发明属于农业领域，具体涉及以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共 生结瘤促生效应。

背景技术

豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系是自然界效率最高的固氮体系，不同豆 科植物与根瘤菌株间存在共生匹配专一性。紫花苜蓿与根瘤菌的共生匹配专一 性，即某一根瘤菌株仅能与特定紫花苜蓿基因型或品种高效结瘤固氮，是二者 共生效果的最主要决定因素。当二者专一性强时，接种根瘤菌的紫花苜蓿植株 能够产生根瘤并高效固氮促生，以高效“共生”的方式为植物生长提供氮素营 养，促生效应强；当二者专一性弱时，接种根瘤菌的紫花苜蓿植株不会产生根 瘤，或者产生根瘤但只固定少量的氮甚至不固氮，根瘤菌以类似于“寄生”的 方式消耗植物养分，促生效应差或者无促生效应。因此，快速、精准的鉴定紫花苜蓿与根瘤菌专一性共生体系及其促生效应是提高苜蓿产量和质量的重要途 径。

目前，对于苜蓿-根瘤菌共生组合促进生长效应的鉴定评价缺乏精准、快速 简便的方法。温室盆栽和大田试验通常采用苜蓿品种接种根瘤菌株后测定占瘤 率、結瘤数量、固氮酶活性、固氮量和株高等多个共生表型指标的方法评价筛 选高效的共生组合，但因多个共生表型指标的选择缺乏统一的规范和标准，且 易受环境条件的影响，存在工作量大、耗时长、效率低，尤其存在评价目标性 不精准的问题，缺乏有效的指导意义。同时，以往的共生效应研究多关注高效 共生结瘤，而实际上大多数根瘤菌与苜蓿品种共生对植物生长是无显著促进作 用的，甚至还有部分根瘤菌存在“寄生”效应，只有少量根瘤菌能促进苜蓿生 物量的增长，表现出共生增产效应。不管怎样，这样的根瘤菌-苜蓿共生组合均 属于专一性范畴，但对这种正向或负向专一性的明确划分研究尚属空白。就经 济利用和生态价值而言，地上生物量是实际生产中最受关注的指标，与未接种 的对照相比，接种根瘤菌后植物地上生物量干重的增长量能够直观地体现双方 的共生匹配效果，进而快速、精准的鉴别苜蓿品种与根瘤菌株结瘤共生的正向 促生效应、无促生效应和负向促生效应，使优良苜蓿品种与优良根瘤菌株高效 共生组合真正实现专一性精准促生增产增效。

发明内容

本发明提供了一种以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效 应，有效的解决了上述背景技术中存在的问题。

本发明采用的技术方案如下：

以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,包括：

S1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫 花苜蓿幼苗；

S2、制备根瘤菌液：将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；

S3、接种根瘤菌株：将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；

S4、测定指标：收获紫花苜蓿植株后处理，测定干重，并进行单因素方差 分析和多重比较；

S5、促生效应的确定：根据测定指标与对照组对比，判断促生效应。

所述S1中紫花苜蓿使用紫花苜蓿品种Medicago sativa L.；根瘤菌株使用 中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti。

所述S1还包括：

S101、挑选子粒饱满健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘 伏溶液震荡灭菌，并用无菌水冲洗，于清水琼脂中催芽；

S102、将河沙洗净过筛，pH调至中性后烘干灭菌，并冷却；

S103、将紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽；

S104、套制双层盆结构，双层盆之间浇灌灭菌水。

所述S103中，紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽的条件 为：光照时间16h·d^-1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃， 相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mL Hoagland有氮营养液。

所述S2中，所述制备根瘤菌液包括将根瘤菌株TY平板活化后转接入TY液 体培养基，振荡培养至菌液光密度OD₆₀₀nm值为0.5～1，离心处理，抛去上清液 后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制 成OD₆₀₀nm为0.5的根瘤菌液。

TY液体培养基的制备方法为：胰蛋白胨5g·L^-1；酵母粉3g·L^-1；CaC₁₂·6H₂O1.3g·L^-1；NaOH调试pH至7.0；121℃灭菌26min。

所述S3中，接种根瘤菌株包括：

S301、在幼苗生长至第15d左右时(95％幼苗出现第1片真叶出现)接种；

S302、每株幼苗接种根瘤菌液1mL；

S303、以浇灌不含根瘤菌的TY液体培养基为对照；

S304、以每个菌株接种处理4个小盆作为重复；

S305、接种根瘤菌株后，每隔7d在紫花苜蓿植株所在塑料面盆内浇灌 Hoagland无氮营养液500mL。

所述S4中，测定指标包括：

S401、根瘤菌液浇灌接种45d后，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸 吸干水分；

S402、每盆随机选取10株，以第一片对生子叶叶痕作为划分地上、地下部 分的标准进行裁剪，将剪下的地上部分包入锡箔纸袋，两端开口，在烘箱中烘 干到恒重，测定地上生物量干重；

S403、采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan法对数 据进行多重比较，p<0.05代表处理之间差异显著。

所述S402中，在烘箱中烘干到恒重的烘干方式为：先在105℃烘箱中烘15 min，再经80℃烘干到恒重。

所述S5中，促生效应确定的判断标准为：

标准1、当接种处理地上生物量干重大于对照组干重且p<0.05时，确定该 根瘤菌株对苜蓿品种结瘤效应为正向促生效应，地上生物量干重增长量越大， 增产效应越强；

标准2、接种处理地上生物量干重与对照组干重相比p≥0.05时，确定该根 瘤菌株对苜蓿品种结瘤无效应；

标准3、当接种处理地上生物量干重小于对照组干重且p<0.05时，确定该 根瘤菌株对苜蓿品种结瘤效应为负向促生效应，负向增长量越大，减产效应越 强。

本发明的有益效果为：

1)以生物量干重确定共生结瘤促生效应，摆脱了对测定多个共生表型指标 的依赖，方法成熟，操作规范，结果可靠，易于普及应用。

2)生物量干重能最直观地体现共生结瘤促生效应，与实践结合紧密，说服 力强。

3)此方法将苜蓿品种与根瘤菌株共生结瘤的促生效应分为正向促生效应、 无效应和负向促生效应，易于扬长避短，充分利用专一性“正效应”，克服专 一性“负效应”，对根瘤菌与苜蓿品种共生结瘤促生效应的精准利用具有重要 的指导意义。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步的说明本发明的技术方案：

实施例1

1)苜蓿品种：甘农9号紫花苜蓿(M.sativa cv.Gannong No.9)品种。

2)根瘤菌株：15株S.meliloti菌(表1)。

表1根瘤菌株

3)培育幼苗：挑选子粒饱满、健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全 柜内用碘伏溶液(有效碘含量0.45％～0.55％(W·V^-1))震荡灭菌3min，用无 菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28℃催芽48h。将河沙洗净，过筛(2-mm)， pH调至中性后105℃烘干，121℃灭菌6h，冷却。在直径13.2cm、高10cm 的塑料盆中装入河沙450g，并均匀植入60粒种子发芽，深度为2cm。之后将 塑料小盆放入29cm×20cm×9.5cm的塑料面盆中，每个面盆内放2个小盆，并浇灌500mL灭菌水。培养条件为：光照时间12h·d^-1，有光照时温度21～ 25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mL Hoagland 有氮营养液。

4)制备菌液：将步骤2)中的根瘤菌株TY平板活化后转接入50mL TY液 体培养基，28℃、180rpm·min^-1振荡培养至菌液光密度OD₆₀₀nm值为0.5～1， 4000rpm·min^-1离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡 旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD₆₀₀nm为0.5的根瘤菌液。

5)接种根瘤菌株：在幼苗生长至第15d左右时(第1片真叶出现)，用 移液器将制备好的菌液加入幼苗根部，每小盆60mL，以不含根瘤菌的TY液体 培养基为对照CK。每个菌株处理4个小盆作为重复。接种后每隔7d在塑料面 盆中浇灌Hoagland无氮营养液500mL。其余时间用灭菌蒸馏水补充水分。

6)测定指标：将分离的所有根瘤菌株浇灌接种紫花苜蓿品种，接种45d 后(植株已生长60d)，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分。每 盆随机选取10株，以第1片对生子叶叶痕作为划分地上、地下部分的标准， 将剪下的地上部分包入锡箔纸袋，两端开口，105℃烘箱中烘15min，再经 80℃烘干到恒重，测定地上生物量干重。采用SPSS 19.0软件进行单因素方差 分析，并采用Duncan法对数据进行多重比较，p<0.05代表差异显著。

7)促生效应的确定

15株根瘤菌(表1)分别接种于甘农9号紫花苜蓿(M.sativa cv.Gannong No.9)，测定苜蓿品种上各接种处理与未接种(CK)的地上生物量干重(表2)。 根瘤菌株LL2、LL11和WLP2接种处理地上生物量干重(407.53～639.67mg/苜 蓿植株)均显著大于CK(65.93mg/苜蓿植株)(p<0.05)，且菌株LL11的地 上生物量干重增长量最大，比CK高870.23％。根瘤菌株G3L4、G3L7、G3L10、 G3L12、G3L13、G9L3、G9L5、G9L8和LL10接种处理地上生物量干重(32.67～ 52.33mg/株)均显著小于CK(65.93mg/苜蓿植株)(p<0.05)，且根瘤菌株 G3L12增长量最小，比CK低50.45％。根瘤菌株G3L9、G9L7和LL1接种处理地 上生物量干重(57.23～73.73mg/苜蓿植株)均与CK(65.93mg/苜蓿植株)差 异不显著。故确定LL11对甘农9号苜蓿品种结瘤专一性最强，且LL11结瘤共 生增产效应最大；G3L12结瘤共生减产效应最大；G3L9、G9L7和LL1结瘤共生 无增产效应。生产上为甘农9号紫花苜蓿选择组配LL11菌株，增产效果最好。

表2以宿主(甘农9号紫花苜蓿)生物量为标准确定专一性固氮促生效应

实施例2：

1)苜蓿品种：清水紫花苜蓿(M.sativa cv.Qingshui)品种。

2)根瘤菌株：15株S.meliloti菌(表3)

表3根瘤菌株

3)培育幼苗：挑选子粒饱满、健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全 柜内用碘伏溶液(有效碘含量0.45％～0.55％(W·V^-1))震荡灭菌3min，用无 菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28℃催芽48h。将河沙洗净，过筛(2-mm)， pH调至中性后105℃烘干，121℃灭菌6h，冷却。在直径13.2cm、高10cm 的塑料盆中装入河沙450g，并均匀植入60粒种子发芽，深度为2cm。之后将 塑料小盆放入29cm×20cm×9.5cm的塑料面盆中，每个面盆内放2个小盆，并浇灌500mL灭菌水。培养条件为：光照时间12h·d^-1，有光照时温度21～ 25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mL Hoagland 有氮营养液。

4)制备菌液：将步骤2)中的根瘤菌株TY平板活化后转接入50mL TY液 体培养基，28℃、180rpm·min^-1振荡培养至菌液光密度OD₆₀₀nm值为0.5～1， 4000rpm·min^-1离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡 旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD₆₀₀nm为0.5的根瘤菌液。

5)接种根瘤菌株：在幼苗生长至第15d左右时(第1片真叶出现)，用 移液器将制备好的菌液加入幼苗根部，每小盆60mL，以不含根瘤菌的TY液体 培养基为对照CK。每个菌株处理4个小盆作为重复。接种后每隔7d在塑料面 盆中浇灌Hoagland无氮营养液500mL。其余时间用灭菌蒸馏水补充水分。

6)测定指标：将分离的所有根瘤菌株浇灌接种紫花苜蓿品种，接种45d 后(植株已生长60d)，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分。每 盆随机选取10株，以第1片对生子叶叶痕作为划分地上、地下部分的标准， 将剪下的地上部分包入锡箔纸袋，两端开口，105℃烘箱中烘15min，再经 80℃烘干到恒重，测定地上生物量干重。采用SPSS 19.0软件进行单因素方差 分析，并采用Duncan法对数据进行多重比较，p<0.05代表差异显著。

7)促生效应的确定

15株根瘤菌(表3)分别接种于清水紫花苜蓿(M.sativa cv.Qingshui)， 测定苜蓿品种上各接种处理与未接种(CK)的地上生物量干重(表4)。根瘤菌 株G9L3、G9L8、LL1和WLP2接种处理地上生物量干重(65.23～116.23mg/苜 蓿植株)均显著大于CK(44.50mg/苜蓿植株)(p<0.05)，且菌株LL1的地上 生物量干重增长量最大，比CK高161.19％。根瘤菌株G3L9和G9L7接种处理地 上生物量干重(16.43～18.07mg/苜蓿植株)均显著小于CK(44.50mg/苜蓿植 株)(p<0.05)，且根瘤菌株G9L7增长量最小，比CK低63.08％。根瘤菌株G3L4、 G3L7、G3L10、G3L12、G3L13、G9L5、LL2、LL10和LL11接种处理地上生物量干 重(22.87～57.97mg/苜蓿植株)均与CK(44.50mg/苜蓿植株)差异不显著。 故确定LL1对清水紫花苜蓿品种结瘤专一性最强，且LL1结瘤共生增产效应最 大；G9L7结瘤共生减产效应最大；G3L4、G3L7、G3L10、G3L12、G3L13、G9L5、 LL2、LL10和LL11结瘤共生无增产效应。生产上为清水紫花苜蓿选择组配LL1 菌株，增产效果最好。

表4以宿主(清水紫花苜蓿)生物量为标准确定专一性固氮促生效应

由于所采用的试验和分析方法简便合理，易于操作。因此本发明具有很好 的实用性和可靠性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现 本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非 限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落 在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施 方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经 适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,其特征在于，包括：

S1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；

S2、制备根瘤菌液：将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；

S3、接种根瘤菌株：将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；

S4、测定指标：收获紫花苜蓿植株后处理，测定干重，并进行单因素方差分析和多重比较；

S5、促生效应的确定：根据测定指标与对照组对比，判断促生效应。

2.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S1中紫花苜蓿使用紫花苜蓿品种Medicago sativa L.；根瘤菌株使用中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti。

3.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S1还包括：

S101、挑选子粒饱满健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液震荡灭菌，并用无菌水冲洗，于清水琼脂中催芽；

S102、将河沙洗净过筛，pH调至中性后烘干灭菌，并冷却；

S103、将紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽；

S104、套制双层盆结构，双层盆之间浇灌灭菌水。

4.根据权利要求3所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S103中，紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽的条件为：光照时间16h·d^-1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mL Hoagland有氮营养液。

5.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S2中，所述制备根瘤菌液包括将根瘤菌株TY平板活化后转接入TY液体培养基，振荡培养至菌液光密度OD₆₀₀nm值为0.5～1，离心处理，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD₆₀₀nm为0.5的根瘤菌液。

6.根据权利要求5所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：TY液体培养基的制备方法为：胰蛋白胨5g·L^-1；酵母粉3g·L^-1；CaC₁₂·6H₂O1.3g·L^-1；NaOH调试pH至7.0；121℃灭菌26min。

7.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S3中，接种根瘤菌株包括：

S301、在幼苗生长至第15d左右时(95％幼苗出现第1片真叶出现)接种；

S302、每株幼苗接种根瘤菌液1mL；

S303、以浇灌不含根瘤菌的TY液体培养基为对照；

S304、以每个菌株接种处理4个小盆作为重复；

S305、接种根瘤菌株后，每隔7d在紫花苜蓿植株所在塑料面盆内浇灌Hoagland无氮营养液500mL。

8.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,其特征在于：所述S4中，测定指标包括：

S401、根瘤菌液浇灌接种45d后，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分；

S402、每盆随机选取10株，以第一片对生子叶叶痕作为划分地上、地下部分的标准进行裁剪，将剪下的地上部分包入锡箔纸袋，两端开口，在烘箱中烘干到恒重，测定地上生物量干重；

S403、采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan法对数据进行多重比较，p<0.05代表处理之间差异显著。

9.根据权利要求8所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,其特征在于：所述S402中，在烘箱中烘干到恒重的烘干方式为：先在105℃烘箱中烘15min，再经80℃烘干到恒重。

10.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,其特征在于：所述S5中，促生效应确定的判断标准为：

标准1、当接种处理地上生物量干重大于对照组干重且p<0.05时，确定该根瘤菌株对苜蓿品种结瘤效应为正向促生效应，地上生物量干重增长量越大，增产效应越强；

标准2、接种处理地上生物量干重与对照组干重相比p≥0.05时，确定该根瘤菌株对苜蓿品种结瘤无效应；

标准3、当接种处理地上生物量干重小于对照组干重且p<0.05时，确定该根瘤菌株对苜蓿品种结瘤效应为负向促生效应，负向增长量越大，减产效应越强。