CN111440877A - 一种用于尖翅燕鱼ssr多重pcr引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR引物，所述SSR多重PCR引物包括30对特异性引物，所述30对特异性引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～60所示。该引物多态性高，PCR产物稳定可靠。还公开了包括该引物的试剂盒、尖翅燕鱼SSR多重PCR的方法以及上述引物、试剂盒在评估尖翅燕鱼遗传多样性以及尖翅燕鱼亲子鉴定中的应用。
Description
技术领域
本发明属于微卫星标记技术领域，具体涉及一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR 引物及其应用。
背景技术
分子标记是群体动态监测、种质资源评估、谱系鉴定和增殖放流效果评估等 研究和应用的重要工具。微卫星(Microsatellite DNA)又称简单重复序列(Simple SequenceRepeats，SSR)，一般指分布于基因组序列中基序在2～6个碱基的重复 序列，微卫星序列作为分子标记具有方法成熟、单位点信息含量高、结果可靠和 成本低廉的优点，结合多重PCR和通用荧光标记引物可使成本更低廉，目前广 泛应用于谱系重构等生产实践中。
尖翅燕鱼(Platax teira)又称蝙蝠鲳，属鲈形目、刺尾鱼亚目、白鲳科、燕 鱼属一种热带及温带地区近岸生活的海水鱼类，分布于印太海域阿拉伯海、印度 尼西亚至日本海海域。尖翅燕鱼因外形奇特，可作为观赏鱼，尤其是幼鱼时，而 且生长非常迅速、肉质鲜美、整个养殖过程可实现配合饲料投喂，是具有潜力的 养殖品种。
现在主要利用电子标签进行家系标记，但是该方法有诸多缺点：(1)该方法 需要单独的空间对每对亲本进行配对和对每对亲本配对产生的子代进行养殖，等 子代长到约15公分才可以注射标签；(2)该方法容易造成鱼体损伤，而尖翅燕 鱼一旦受伤极容易死亡；(3)该方法需要将鱼麻醉实施操作，需要大量劳动力。
应用分子标记具有诸多优点：(1)不需要单独养殖，节省空间和成本；(2) 只需剪取极少量的鳍条即可完成采样，对鱼体无损伤；(3)后续处理只需在实验 室即可操作，操作简单；(4)多重PCR结合通用荧光标记引物与普通PCR相比 可以成倍降低检测成本。但当前还没有应用分子标记(SSR)对尖翅燕鱼进行多 重PCR以及谱系重构方面开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于尖翅燕鱼的SSR多重PCR引物，该引物多 态性高，扩增稳定，结果可靠。
本发明的目的还在于提供一种尖翅燕鱼微卫星多重PCR的方法，该方法鉴 定准确，价格低廉。
本发明的最后一个目的在于提供上述引物，以及包括上述引物的试剂盒在评 估尖翅燕鱼遗传多样性和尖翅燕鱼亲子鉴定方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现的：一种用于尖翅燕 鱼SSR多重PCR引物，所述SSR多重PCR引物包括30对特异性引物，分别为 引物对Pte15，Pte52，Pte65，Pte66，Pte83，Pte84，Pte86，Pte131，Pte165，Pte183， Pte187，Pte214，Pte217，Pte243，Pte254，Pte258，Pte274，Pte308，Pte315，Pte331， Pte335，Pte382，Pte420，Pte457，Pte467，Pte499，Pte507，Pte528，Pte550和 Pte578，其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，所述30对特异性引 物的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～60所示。
进一步的，还包括4条荧光标记的通用引物M13、PQE-F、RV3和pVP16， 所述通用引物M13、PQE-F、RV3和pVP16的碱基序列分别如SEQ ID NO：61～64 所示，与其相配合的荧光标记分别为5-FAM、5-HEX、5-ROX和5-TAMRA。
本发明还提供了一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR的试剂盒，包括上述30 对特异性引物。
进一步的，本发明还提供了另外一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR的试剂盒， 包括上述30对特异性引物以及上述荧光标记的通用引物。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种尖翅燕鱼微卫 星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：
(1)提取尖翅燕鱼DNA：采集尖翅燕鱼亲本样品和子代鳍条组织，提取基 因组DNA；
(2)合成特异性引物：筛选并合成上述30对特异性引物，将30对特异性 引物共分为三组，分别为G1组、G2组和G3组，其中G1组包括引物对Pte65， Pte83，Pte84，Pte131，Pte217，Pte315，Pte335，Pte382，Pte467，Pte550，Pte578， G2组包括引物对Pte86，Pte165，Pte187，Pte258，Pte274，Pte308，Pte331，Pte420， Pte528，G3组包括引物对Pte15，Pte52，Pte66，Pte183，Pte214，Pte243，Pte254， Pte457，Pte499，Pte507；
(3)多重PCR扩增：利用步骤(2)中的三组特异性引物和上述荧光标记 通用引物对步骤(1)中的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
(4)亲子鉴定：对扩增产物进行基因分型，利用基因分型结果对亲本基因 型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
在上述尖翅燕鱼微卫星荧光多重PCR的方法中：
优选的，步骤(3)中PCR扩增时，G1组、G2组和G3组的反应体系分别 如下所示：
G1组多重PCR扩增反应体系为：
| G1组PCR体系反应物 | 含量(μL) |
| Pte65.F(5μM) | 0.06 |
| Pte65.R(5μM) | 0.24 |
| Pte83.F(20μM) | 0.06 |
| Pte83.R(20μM) | 0.24 |
| Pte84.F(20μM) | 0.06 |
| Pte84.R(20μM) | 0.24 |
| Pte131.F(20μM) | 0.06 |
| Pte131.R(20μM) | 0.24 |
| Pte217.F(5μM) | 0.06 |
| Pte217.R(5μM) | 0.24 |
| Pte315.F(10μM) | 0.06 |
| Pte315.R(10μM) | 0.24 |
| Pte335.F(20μM) | 0.06 |
| Pte335.R(20μM) | 0.24 |
| Pte382.F(10μM) | 0.06 |
| Pte382.R(10μM) | 0.24 |
| Pte467.F(5μM) | 0.06 |
| Pte467.R(5μM) | 0.24 |
| Pte550.F(20μM) | 0.06 |
| Pte550.R(20μM) | 0.24 |
| Pte578.F(5μM) | 0.06 |
| Pte578.R(5μM) | 0.24 |
| M13(10μM) | 0.36 |
| PQE-F(10μM) | 0.36 |
| RV3(10μM) | 0.36 |
| pVP16(10μM) | 0.36 |
| BSA(2mg/mL) | 0.45 |
| DNA(50ng/μL) | 2.0 |
| Taq HS(Takara) | 12.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 5.31 |
| Total | 25.0 |
G2组多重PCR扩增反应体系为：
| G2组PCR体系反应物 | 含量(μL) |
| Pte86.F(20μM) | 0.06 |
| Pte86.R(20μM) | 0.24 |
| Pte165.F(20μM) | 0.06 |
| Pte165.R(20μM) | 0.24 |
| Pte187.F(10μM) | 0.06 |
| Pte187.R(10μM) | 0.24 |
| Pte258.F(10μM) | 0.06 |
| Pte258.R(10μM) | 0.24 |
| Pte274.F(10μM) | 0.06 |
| Pte274.R(10μM) | 0.24 |
| Pte308.F(20μM) | 0.06 |
| Pte308.R(20μM) | 0.24 |
| Pte331.F(20μM) | 0.06 |
| Pte331.R(20μM) | 0.24 |
| Pte420.F(10μM) | 0.06 |
| Pte420.R(10μM) | 0.24 |
| Pte528.F(10μM) | 0.06 |
| Pte528.R(10μM) | 0.24 |
| PQE-F(10μM) | 0.48 |
| RV3(10μM) | 0.36 |
| pVP16 10μM) | 0.36 |
| BSA(2mg/mL) | 0.45 |
| DNA(50ng/μL) | 2.0 |
| Taq HS(Takara) | 12.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 6.15 |
| Total | 25.0 |
G3组多重PCR扩增反应体系为：
本申请中的引物浓度是根据扩增效果优化获得的，体系配置过程：首先根据 要求配置引物粗存液，然后按照1:4混合正向引物和反向引物，再等量混合中的 引物对混合液，最后根据检测样品数量配置扩增体系。该配置过程避免了引物单 个添加引起的误差，提高了实验稳定性，适合于批量扩增。
优选的，步骤(3)中PCR扩增时，采用的扩增程序为：98℃10s，57℃40s， 72℃60s，35个循环；98℃10s，53℃40s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸 30min。
优选的，步骤(4)中分型方法采用毛细管电泳技术，具体的，对扩增产物 在ABI3730XL基因分析仪上进行基因分型。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的SSR多 重PCR引物、以及试剂盒在评估尖翅燕鱼遗传多样性和尖翅燕鱼亲子鉴定方面 的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明利用微卫星标记、多重PCR和通用扩增引物技术的结合，筛选 了30个高度多态性微卫星位点，并根据这些微卫星位点设计了特异性引物，对 尖翅燕鱼进行分型；
(2)本发明除了可以一次将G1、G2和G3组组合，同时检测30个位点之 外，实际应用中还可以通过调整G1、G2和G3组的数量，可以检测9个(单独 用G2组)、10个(单独用G3组)、11个(单独用G1组)、19个(将G2和G3 组组合)、20个(将G2和G1组组合)、21个(将G3和G1组组合)位点(将 G1、G2和G3组组合)等，也可以根据亲本样品和子代样品的数量，选择30对 引物中的一对或多对合适的引物进行扩增，且通用引物可以重复利用，相对于简 单的单位点检测，效率提高，费用降低；
(3)本发明中包含的微卫星位点为3-6碱基，等位基因大小判读更加准确， 提高了基因型数据的准确性；
(4)本发明中的尖翅燕鱼微卫星荧光多重PCR的方法，该方法选用可靠有 效的微卫星引物组合，提供一种利用多重PCR技术对尖翅燕鱼群体进行分型的 方法，根据开发的引物和试剂盒，可用于群体遗传学研究、种质资源评估、谱系 鉴定和增殖放流效果评估等方面。
具体实施方式
下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1
本实施例提供的用于尖翅燕鱼的SSR多重PCR引物，包括30对特异性引 物，分别为引物对Pte15，Pte52，Pte65，Pte66，Pte83，Pte84，Pte86，Pte131， Pte165，Pte183，Pte187，Pte214，Pte217，Pte243，Pte254，Pte258，Pte274，Pte308， Pte315，Pte331，Pte335，Pte382，Pte420，Pte457，Pte467，Pte499，Pte507，Pte528， Pte550和Pte578，其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，30对特异 性引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～60所示，各引物的序列如下表1：
表1 30对特异性引物的碱基序列
还包括4条荧光标记的通用引物M13、PQE-F、RV3和pVP16，通用引物 M13、PQE-F、RV3和pVP16的碱基序列分别如SEQ ID NO：61～64所示，与其 相配合的荧光标记分别为5-FAM、5-HEX、5-ROX和5-TAMRA。具体序列如下 表2：
表2 4条通用引物和与通用引物相配合的荧光标记
实施例2
本实施例提供的尖翅燕鱼微卫星多重PCR的方法，首先根据微卫星位点， 筛选并设计出三组微卫星扩增引物组合，共包含30对特异引物，然后分成三组， 不同组在不同反应管中加入各自组的特异引物对和荧光标记的通用引物，经PCR 扩增出多个目的片段，通过电泳将不同引物的多个扩增产物加以分离，最后对分 离条带进行统计，根据孟德尔定律进行亲子鉴定。
具体的，本实施例提供的尖翅燕鱼微卫星多重PCR的方法，包括以下步骤：
(1)提取尖翅燕鱼DNA：采集待鉴别的尖翅燕鱼亲本样品和子代鳍条组织， 提取基因组DNA；
(2)筛选出三组多重SSR-PCR引物
根据尖翅燕鱼基因组参考序列，统计微卫星的分布和分类特点，通过对群体 重测序数据分析，对微卫星进行分型、筛选高多态水平和3-6碱基重复单元的微 卫星，评估引物的扩增特异性和引物组合之间的兼容性，筛选出三组多重 SSR-PCR组合，用G1、G2和G3表示，分别包含11个、9和10个微卫星位点， 如下表3、表4和表5中所示，微卫星序列使用荧光通用引物标记，利用毛细管 电泳仪自动分型，通用引物如表6所示。
表3 G1组微卫星位点扩增的特异引物对
表4 G2组微卫星位点扩增的特异引物对
表5 G3组微卫星位点扩增的特异引物对
表6通用引物
| 序号 | 引物对 | 引物序列 | 荧光标记 |
| 1 | M13 | tgtaaaacgacggccagt | 5-FAM |
| 2 | PQE-F | ttgagaggatcgcatcca | 5-HEX |
| 3 | RV3 | agcaaaataggctgtccc | 5-ROX |
| 4 | pVP16 | gccgacttcgagtttgag | 5-TAMRA |
(3)上述引物在商业公司合成；
(4)PCR扩增：扩增程序为98℃10s，57℃40s，72℃60s，35个循环；98℃ 10s，53℃40s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸30min。扩增体系如下表7-9：
表7 G1组多重PCR扩增体系
表8 G 2组多重PCR扩增反应体系
| G2组PCR体系反应物 | 含量(μL) |
| Pte86.F(20μM) | 0.06 |
| Pte86.R(20μM) | 0.24 |
| Pte165.F(20μM) | 0.06 |
| Pte165.R(20μM) | 0.24 |
| Pte187.F(10μM) | 0.06 |
| Pte187.R(10μM) | 0.24 |
| Pte258.F(10μM) | 0.06 |
| Pte258.R(10μM) | 0.24 |
| Pte274.F(10μM) | 0.06 |
| Pte274.R(10μM) | 0.24 |
| Pte308.F(20μM) | 0.06 |
| Pte308.R(20μM) | 0.24 |
| Pte331.F(20μM) | 0.06 |
| Pte331.R(20μM) | 0.24 |
| Pte420.F(10μM) | 0.06 |
| Pte420.R(10μM) | 0.24 |
| Pte528.F(10μM) | 0.06 |
| Pte528.R(10μM) | 0.24 |
| PQE-F(10μM) | 0.48 |
| RV3(10μM) | 0.36 |
| pVP16 10μM) | 0.36 |
| BSA(2mg/mL) | 0.45 |
| DNA(50ng/μL) | 2.0 |
| Taq HS(Takara) | 12.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 6.15 |
| Total | 25.0 |
表9 G3组多重PCR扩增反应体系
(5)扩增样品送至商业公司采用ABI 3730XL进行基因型分型；
(6)亲子鉴定：将多重PCR产物在自动测序仪(ABI 3730XL)上进行分 型，读取个体基因型，根据孟德尔定律判断是否具有亲子关系。
实施例3
以下通过具体实施例来说明上述的SSR荧光标记引物在尖翅燕鱼亲子鉴定 中的应用。
(1)提取尖翅燕鱼DNA
剪取尖翅燕鱼86个亲本和190个子代个体鳍条并立即保存在95％乙醇中， 亲本即为P1-P190，子代标记为Pte1-Pte190，利用海洋动物组织基因组DNA提 取试剂盒提取基因组总DNA，具体步骤参见试剂盒使用说明。DNA提取完毕后 使用紫外分光光度计检测浓度。
(2)合成引物
按照表1和表2中的序列和荧光标记要求合成引物。
(3)多重PCR扩增
每个个体按照表7、表8和表9体系进行PCR扩增。
PCR反应程序设定：98℃10s，59℃30s，72℃60s，30个循环；98℃10s，53℃ 30s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸30min。
PCR结束后，取5μL在琼脂糖凝胶上电泳检测有期望大小弥散条带，其余 送至商业公司采用ABI 3730XL进行基因型分型；
(4)利用软件GeneMarker V2.2.2.0进行将峰型转换为等位基因，表10是亲 本群体遗传学参数，所有标记的期望杂合度均大于0.5。
表10尖翅燕鱼30个微卫星位点遗传学参数
注：Locus：位点，N：个体数，Na：等位基因数，Ne：有效等位基因数，I： 香农信息指数，Ho：观测杂合度；He，期望杂合度；F：固定指数。
(5)利用软件Colony 2.0.6.5进行亲子鉴定，结果表明在亲本群体中只有 P21、P30。P35、P39、P53和P77参与了传代，子代群体中存在5个全同胞家系， 且各家系比例严重不均衡，其中家系PteF1和PteF5只有一个亲本存在于采集的 亲本群体中。
表11尖翅燕鱼亲子对应关系
注：#表示亲本不存在。
以上结果表明，本发明的微卫星30对引物构成的多重PCR方法在尖翅燕鱼群 体分型中稳定，准确，满足尖翅燕鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估的 要求。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR引物及其应用
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 1
gccgacttcg agtttgagcg ggagagtacc actcactgta 40
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 2
aatgagcacc aggctgaata at 22
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 3
ttgagaggat cgcatccaat tacaggcatt gtccaggagt 40
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 4
aggtaaagcc acagaactgc tc 22
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 5
gccgacttcg agtttgagag gaaataccct ccctgacatt 40
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<211> 22
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 6
gaccacacct aaatctgcct tc 22
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<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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ataggagcaa cctttcctgg at 22
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
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agcaaaatag gctgtcccac cgatatgaca tcaaccacaa 40
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<211> 40
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 13
ttgagaggat cgcatccaag agcagtggag ctctccttta 40
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 14
cacatcctct ctatgttgtc cg 22
<210> 15
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<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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ttgagaggat cgcatccaca ggtgggagat gatgagtgta 40
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<212> DNA
<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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gccaatcgca tgattaggtt at 22
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acatgtctgc atctggatca at 22
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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accacagtgt gtgtgtgtgt gt 22
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agcaaaatag gctgtccctg aggtagccaa gcttacacaa 40
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accacatttc tgaatctgcc tt 22
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ccaactcctt tctgtgtatt gtg 23
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 55
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
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<213> 尖翅燕鱼(Platax teira)
<400> 60
tctataggtc ctggtgccct aa 22
Claims (9)
1.一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR引物，其特征是：所述SSR多重PCR引物包括30对特异性引物，分别为引物对Pte15，Pte52，Pte65，Pte66，Pte83，Pte84，Pte86，Pte131，Pte165，Pte183，Pte187，Pte214，Pte217，Pte243，Pte254，Pte258，Pte274，Pte308，Pte315，Pte331，Pte335，Pte382，Pte420，Pte457，Pte467，Pte499，Pte507，Pte528，Pte550和Pte578，其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，所述30对特异性引物的碱基序列分别如SEQ IDNO：1～60所示。
2.根据权利要求1所述的用于尖翅燕鱼SSR多重PCR引物，其特征是还包括4条荧光标记的通用引物M13、PQE-F、RV3和pVP16，所述通用引物M13、PQE-F、RV3和pVP16的碱基序列分别如SEQ ID NO：61～64所示，与其相配合的荧光标记分别为5-FAM、5-HEX、5-ROX和5-TAMRA。
3.一种用于尖翅燕鱼SSR多重PCR的试剂盒，其特征是：包括权利要求1中的30对特异性引物。
4.根据权利要求3所述的用于尖翅燕鱼SSR多重PCR的试剂盒，其特征是：还包括权利要求2中荧光标记的通用引物。
5.一种尖翅燕鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)提取尖翅燕鱼DNA：采集尖翅燕鱼亲本样品和子代鳍条组织，提取基因组DNA；
(2)合成特异性引物：筛选并合成权利要求1中的30对特异性引物，将30对特异性引物共分为三组，分别为G1组、G2组和G3组，其中G1组包括引物对Pte65，Pte83，Pte84，Pte131，Pte217，Pte315，Pte335，Pte382，Pte467，Pte550，Pte578，G2组包括引物对Pte86，Pte165，Pte187，Pte258，Pte274，Pte308，Pte331，Pte420，Pte528，G3组包括引物对Pte15，Pte52，Pte66，Pte183，Pte214，Pte243，Pte254，Pte457，Pte499，Pte507；
(3)多重PCR扩增：利用步骤(2)中的三组特异性引物和权利要求2中的荧光标记通用引物对步骤(1)中的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
(4)亲子鉴定：对扩增产物进行基因分型，利用基因分型结果对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
6.根据权利要求5所述的尖翅燕鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(3)中PCR扩增时，G1组、G2组和G3组的反应体系分别如下所示：
G1组多重PCR扩增反应体系为：
G2组多重PCR扩增反应体系为：
G3组多重PCR扩增反应体系为：
7.根据权利要求5所述的尖翅燕鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(3)中PCR扩增时，采用的扩增程序为：98℃ 10s，57℃ 40s，72℃ 60s，35个循环；98℃ 10s，53℃40s，72℃ 60s，15个循环；最后72℃延伸30min。
8.根据权利要求5所述的尖翅燕鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：其特征是：步骤(4)中对扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行基因分型。
9.权利要求1或权利要求2所述的SSR多重PCR引物、以及权利要求3或权利要求4中的试剂盒在评估尖翅燕鱼遗传多样性和尖翅燕鱼亲子鉴定方面的应用。
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