CN111447972A - 治疗急性髓系白血病的方法 - Google Patents
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Abstract
发明涉及一种利用对其有用的药物治疗急性髓性白血病(AML)的方法。所述药物可以是药物组合物或套装,其包含当前描述的式(I)的化合物或其盐、溶剂化物或前药。本发明的特定化合物包括2‑甲基‑7‑羟基‑3‑(3,4,5‑三甲氧基苯甲酰基)‑6‑甲氧基苯并呋喃,也称为BNC105,以及6‑甲氧基‑2‑甲基‑3‑(3,4,5‑三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃‑7‑磷酸二氢钠,也称为BNC105P。
Description
领域
本公开教导了使用对其有用的药物对急性髓系白血病(AML)进行特异性治疗的方法。
背景
癌症是细胞群在不同程度上对通常控制增殖和分化的控制机制无反应的一种失调。白血病是血细胞,通常是白细胞,的癌症。每年,美国约有60,000新增白血病病例,导致约25,000例死亡。大多数白血病患者均接受化学疗法治疗。一些患者也可能接受放射治疗和/或骨髓移植。白血病可以是急性或慢性的。在急性白血病中,异常血细胞是原始细胞,仍非常不成熟,无法发挥其正常功能。原始细胞的数目迅速增加,疾病迅速恶化。在慢性白血病中,存在一些原始细胞,但通常来说,这些细胞更为成熟,可以执行某些正常功能。与急性白血病相比,原始细胞数目的增加速度较慢。结果,慢性白血病逐渐恶化。白血病可以在两种主要的白细胞中产生:淋巴细胞或骨髓细胞。当白血病影响淋巴细胞时,称为淋巴细胞性白血病。当骨髓细胞受到影响时,该疾病称为骨髓细胞白血病。最常见的白血病类型包括:a)急性淋巴细胞白血病(ALL);b)急性髓细胞白血病(AML);c)慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和d)慢性骨髓性白血病(CML)。
在美国,AML占所有新增白血病病例(即约21,000例)的约30%,导致约10,000人死亡,其中大多数是成年人。AML通常发生在老年人中,AML患者的平均年龄约为67岁。AML通过各种技术(例如光学显微镜、流式细胞仪或荧光原位杂交研究)与其他类型的白血病区别开来(例如AML)。例如,可以通过在WHO分类系统下,将血液和/或骨髓中的原始细胞百分比设置成超过20%的白血病成髓细胞来诊断AML。还可以通过在法裔美国人-英国(FAB)分类系统下,将骨髓或外周血中的原始细胞百分比设置成超过30%的白血病成髓细胞来诊断。还可进行遗传研究以寻找基因中的特定突变,例如FLT3、核磷蛋白和KIT,这些突变可能存在并可能影响疾病的结果。
AML的治疗主要包括化学治疗,分为两个阶段:诱导治疗和巩固治疗。诱导治疗的目的是通过将白血病细胞的数量减少到无法检测的水平来实现完全缓解。巩固治疗的目的是消除任何残留的无法检测到的疾病,以实现治愈。大多数诱导治疗方案包括柔红霉素和阿糖胞苷的组合。60%-70%的患者通过诱导化疗达到完全缓解,而25-40%的患者需要一个以上的疗程才能完全缓解。对于达到完全缓解的患者,最佳治疗方法存在争议。由于耐药性的发展,特别是早期的白血病祖细胞作为疾病复发的储存库,化学疗法通常无法治愈AML患者。实际上,大多数患者将在5年内复发。老年患者AML治疗的临床结果也很差。70岁以上的老年患者中,不能接受目前的治疗方法的患者比例高得令人无法接受,并且经历与治疗有关的死亡。许多人还将遭受复发而死亡。
专门针对AML的新型靶向疗法已经被开发并被FDA批准。例如,小分子恩西地平(IdhifaTM)靶向异柠檬酸脱氢酶2,后者在大约12%的AML患者中发生了突变。当与常规诱导和巩固疗法结合使用时,小分子米哚妥林(RydaptTM)能够显著延长FLT3突变AML患者的存活期。抗CD33抗体偶联物吉妥珠单抗奥佐米星(MylotargTM)也是专门设计用于治疗AML患者的新疗法。技术人员将理解,上述疗法被设计成专门治疗AML患者。这些疗法可能会或可能不会在其他白血病患者(例如CLL患者)中起作用。同样,CLL的治疗不一定对AML或其他类型的白血病或其他类型的骨髓性白血病有效。
需要针对AML的更有效和选择性的治疗。
发明内容
本公开内容使得能够对AML进行有效的治疗,其部分基于式(I)的化合物或其盐、溶剂化物或前药在选择性和优先诱导AML细胞凋亡中的用途。所述式(I)的化合物如下所示:
所述式(I)的化合物[2-甲基-7-羟基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃]可以通过PCT/AU2007/000101(WO 07/087684)(其内容通过引用被合并)描述的合成方法进行制备。
因此,本文中提供了一种用于治疗患者的急性髓系白血病(AML)的方法,该方法包括给予有效量的式(I)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的步骤,所述式(I)如下:
本文还教导了式(I)的化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗患有急性髓系白血病(AML)的患者的药物中的用途,所述式(I)如下:
在一相关实施方案中,本说明书对用于治疗患者的AML的式(I)的化合物或其盐、溶剂化物或前药具有指导意义,所述式(I)如下:
在另一实施例中,该方法包括用有效量的式(I)的化合物治疗需要其的受试者,以诱导AML细胞中的细胞凋亡。
对“AML”的引用包括其子类型及其相关形式。
简要附图说明
图1:在指定剂量的EX 1处理48h的AML细胞系中,通过CellTox Green分析的细胞毒性(A)和通过CellTiter-Blue分析的活力(B)测得的相对荧光。通过Prism 6中的绝对IC50方法确定IC50剂量。两种测定中MV4;11和MOLM13的n=2,两种测定中其余细胞系的n=1。
图2:A.在EX 1处理OCI-AML3 24小时后,通过CM-H2DCFDA荧光测量的总ROS水平。数值表示相对于未处理(DMSO)对照的平均荧光强度(MFI)。
B.线粒体O2.-水平,通过MitoSox荧光测量,在细胞系经过EX 1处理24小时后。数值表示相对于未处理(DMSO)对照的平均荧光强度(MFI)。
图3:用指示的剂量的EX 1处理24小时后的细胞系的细胞周期分布。MV4;11和MOLM13在10nM药物作用下显示出明显的凋亡诱导作用(sub-G0门)和G2/M降低。KG1、HL60、ME1和OCI-AML3显示G2/M细胞周期停滞。从用10nM EX 1开始治疗,KG1和HL60还显示亚G0群体增加。
图4:用指定剂量的EX 1处理8h和24h的细胞系的蛋白裂解物进行蛋白质印迹。在8h用10nM EX 1在所有细胞系中诱导P-JNKT183/Y185。仅在8h用10nM EX 1处理的OCI-AML3和ME1系中观察到Noxa诱导。HEK293(HEK)蛋白裂解物用作Noxa检测的阳性对照。微管蛋白被用作加载对照。
图5:用EX 1或OXi4503处理24h(A)和48h(B)后,从健康对照(HC)和AML样品的原始MNC样品中测量了Caspase 3/7活性(图例中列出的剂量以nM为单位)。在用EX 1或OXi4503处理48h(C)和72h(D)后,在相同的原始样品上用Annexin V/7AAD染色后,通过流式细胞术评估生存力。绘制的值是活细胞相对于未处理(DMSO)对照的比例。活细胞的比例对应于双重阴性细胞门(即Annexin V和7AAD的阴性染色)。在48h(E)和72h(F)之后,在其他AML样品(包括AML086,AML180,AML372)中,用膜联蛋白V/7AAD染色后,通过流式细胞术评估了生存力。
图6:A.流式细胞术分析的代表性点图,用于检测每个使用的AML样本(AML136、AML235和AML480)中包含GPR56+LSC的群体(绿色门)。B.用EX 1或OXi4503处理48小时后,三个AML样品的A上的绿色门所确定的GPR56+细胞百分比。C.用EX 1或OXi4503处理48小时后,通过免疫表型流式细胞仪分析对AML样品测定的LSC相对量。LSC门控策略:AML136和AML480为GPR56+/CD34+和GPR56+/CD34-,AML235为GMPR56+/CD34+,AML086和AML138为AML372,CD34+/CD38-/CD93+为LSC。
图7:用所示剂量的EX 1处理L-AML6(A)和L-AML419(B)后,集落形成被阻断。OXi4503在100nM时可降低L-AML6上的集落形成,但在此样品的最高剂量下和L-AML419的两种剂量下均可完全抑制集落。指示的剂量以nM为单位。
图8:Western印迹是用所示剂量的EX1或OXi4503处理的AML样品L-AML6的蛋白裂解物进行48h免疫印迹。P-JNKT183/Y185由500nM EX 1诱导,但未被OXi4503诱导。Noxa的表达非常低,并且似乎不随任何治疗而改变。HEK293(HEK)蛋白裂解物用作Noxa检测的阳性对照。
微管蛋白用作上样对照。
图9:进行MTS增殖测定表明,暴露于药物72h后,EX 1在HL-60和MV4-11细胞系中的效力至少是任何其他VDA的10倍。
具体描述
在整个说明书和随后的权利要求书中,除非上下文另有要求,否则词语“包括”(“comprise”)以及诸如“包括”(“comprises”)和“包括”(“comprising”)之类的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或一组整数或一组步骤,但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或一组步骤。
在本说明书中,对任何先前的出版物(或从其衍生的信息)或任何已知事项的引用均不是,也不应该被视为对该先前出版物(或信息)或已知事项构成本说明书所涉及的研究领域中的公知常识的一部分的承认、认可或任何形式的暗示。
如在本说明书中所使用的,单数形式的“一个”,“一种”和“该”包括复数方面,除非上下文另外明确指出。因此,例如,提及“AML细胞”包括单个细胞以及两个或更多个细胞。提及“药物”包括单个药物以及两个或多个药物;对“本公开”的引用包括本公开教导的单个和多个方面;等等。本文所教导和允许的方面被术语“发明”涵盖。所有这些方面都在本发明的范围之内。
本公开教导了式(I)的化合物是有效的微管蛋白聚合抑制剂(TPI),其通过上调促凋亡蛋白来诱导肿瘤细胞死亡。式(I)的化合物的一个重要方面是特定的C-6和C-7取代基与C-2Q-基团(尤其是C-2甲基)的组合,当与其他与结构相关的TPI化合物相比,似乎具有更高的效价和选择性。
应当理解,式(I)的化合物可以以其药学上可接受的盐的形式给予到受试者。合适的药学上可接受的盐包括但不限于药学上可接受的无机酸的盐,例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐,或药学上可接受的有机酸的盐,例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、黏液酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸磺胺盐、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和戊酸的盐。
碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子形成的盐,例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基胺。在一实施例中,本文描述的方法在其范围内包括阳离子盐,例如磷酸根的钠盐或钾盐或烷基酯(例如甲基、乙基)。
还应理解,作为式(I)的化合物的前药的任何化合物也在本文所述治疗方案的范围和精神内。术语“前药”以其最广泛的含义使用,并且包括那些在体内转化为本发明化合物(例如,式(I)的化合物)的衍生物。这样的衍生物对于本领域技术人员而言将是容易想到的,并且包括,例如,其中游离羟基(例如在C-7位或R1D)被转化成酯,例如乙酸酯或磷酸酯的化合物,或其中游离氨基(例如在C-7位或R1D)被转化为酰胺(例如,α-氨基酸酰胺)。用于化合物酯化,例如酰化,的步骤在本领域中是众所周知的,并且可以包括在合适的催化剂或碱存在下用合适的羧酸、酸酐或氯化物处理化合物。一种前药是磷酸二钠酯。本发明化合物的磷酸二钠酯(例如,式(I)的化合物的C-7磷酸二钠酯)在增加化合物的溶解度。例如,这将允许化合物在良性载体如盐水中的递送。磷酸二钠酯可以根据Pettit,G.R.,et al,Anticancer Drug Des.(抗肿瘤药物设计),1995,10,299中所述的方法制备。通常描述前药(及其制备)的其他文献包括:Design of prodrugs(前药的设计),1985,H.Bundgaard(Elsevier);The Practice of Medicinal Chemistry(药物化学实践),1996,CamilleG.Wermuth et al.,Chapter 31(Academic Press);and A Textbook of Drug Design andDevelopment(药物设计与开发教科书),1991,Bundgaard et al.,Chapter 5,(HarwoodAcademic Publishers)
因此,在一实施例中,式(I)的化合物是表示为以下的化合物:
式(I)的化合物(或其盐或前药)可以是游离化合物或溶剂化物(例如水合物)的结晶形式,这两种形式均在本发明的范围内。溶剂化的方法是本领域公知的。
“有效量”旨在表示当将式(I)或其盐或前药给予于需要这种治疗的受试者时,其量足以实现对AML的治疗。因此,例如,治疗有效量是足以减少或减轻AML的量。所提到的受试者包括任何年龄的人。
治疗包括至少部分获得所需的作用,或延迟AML的发作或抑制其进展,或完全停止或逆转AML的发作或进展。
在一实施例中,通过减少原始细胞计数(<5%)和恢复正常血细胞计数来评估治疗。
对“AML”的引用包括其子类型及其相关形式。在FAB分类系统下,AML亚型可以是M0、M1、M2、M3、M4、M4eo、M5、M6或M7亚型。AML也可以指AML祖细胞。式(I)的化合物(或其盐或前药)可以特异性地靶向或消除上述任何AML亚型的AML细胞。式(I)的化合物(或其盐或前药)也可以特异性地靶向或消除AML祖细胞。
式(I)的化合物(或其盐或前药)可以在患者的任何治疗阶段给药,包括诱导、诱导后(或巩固)和维持治疗阶段,以单一疗法或更优选与其他诱导、巩固和/或维持疗法相结合,包括手术、放射或化学疗法(例如抗代谢物,如阿糖胞苷(ara-C);蒽环类药物,如柔红霉素、阿霉素或伊达比星;以及其他药物,如6-硫鸟嘌呤,吉妥珠单抗奥佐米星(Mylotarg)、米哚妥林(Rydapt)、恩西地平(Idhifa)、SCH-727965(Dinaciclib)和/或集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)。这样,本发明考虑了与上述已知药物(抗肿瘤药物)的联合治疗,以实现更好的患者结果。
在一实施例中,式(I)的化合物(或其盐或前药)能够在诱导和/或巩固阶段期间特异性地靶向或消除AML细胞(包括AML祖细胞),从而导致完全缓解和消除。任何残留的无法检测到的疾病来治愈。
给予本发明的药物组合不仅可以产生有益的作用,例如累加或协同治疗作用,例如,在减轻、延迟或抑制或改善AML症状方面,而且还可以产生治疗作用。进一步令人惊讶的有益效果。与仅应用本发明组合中使用的一种药物活性成分的单一疗法相比,此类其他作用可包括更少的不良副作用、改善的生活质量或降低的发病率。
本治疗方案的另一个优点是可以使用较低剂量的式(I)的化合物的活性成分。剂量不仅需要较小,而且可以减少使用频率,这可以减少副作用的发生率或严重性。
另外,式(I)的化合物可与护理治疗标准结合使用。这允许以较低的剂量给予护理标准治疗,从而降低了副作用的发生率或严重性。
本文描述的治疗方案可以进一步包括基于某些临床参数,例如年龄、疾病进展水平和/或其他因素,选择要治疗的患者。另外,通常在开始治疗后监测患者的AML进展。因此,在停止治疗后,随后可能需要其他治疗,具体取决于缓解的状态或水平。
术语“给药”涉及将式(I)的化合物或其盐或前药给予单个患者。在联合疗法中,如果打算包括其中不必通过相同的给药途径或在同一时间给药的药剂的治疗方案。因此,可以以一种组合的单位剂型或两种单独的单位剂型的方式,将一种或多种给药的组合的伴侣药物一起一个接一个地给药或单独给药。单位剂型也可以是固定的组合,例如包含两个伴侣药物的药物组合物。
在一实施例中,治疗有效量的式(I)的化合物可以单独地或与另一种药剂同时或顺序地或以任何顺序依次给予,并且所述组分可以单独地或以固定组合的形式给予。例如,根据本发明的治疗AML的方法可以包括:(i)以游离或药学上可接受的盐形式或前药形式给予第一组合伴侣;(ii)以联合治疗有效量,优选以协同有效量(例如,以相当于本文所述的数量的每日或间断剂量),以游离或可药用盐形式或前药形式,以任何顺序同时或依次给予第二种组合伴侣。本发明的组合的各个组合伴侣可以在治疗过程中的不同时间分开给予,或者以分开或单一组合形式同时给予。术语给予还涵盖使用组合伴侣的前药,其在体内转化为组合伴侣。因此,本发明应理解为包括所有这样的同时或交替治疗方案,并且术语“给予”应据此解释。
这样,将理解,伴侣的组合可以被呈现为用于治疗AML的“组分的套装套”。套装可以包括包装,其中组合伴侣被单独提供以与用于特定疗法的说明书共同给予。
有效剂量可以根据所使用的特定化合物或药物组合物、给药方式、所治疗的病症、所治疗病症的严重性而变化。因此,根据多种因素选择给药方案,包括给药途径以及患者的肾和肝功能。普通技术人员可以容易地确定和开出用来缓解、抵抗或阻止疾病进展所需的单一活性物质的有效量。
当然,每日剂量将根据多种因素,例如,所选化合物、待治疗的特定病症以及期望的效果,而变化。然而,一般而言,以约0.05至18mg/kg/天,例如,0.4至16mg/kg/天,单次或分次服用,的日剂量率给予式(I)的化合物可获得令人满意的结果。该化合物可以通过任何常规途径给药,特别是肠内或肠胃外给药,例如以可注射溶液或悬浮液的形式。
式(I)的化合物可以0.5至1000mg的日剂量范围给予于人。肠胃外给药的合适单位剂型包含约0.1至500mg活性成分,优选5-50mg/天,更优选5-20mg/天,最优选约7-12mg/天,以及一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。
另一个好处是可以使用较低剂量的活性成分,例如,剂量不仅需要经常较小,而且使用频率也较低,或者可以使用以减少副作用的发生。这符合待治疗患者的期望和要求。
本发明还涉及药物组合物,其包含式(I)的组合物或其盐或前药,其例如包含例如约0.1%至约99.9%,包括约1%至约60%的活性成分。
该组合物,例如IV溶液,可以包含任何稀释剂或赋形剂。这些包括所有常规溶剂、分散介质、抗菌剂、表面活性剂和等渗剂等。将理解的是,本发明的组合物还可包含其他补充生理活性剂。
在与组合物的其他成分相容并且对受试者无害的意义上,载体必须是药学上“可接受的”。组合物包括适合于肠胃外(即静脉内)给予的那些。所述组合物可以方便地以单位剂型存在,并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。这样的方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常,通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合,然后如果需要使产品成型来制备组合物。
适合于肠胃外给药的组合物包括水性和非水性等渗无菌注射溶液,其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂以及使得组合物与预期接受者的血液等渗的溶质。水性和非水性无菌悬浮液,可包括悬浮剂和增稠剂。所述组合物可以存在于单位剂量或多剂量密封的容器中,例如安瓿和小瓶,并且可以在仅需要在使用前立即添加无菌液体载体,例如注射用水,的冷冻干燥(冻干)条件下储存。临时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
在一实施例中,单位剂量组合物是包含活性成分的每日剂量或单位,如上所述的每日亚剂量或其合适部分的那些单位剂量组合物。
应当理解,除了上述特别提及的活性成分之外,考虑到所讨论的组合物的类型,本发明的组合物可以包括本领域常规的其他试剂。
本领域技术人员将理解,本文描述的发明除了具体描述的之外还可以进行变化和修改。应当理解,本发明包括所有落入本发明精神和范围内的此类变化和修改。本发明还单独地或共同地包括在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。
现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案,这些实施例仅用于说明目的,而无意于限制上述一般性范围。
示例
合成方案
2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃的制备
步骤1:2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧亚甲基)-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃(Larock偶联)
2-异丙氧基-3-甲氧基-5-碘苯酚(4.41mmol)、1-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙炔(1.5g,5.28mmol)、氯化锂(189mg,4.45mmol)以及碳酸钠(2.34g,22.08mmol)在100℃的无水二甲基甲酰胺(5mL)中的悬浮液通过抽真空并用氮气回填,脱氧4次。加入乙酸钯(135mg,0.60mmol),并将反应容器用氮气脱气两次。然后将反应混合物在该温度下搅拌4小时(tlc),并通过真空蒸馏除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯(75mL),充分搅拌,过滤并用三乙胺(5mL)处理。将该溶液浓缩到硅胶(10g)上,并通过快速色谱法(硅胶,洗脱液=己烷/二乙醚/三乙胺;95:5:1%)纯化,得到标题化合物,为黄色油状物(1.45g,96%);1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.24(d,1H,J=8.45Hz),6.88(d,1H,J=8.47Hz),4.80(s,2H,CH2),4.73(m,1H),3.88(s,3H,OMe),1.36(d,6H,J=6.17Hz),0.94(s,9H),0.92(s,9H),0.35(s,6H),0.12(s,6H)。
步骤2:2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-甲酰基-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃
向2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基亚甲基)-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃(2.69mmol)的甲醇(100mL)溶液中加入浓盐酸(200μL)并搅拌反应30分钟(通过tlc监测),用三乙胺(2mL)淬灭,并通过在真空下蒸馏除去溶剂。将残余物溶解在二氯甲烷(20mL)中,用水(10mL)洗涤,用硫酸镁干燥,在真空下浓缩,并与甲苯(20mL)共同蒸馏。将粗产物溶解在干燥的二氯甲烷(4mL)中,并添加到搅拌的Collin试剂(三氧化铬(1.01g),吡啶(1.65mL)在干燥的二氯甲烷(30mL)中的溶液中。将悬浮液搅拌10分钟,过滤,并将残余物用二乙醚(20mL)洗涤。将滤液浓缩至二氧化硅(10g)上,并通过快速色谱法纯化(硅胶,洗脱液=己烷/二乙醚/三乙胺(90:9:1),得到标题化合物,为浅黄色油状物(503mg,48%);1H NMR(300MHz,CDCl3)δ10.25(s,1H,CHO),7.79(d,1H,J=8.45Hz),6.98(d,1H,J=8.46Hz),4.65(m,1H),3.89(s,3H,OMe),1.35(d,6H,J=6.17Hz),0.97(s,9H),0.45(s,6H)。
步骤3:2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃
在氮气下于-78℃向3,4,5-三甲氧基碘苯(377mg,1.27mmol)在无水四氢呋喃(1mL)中的搅拌溶液中加入正丁基锂(795μL,1.59mmol,2M环己烷溶液)并将反应混合物在该温度下搅拌40分钟。此后,通过注射器移液管将2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-甲酰基-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃(1.07mmol)在无水四氢呋喃(1mL)中的溶液滴加到反应中。将反应混合物在-60℃下搅拌20分钟,然后加热至0℃,搅拌10分钟,用饱和氯化铵溶液(2mL)淬灭,并用乙酸乙酯(20mL)稀释。将有机层用水(10mL)洗涤,用硫酸镁干燥,并在真空下除去溶剂,得到残余物,将其与甲苯共同蒸馏。将粗产物(908mg)溶解在干燥的四氢呋喃(10mL)中,并用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(900mg,1.59mmol)处理。将反应混合物在室温搅拌16小时(通过tlc监测),然后加载到二氧化硅(10g)上,并通过快速色谱法纯化(硅胶,洗脱液=己烷/二乙醚/三乙胺,90:9:1)至得到浅黄色油状的标题化合物(498mg,69%);1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.14(s,2H,benzoyl Hs),6.81(d,1H,J=8.64Hz),6.77(d,1H,J=8.64Hz)4.74(m,1H),3.93(s,3H,OMe),3.86(s,3H,OMe),3.78(s,6H,2x OMe),1.39(d,6H,J=6.14Hz),1.01(s,9H),0.26(s,6H)。
步骤4:2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃
于室温下的氮气氛围中,向2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-异丙氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-苯并呋喃(160mg,0.31mmol)的搅拌溶液中加入固体三氯化铝(83mg,0.62mmol),并将反应混合物搅拌15分钟(通过tlc监测)。用饱和氯化铵溶液淬灭反应,用二氯甲烷萃取并用硫酸镁干燥。通过蒸馏除去溶剂,并通过与甲苯共沸除去水来干燥残余物。将粗产物溶解在吡啶(2mL)中,加入乙酸酐(1mL),并将反应混合物在室温搅拌2小时。在真空下蒸馏溶剂,并将残余物加载到硅胶(1g)上,并通过柱色谱法纯化(硅胶,洗脱液,己烷:二乙醚;80:20)(134mg,84%);1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.14(s,2H,苯甲酰Hs),6.98(d,1H,J=8.72Hz),6.85(d,1H,J=8.72Hz),3.93(s,3H,OMe),3.86(s,3H,OMe),3.80(s,6H,2x OMe),2.41(s,3H),0.99(s,9H),0.25(s,6H)。
步骤5:2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃
在室温下的氮气氛围中,向2-叔丁基二甲基甲硅烷基-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃(120mg,0.44mmol)在1,2-二氯乙烷(1mL)中的搅拌溶液中逐滴加入溴(12μL,0.44mmol),并将该反应混合物在该温度下搅拌10分钟。此后,将反应用饱和硫代硫酸钠溶液淬灭,用乙酸乙酯(20mL)萃取,经硫酸镁干燥,并通过真空蒸馏除去溶剂。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂=己烷:二乙醚;8:2-7:3),得到为无色结晶固体的标题化合物(91mg,81%);1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.40(d,1H,J=8.70Hz),7.14(s,2H,苯甲酰-Hs),6.98(d,1H,J=8.75Hz),3.94(s,3H,OMe),3.89(s,3H,OMe),3.86(s,6H,2xOMe),2.43(s,3H);13C NMR(75MHz,CDCl3)δ187.95(CO),167.71,152.75,149.54,147.49,142.59,131.92,131.80,123.91,121.84,119.89,117.72,109.89,106.92,60.69,56.61,56.00,20.09。
示例1
2-甲基-7-羟基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃的制备
制备A
在90℃下,向2-溴7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-苯并呋喃(20mg,0.042mmol)和甲基硼酸(40mg,0.67mmol)的1,4-二氧六环(2mL)搅拌溶液中加入四-三苯基膦钯(11mg,0.01mmol),然后加入碳酸氢钠(40mg,0.48mmol)的蒸馏水(0.5mL)溶液。5分钟后反应混合物变为红色。2小时(tlc)后,使反应混合物达到室温,并加入饱和氯化铵(2mL),并用二氯甲烷(20mL)稀释。分离有机层,用水洗涤,用硫酸镁干燥,并通过真空蒸馏除去溶剂。残余物通过PTLC纯化(洗脱剂=二氯甲烷/甲醇,1:1),得到标题化合物(反应期间裂解的乙酸酯),为蓬松的白色固体;(3mg,19%)。
制备B(根岸偶联)
在0℃下,向搅拌的溴化锌(592mg,2.63mmol)的无水THF(1.5mL)溶液中添加甲基锂溶液(1.6M的乙醚溶液,2.6mL,4.15mmol),反应混合物搅拌2小时。加入固体2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-苯并呋喃(300mg,0.63mmol),并在真空下除去醚,并向剩余的悬浮液中加入二氯双(三苯基膦)钯催化剂(21mg)和催化量的碘化铜(I)。将反应混合物在室温搅拌36小时(通过tlc监测),用饱和氯化铵溶液淬灭,并用二氯甲烷(10mL)萃取,用硫酸镁干燥,并在真空下蒸馏除去溶剂,并将产物通过硅胶柱(洗脱剂=己烷/乙酸乙酯;8:2)纯化。产物在甲醇(106mg,46%)中结晶;1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.09(s,2H,苯甲酰Hs),6.93(d,1H,J=8.54Hz),6.83(d,1H,J=8.56Hz),5.70(bs,1H,OH),3.93(s,3H,OMe),3.92(s,3H,OMe),3.83(s,6H,2x OMe),2.54(s,3H,2-Me)。
示例2
磷酸6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-基磷酸二钠的制备
步骤1:磷酸二苄基6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-基磷酸酯:
在氮气氛下于0℃下,向0.081g(0.22mmol)(7-羟基-6-甲氧基-2-甲基苯并呋喃-3-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮、0.086g(0.261mmol)四溴化碳以及0.063mL(0.283mmol)亚磷酸二苄酯在2.5mL无水乙腈的混合物中滴加的0.046mL无水三乙胺。将得到的混合物在室温搅拌2h,然后用乙酸乙酯稀释至20mL,用水盐水洗涤,用无水硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸发至干。残余物通过快速柱色谱法纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯,9:1),得到标题化合物,为无色泡沫状物(0.13g,94%);1H NMR(CDCl3)δ2.42(s,3H,Me-2),3.83(s,1H,OMe),3.93(s,3H,OMe),5.33(m,4H,CH2Ph),6.89(d,CH芳烃,J=8.7Hz),7.21(dd,1H,CH芳烃,J=8.72Hz;J=1.2Hz),7.08(s,2H,CH芳烃),7.29–7.43(m,10H,CH芳烃)。
步骤2:6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-磷酸二氢钠:
在–5℃的氮气气氛下,向0.122g(0.193mmol)步骤1的产物在1mL无水乙腈中的搅拌溶液中添加0.075mL(0.58mmol)溴代三甲基硅烷。将所得混合物在0℃下搅拌1小时,然后真空蒸发至干。用无水甲醇将残余物稀释至5mL,并通过加入甲醇钠将溶液的pH调至约10。减压蒸发所得混合物后,将固体残余物用无水异丙醇(4×1.5mL)和无水乙醇(3×1.5mL)洗涤,并在真空下干燥,得到0.062g(65%收率)的为无色固体的标题化合物;1H NMR(D2O)δ2.37(s,3H,Me-2);3.76(s,6H,OMe);3.79(s,3H,OMe);3.82(s,3H,OMe);4.66(s,H2O);6,93(d,1H,CH芳烃,J=8.6Hz);7.04(d,1H,CH芳烃,J=8.6Hz);7.10(s,2H,CH芳烃)。
生物数据
材料和方法
组织培养–细胞系
将冷冻保存的细胞在37℃的水浴中解冻,并将细胞悬液转移至15mL试管,其中装有10mL的添加了10%FBS(JRH Biosciences,商品目录12003,批号5J0174)、100IU/mL青霉素(Sigma)以及100μg/mL链霉素(Sigma)的RPMI1640(Sigma)(从现在开始称为RF10),或添加了10%FBS(JRH Biosciences)、100IU/mL青霉素(Sigma)以及100μg/mL链霉素(Sigma)的α-MEM(Sigma)(从现在起称为αMEM10)。MV4;11、MOLM13、HL60、KG1和ME1在RF10中培养,而OCI-AML3在α-MEM10中培养。将细胞以400g转速离心5分钟,弃去上清液,并将细胞分别重悬于5mL RF10或αMEM中。将细胞在含5%CO2的潮湿培养箱中培养,每2-5天分裂一次,获得2-5×105细胞/mL的密度。
细胞毒性和生存力/增殖测定
将细胞系以2×104个细胞/孔的浓度在96孔板(黑色,带透明平底,Costar,3603)中接种于50μL的培养基中,该培养基中含0.1%DMSO和CellTox Green试剂(Promega,G8742),最终稀释度为1/500。对于每个测试剂量,将细胞铺在一式三份孔中。在使用前,立即将EX 1在DMSO中重构为10mM。将药物制备成在含0.1%DMSO的培养基中浓缩2倍,并在各孔中加入50μL。使用FLOUstar OPTIMA读板仪(BMG Labtech)在24小时和48小时测量荧光(485–500nmEx/520–530nmEm)。在48h进行细胞毒性测量后,向每个孔中加入20μLCellTiter-Blue试剂(Promega,G8080),并将板在37℃下孵育1h,然后用FLOUstar OPTIMA板读数器(BMG Labtech)测量荧光(560Ex/590Em)。
总ROS测定
将1.25×105个细胞收集到5mL管中,并用PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于180μL PBS中,并将20μL新鲜制备的5mM CM-H2DCFDA(Molecular Probes(分子探针),C6827)溶液添加到每个试管中。作为阳性对照,收集了上述细胞的试管用160μL PBS进行处理,以重悬细胞沉淀、20μL的10μM氢过氧化叔丁基(TBHP)和20μL的5mM CM-H2DCFDA。将所有试管在37℃下孵育20分钟,然后将细胞用PBS洗涤3次。将细胞重悬于300μL PBS中,并在LSRFortessa(BDBiosciences)流式细胞仪上进行分析。使用FCS Express 4Flow Research Edition软件(De Novo软件)分析结果。
线粒体O2·-测定
将1.25×105个细胞收集到5mL管中,并用PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于180μL PBS中,并将20μL新鲜制备的5mM MitoSox(Molecular Probes,M36008)溶液加入每个试管中。将所有试管在37℃下孵育20分钟,然后将细胞用PBS洗涤3次。将细胞重悬于300μL PBS中,并在LSRFortessa(BD Biosciences)流式细胞仪上进行分析。使用FCS Express 4FlowResearch Edition软件(De Novo软件)分析结果。
细胞周期测定
将2×105个细胞收集到5mL管中,并用PBS洗涤3次。将细胞沉淀悬浮在300μL冷PBS中,同时涡旋振荡。接下来,在缓慢振荡的同时,滴加700μL的冷的(-20℃)100%乙醇使细胞通透。将细胞悬液在冰上孵育30分钟,以300g离心10分钟,然后将细胞沉淀重悬于100μL PI溶液(0.1%Triton X-100、100μg/mL无DNAse的RNAse A–Sigma以及浓度为40g/mL PI的PBS)中。将细胞悬浮液在黑暗中于37℃孵育30分钟。在LSRFortessa(BD Biosciences)流式细胞仪上进行分析之前,向每个试管中加入200μL PBS。使用FCS Express 4Flow ResearchEdition软件(De Novo软件)分析结果。
免疫印迹
收集细胞(细胞系4×106,L-AMLs 7×106),并用冷PBS洗涤3次(4℃离心)。用推荐浓度的NP40细胞裂解缓冲液(ThermoFisher Scientific),cOmplete蛋白酶抑制剂(Roche,046993116001),PhosStop(Roche,04906837001)和Pefablock(Roche,11585916001)制备裂解缓冲液。洗涤后,将细胞重悬于50μL裂解缓冲液中,涡旋振荡并在冰上孵育30分钟。每10分钟将样品涡旋一次。孵育30分钟后,将样品在14,000g,4℃下离心10分钟,然后将上清液转移至试管中。根据制造商的实验方案,使用DC Protein Assay试剂盒(BioRad)对蛋白质进行定量。加载50μg细胞系裂解液或20μgL-AML6裂解液用于SDS-PAGE。使用半干转移装置(BioRad)将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜中。在室温下,用含0.1%TBS-t的5%脱脂奶将膜封闭1小时,然后在4℃下与一级抗体轻轻摇动孵育过夜。抗体按以下方式稀释:抗Noxa(Calbiochem,目录OP1800-100UG,批次2875160)在5%脱脂奶的0.1%TBS-t中的稀释比例为1:500,抗P-JNKThr183/Tyr185(Cell Signalling,目录9255,批次32)在5%BSA的0.1%TBS-t中的稀释比例为1:1000,抗微管蛋白(Santa Cruz Biotechnology,目录sc012462-R,批次C1516)在5%脱脂奶的0.1%TBS-t中的稀释比例为1:2000。第二天早晨,将膜用0.1%TBS-t洗涤3次,并与各自的第二抗体在室温下孵育1小时。用于NOXA和P-JNK膜的抗小鼠AP的二抗(Santa Cruz Biotechnology,目录sc-2308)和用于微管蛋白探测的膜的抗兔AP(Santa Cruz Biotechnology,目录sc-2007,lot H2714)在5%脱脂牛奶的0.1%TBS-t中以1:5000稀释。为了使结果可视化,在Typhoon FLA 9000(GE Healthcare)扫描仪中扫描膜。
组织培养–主要样品
将冷冻保存的单核细胞(来自BM或白细胞去除术样品的MNC)在37℃的水浴中解冻,并将细胞悬液转移至50mL试管中。添加有20%FBS(JRH Biosciences)、50U/mL DNase I(Sigma)、100IU/mL青霉素(Sigma)、100μg/mL链霉素(Sigma)和2mM L-谷氨酰胺(Sigma)的20mL IMDM培养基(Sigma,I3390),在将试管缓慢涡旋(或用手混合)的同时将)被滴加到细胞中。将细胞以400g转速离心5分钟,弃去上清液,并用20mL PBS洗涤细胞一次。洗涤后,将细胞重悬于添加有20%FBS(JRH Biosciences)、100IU/mL青霉素(Sigma)、100μg/mL链霉素(Sigma)和2mM L-谷氨酰胺(Sigma)的25mL IMDM(Sigma,I3390)中,并孵育过夜以进行恢复。第二天早上,通过台盼蓝拒染法确定了存活力,并对存活率低于85%的样品通过密度梯度离心法如下进行了死细胞去除:将15mL的Lymphoprep(AXIS-Shield)转移至50mL的试管中,并将细胞悬液(25mL)小心地覆盖(以免干扰与Lymphoprep的界面混合)。将试管以800g转速离心20分钟,加速度设置为5(最大值的一半),并且没有制动。用一次性巴斯德吸管将MNC层(在培养基和Lymphoprep之间的界面中形成)转移到装有20mL PBS的50mL管中。将细胞以600g转速离心5分钟,弃去上清液,将细胞沉淀重悬在完全培养基中,该培养基包含IMDM(Sigma,I3390)、15%BIT(STEMCELL Technologies,9500,lot 16L75786)、100ng/mLhSCF(Peprotech,300-07))、50ng/mL hFlt3-配体(Peprotech,300-19)、20ng/mL hIL3(Peprotech,200-03)、20ng/mL hG-CSF(Cell Signaling,8930)、10-4Mβ-巯基乙醇(BioRad)、0.5μM SR1
(Selleckchem,S2858,批次02)和1μM UM729(Selleckchem,S7510,批次S751001)。通过台盼蓝拒染法测定存活力和细胞密度,并如结果部分所述将细胞铺板用于各个实验。
Caspase-Glo 3/7测定
每个样品/处理的104个细胞(10μL)被等分到包含40μL完全培养基的96孔板(白色壁OptiPlate 96,Perkin Elmer)的一式三份孔中。向每个孔中加入50μL Caspase-Glo 3/7试剂,将板在300-500rpm的条件下摇动30秒,然后在黑暗中于室温孵育30分钟。用FLOUstarOPTIMA酶标仪(BMG Labtech)测量发光。
生存力(膜联蛋白V/7AAD)测定
在5mL试管中收集2×105细胞(200μL),并用PBS洗涤3次。将细胞沉淀重悬于100μL1×结合缓冲液(BD Biosciences,51-66121E)中,该缓冲液含有2μL Annexin V-APC抗体(BD Biosciences,目录550475,批号6140584)和2μL 7AAD溶液(BD Biosciences,目录51-68981E,批号5006667-1),并在室温下避光孵育30分钟。在LSRFortessa(BD Biosciences)流式细胞仪上进行分析之前,将200μL PBS添加到细胞悬液中。使用FCS Express 4FlowResearch Edition软件(De Novo软件)分析结果。
LSC检测
在5mL试管中收集8×105个细胞(800μL),并在室温下用1.6%甲醛固定10分钟。然后将样品用PBS洗涤一次,并用PBS/1%BSA洗涤一次。将细胞沉淀重悬于100μL PBS/1%BSA中,其中含有5μL抗CD34-APC(BD Biosciences,克隆8G12,目录340441,批次6183704)、5μL抗CD38-PECy7(BD Biosciences,335790,批次3353807)和5μL抗GPR56-PE(Biolegend,358204,批次B208353),在室温下避光孵育1h。最后,将细胞用PBS洗涤两次,然后重悬于200μL PBS中,以在LSRFortessa(BD Biosciences)流式细胞仪上进行分析。使用FCS Express4Flow Research Edition软件(De Novo软件)分析结果。
集落测定
将1.5mL的Methocult H4034(STEMCELL Technologies)等分到5mL试管中(一个试管/处理/样品),并补充20ng/mL的hIL-6(Peprotech,200-06)。将EX 1和OXi4503稀释液分别添加到试管中,使其最终浓度为100nM和500nM。DMSO被用作空白对照组。将样品添加到每个试管中以达到最终细胞密度:L-AML6和L-AML419为2×104细胞/孔,AML136和AML480为3×103细胞/孔。摇动试管以与Methocult混合药物和细胞,并在37℃下孵育10分钟以去除气泡。然后将样品铺在24孔板中,将4孔/处理/样品铺在板中心的8孔中。边缘的孔中充满无菌水以避免干燥。在对集落计数之前,将板在37℃下孵育13天。
MTS增殖测定
将细胞系(MV4;11和HL-60)以1×104个细胞/孔的浓度接种于96孔板中的50uL完全生长培养基中。对于每个测试剂量,将细胞铺在一式三份的孔中。EX 1(在DMSO中)、Oxi4503(EndoTherm,批次#EN09013,在水中)、CA4P(Selleckchem,Cat#S7204,在水中)和Plinabulin(Selleckchem,Cat#S1176,在DMSO中)在使用前,立即在按指示在适当的稀释剂中重新配制为10mM。将药物制备成在培养基中浓缩2倍,并分别向各孔中加入50uL(0.1%DMSO或水,终浓度)。72小时后,向每个孔中加入20μLCellTiter 96AQueous One Solution试剂(Promega目录号G3581),并在37℃下温育2小时,然后使用Thermo MultiskanAscent96/384读板器在492nm处测量吸光度。
1.AML细胞系对示例1(EX 1)的剂量反应
为了测试EX 1对AML细胞系的细胞毒性和抗增殖作用,将六种不同的细胞系(表1)解冻并在各自的培养基中培养,然后进行如下所述的处理。
表1:本研究中使用的AML细胞系的详细特征
第一个实验是用HL60和MOLM13细胞系进行的。扩增细胞,当数量足够时(存活率高于90%),将它们以2×104个细胞/孔的量接种在50μL各自含有0.1%DMSO和CellTox Green试剂的培养基中。所测试的剂量范围为1μM,然后依次进行1/10稀释,直到10-5nM EX 1,或仅使用溶剂。培养板并在24h和48h测量荧光(指示细胞毒性)。在48小时读取细胞毒性后,将CellTiter-Blue试剂添加到每个孔中。该测定的读数基于细胞的代谢活性,并且用作增殖和/或细胞活力的替代标记。
按照与上述相同的方案,用细胞系ME1、OCI-AML3、MV4;11和KG1进行下一个实验。从先前的实验结果可以看出,非线性曲线拟合在1nM和0.1nM之间非常陡峭(图1A和B);因此,为此和后续实验将药物剂量调整为:1μM、100nM、10nM、1nM、0.75nM、0.5nM、0.25nM、0.1nM、0.01nM和0.001nM。使用的药物储备是一周前为HL60和MOLM13实验准备的一种,储存在-20℃。如上测量细胞毒性和增殖(代谢测定)。最后,对MV4;11和MOLM13进行了额外的实验,将新鲜的试样等分,以确认获得的结果。IC50值如图1A和B所示。在进行多次实验的情况下,将数据合并以确定IC50。
如图1A和B所示,所有细胞系均表现出对EX 1的敏感性,IC50剂量非常低,范围从~0.2nM至1.3nM。细胞毒性和增殖实验的分析表明,这些细胞分为两组。敏感性最高的细胞系(HL60、MOLM13和MV4;11)达到最高的细胞毒性并显示出最大的抑制增殖反应;敏感性较低的细胞系(ME1、OCI-AML3和KG1)显示出较低的细胞毒性反应,并且在CellTiter分析中也保持高于背景读数,这与药物浓度较高时的某些细胞存活率一致。
2.研究EX 1靶向AML细胞的机制
一旦确定这组AML细胞系对EX 1高度敏感,便该反应的基础机制进行了研究。为此,将细胞以106细胞/mL接种并分别用溶媒(DMSO)或一系列剂量的EX 1(0.1nM、1nM、10nM和100nM)处理6h、8h和24h。收集细胞用于在6h和24h检测ROS和超氧阴离子(O2·-)的水平,在8h和24h提取蛋白质,并在24h进行细胞周期分析。
2.1用EX 1处理的细胞产生活性氧(ROS)
如文献报道,用康普他汀(combretastatin)-A4-P和OXi4500(康普他汀-A1)处理的KG1细胞显示总ROS水平增加(Petit et al.Blood 2008;Madlambayan et al.Blood2010),ROS水平用一系列剂量的EX1处理6h和24h后,在6个细胞系中测得总ROS含量。使用荧光染料CM-H2DCFDA通过流式细胞术测量总ROS水平,最终浓度为5μM。使用MitoSox通过流式细胞仪测量线粒体超氧阴离子(O2·-)的水平,最终浓度也为5μM。
如图2A所示,治疗24小时后,OCI-AML3细胞中总ROS的剂量响应降低,但是其他细胞系均未显示总ROS水平有任何变化(数据未显示)。另一方面,线粒体O2·-的水平在大多数细胞系中均发生了变化,但有两种不同的模式。MV4;11和MOLM13均显示出对药物的剂量反应,仅在24h观察到线粒体O2·-水平升高。该效应在MOLM13细胞中更为明显(图2B)。相比之下,HL60和ME1在6h时线粒体O2·-水平降低(数据未显示),而在24h时观察到的ME1细胞的作用更大(图2B)。虽然OCI-AML3在6h线粒体O2·-水平略有下降,但在24h时似乎O2·-水平增加(图2B)。最后,KG1对线粒体O2·-的任何可检测变化均无反应。
2.2用EX 1处理AML细胞系后的细胞周期分析
Petit和他的合作者还显示,在KG1细胞中,康普瑞汀A4-P诱导G2/M细胞周期阻滞(Petit等,Blood 2008)。因此,如上所述,在用一系列剂量的EX 1处理24小时后,通过PI染色在细胞系中进行细胞周期分析。
如图3所示,用EX 1处理24小时后,细胞周期分布有两种模式。MV4;11和MOLM13细胞发生凋亡,这由sub-G0群体的增加所证实。此外,这些细胞系显示G2/M和G1细胞的百分比呈剂量依赖性降低。对于其余细胞系HL60、KG1、OCI-AML3和ME1,观察到第二种模式。所有这些细胞系的数据均与对EX 1的反应引起的G2/M阻滞相一致。KG1和HL60还显示出与诱导凋亡一致的sub-G0细胞群显著增加。
2.3促凋亡信号的激活
已证明EX1通过JNK(P-JNK)的磷酸化和Noxa的诱导来诱导慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞凋亡(Bates等,Cancer Biol.Ther.2016)。因此,如上所述,在进行蛋白质提取之前,将细胞用一系列剂量的EX 1处理8h和24h。蛋白质印迹分析表明,在10hM和100nM的EX 1中,在8h时,所有细胞系均强烈诱导P-JNKThr183/Tyr185(图4)。另一方面,Noxa的诱导只能在OCI-AML3和ME1中检测到,同时使用10nM和100nM的药物以及治疗8小时后。从HEK293细胞制备的对照裂解液中很容易检测到Noxa。
综上所述,这些结果表明,即使EX 1在AML细胞系中始终一致地诱导JNK活化,凋亡或细胞周期停滞的机制仍可能是细胞类型依赖性的。MV4;11和MOLM13基于细胞毒性,线粒体O2·-和细胞周期显示出对EX 1的相似反应,而另一组(KG1、ME1和OCI-AML3)显示出较低水平的细胞毒性反应和细胞周期分布。
3.通过EX 1靶向原代AML细胞
已经确定AML细胞系对EX 1敏感,并部分研究了该药物诱导那些系中细胞死亡的机制,下一步是确定主要AML样品对该化合物的敏感性。对于这些实验,根据皇家阿德莱德人类研究伦理委员会(RAH HREC)的伦理批准(R20170220),从SACRB生物库中检索冷冻保存的去鉴定的AML样品(单核细胞,MNC)。
AML骨髓标本
使用三个健康对照(HC)BMMNC样本(HC61、HC68和HC71)和其他AML样本(从骨髓诊断样本中分离出的MNC,表2)进行了实验。如材料和方法中所述,将细胞解冻,在描述的培养基中恢复过夜,并在第二天检查存活率和细胞数(通过台盼蓝拒染法)。过夜恢复并进行活力检查后,通过用Lymphoprep进行密度梯度离心以去除死细胞,从而纯化了两个样品(AML235和AML342)。纯化后从AML342中回收的活细胞不足以进行实验,因此未使用该样品。将HCs以106个细胞/mL(500μL/孔,一式两份孔)铺在24孔板中,将AMLs以106个细胞/mL的板以2mL/孔/剂量铺在6孔板中。由于BM AML样本中可用的细胞少于L-AML(白细胞去除法),因此这些样本未铺平板以制备蛋白裂解物,而仅用于抗体染色和流式细胞仪分析(AnnexinV/7AAD,以及CD34、CD38和GPR56染色以检测白血病干细胞LSC群体)。还将AML样品铺板在集落测定中,以确定EX 1对AML胚细胞形成细胞的影响。
表2:本研究中使用的AML主要样本的特征
PB:外周血;BM:骨髓;?MLL:可能的MLL改变;t-AML:与治疗有关的AML。
可行性。处理24小时后,与以前一样,在Caspase-Glo3/7分析中使用了10μL细胞,再一次观察到很少甚至没有Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)活化(图5A)。只有AML480对用EX 1处理的细胞的Caspase活性有所提高,但在DMSO中对细胞的活性已经很高,这意味着样品的活力很低。基于该结果,再次进行Caspase-Glo 3/7测定时,将样品再培养一天。在第48小时,与DMSO相比,用EX1处理的所有AML样品的caspase活性均增加(图5B)。然后从所有样品中收集200μL细胞用于Annexin V/7AAD染色,并将800μL AML培养物用于CD34,CD38和GPR56染色。将剩余的细胞再培养一天,并在72h收集用于相同的测定。如先前实验中观察到的,HC样品在存在EX 1的情况下在48h时显示出一定的活力降低(图5C),但在72h内仍保持稳定(图5D)。但是,AML样品对药物的反应随时间发展,生存能力从48h大幅下降至72h(图5C和D)。该实验中使用的样品(HC和AML)也未显示对OXi4503处理的反应。
LSC分析。首先对AML BMMNC样品中的活细胞进行门控,然后确定GPR56+细胞的比例。根据Pabst及其合作者的报告(Pabst et al,Blood 2016),在CD34highAML样本中,CD34+细胞内存在含有LSC的GPR56+群体,而在CD34lowAML样本中,CD34+和CD34都存在包含LSC的GPR56+群体。因此,根据AML235的CD34+/GPR56+门以及AML136和AML480的GPR56+/CD34+和GPR56+/CD34-门估计了包含LSC的亚群(图6A)。响应于EX 1的这些亚群的减少将与靶向重要的包含LSC的区室的药物一致。如图6B所示,流式细胞仪分析表明EX 1以样品依赖的方式以不同的速率影响该细胞群。另一方面,与空白对照组(DMSO)相比,OXi4503处理对AML136几乎没有影响,而对AML235和AML480没有影响(图6B)。如图6C所示,EX 1在低至20nM的浓度下有效降低LSC群体。
原始细胞集落分析。对于集落分析,将AML MNC铺板于添加了细胞因子的甲基纤维素中(请参见“方法”),并在13天后对集落进行评分。从铺板的4个样品中,AML136和AML480在对照组、EX 1或OXi4503中没有任何集落。对于L-AML6,在对照组处理的孔中观察到少量集落和高背景的单细胞(即在半固体培养基中存活但未形成集落的细胞)。相反,在使用任一剂量的EX 1的孔中均未观察到集落或背景细胞(图7A)。用100nM的OXi4503处理该样品可减少背景细胞,并减少集落数量,而500nM则完全阻断集落形成和活细胞的背景(图7A)。L-AML419在DMSO处理的孔中还形成了少量集落,背景细胞较少。两种药物(所有剂量)的处理均完全阻断了该样品的集落和背景形成(图7B)。
蛋白质印迹分析。处理48小时后,为其中两个AML样品(L-AML6和L-AML419)准备了蛋白裂解物。对于样品L-AML419,回收的蛋白质不足,无法进行蛋白质印迹分析。对于L-AML6细胞,使用已在细胞系实验中验证的特异性抗体确定P-JNKThr183/Tyr185和Noxa表达(图4)。对于在500nM用EX 1处理的细胞,观察到P-JNKThr183/Tyr185略有增加,而OXi4503处理则没有明显变化(图8)。Noxa表达是可检测的,但在该样品中非常低,并且在两种药物处理中均未观察到变化。这里要考虑的重要一点是,该样品的蛋白质产量非常低,仅装载20μg的蛋白质用于SDS-PAGE,而50μg的蛋白质用于细胞系样品。
EX 1与其他微管蛋白聚合抑制剂的比较
为了比较EX 1与其他微管蛋白聚合抑制剂的功效,对MV4;11和HL-60AML细胞系(表1)进行了MTS增殖测定。扩增细胞,并在数量足够(且活力高于90%)时将其以1×104个细胞/孔的浓度接种于96孔板中的100μL完全生长培养基中,该完全生长培养基含有终浓度为0.1%DMSO或水。测试EX 1、Oxi4503(EndoTherm,批次#EN09013,在水中)、CA4P(Selleckchem,目录号S7204,在水中)和Plinabulin(Selleckchem,目录号S1176,在DMSO中),并从0.00001nM-1000nM以连续1/10稀释。用化合物培养细胞72小时,然后通过添加CellTiter 96AQueous One Solution试剂(Promega cat#G3581)测量活力,并在492nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism 6中的绝对IC50方法计算IC50。如图9所示,EX 1在两种AML细胞系中的IC50最低,表明它比其他测试的微管蛋白聚合抑制剂更有效。
Claims (13)
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述患者是人类受试者。
3.如权利要求1的方法,其中,所给予的有效量是约0.05至18mg/kg体重/天。
4.如权利要求1的方法,其中,所给予的有效量为约0.4mg至16mg/kg体重/天。
5.如权利要求1的方法,其中,所述化合物通过肠胃外给药来给予。
6.如权利要求1的方法,其中,所述化合物与另一种抗肿瘤药物同时或依次共同给予。
7.如权利要求1所述的方法,其中,基于临床参数选择患者进行治疗,所述临床参数包括年龄、疾病的进展水平和/或其他并发症。
10.如权利要求8的所述的用途或权利要求9的所述的化合物,其中,所述患者是人类。
11.如权利要求8的所述的用途或权利要求9的化合物,其中,所述化合物与另一种抗肿瘤药物组合使用。
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