CN111434780A - 一种影响猪毛囊发育的unc5d突变基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因及其应用。本发明提供的影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因有7个突变位点，物理位置在猪的第15号染色体的50201782到50441773之间，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示。本发明找到了猪无毛性状关键基因，通过对无毛性状的分析研究，为人类遗传性脱发疾病研究提供重要借鉴和动物模型。利用本发明的UNC5D突变基因对猪进行辅助育种，能够有效的选择出能稳定遗传的无毛性状的母猪，进而能够实现短时间、低成本、高准确性的选育品种优良的疾病模型猪，其次也可以作为鉴定导致遗传性无毛症产生的分子标记，进一步还可以应用于哺乳动物的毛发发育研究。

Description

一种影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学医学领域，具体是一种影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因及其应用。

背景技术

人类对遗传性脱发和稀发十分关注，毛囊形态结构和功能的稳定是毛发周期正常的关键。毛囊形态结构和功能是先天性的，人们对毛囊的遗传机理做了诸多研究，期望从源头上解决脱发问题。猪在医学上具有重要意义，猪与人类遗传同源性非常高，其基因组与人的基因组相似、复杂程度和染色体组成也较为一致，且人和猪同线性区域的保守性是人与小鼠的3倍。因此，猪现在作为医学研究的理想模式动物，用来研究人类医学问题。

无毛猪具有毛囊发育不全的特征，其躯体被毛稀疏，因此，可以以无毛猪作为研究人类毛发领域疾病的动物模型。为了筛选可作医学研究动物模型的无毛猪，需要有一种简单、方便、有效的区分正常和无毛猪性状的分子标记，以实现对无毛猪的精准鉴定。毛发发育开始于胚胎时期，而通过分子标记技术可以在母猪妊娠时对母及与配公猪进进行筛选。从而确保受精妊娠后所产仔猪全部为无毛仔猪。因此需要对影响猪毛囊发育的相关蛋白和相应突变基因进行研究，目前尚无相关研究报道。

神经生长因子受体5(Unc-5netrin receptor D，UNC5D)，UNC5D是人类依赖受体UNC5家族的第4个成员，在神经信号传导，轴突导向，锥形神经元分化，神经蛋白激活信号通路以及神经元的迁移调节方面发挥重要的作用。既往对小鼠UNC5同源物UNC5A、UNC5B和UNC5C的体外和体内研究表明，UNC5B是肿瘤抑制因子p53的直接转录靶点，介导p53诱导的细胞死亡。虽然我们之前也发现了p53直接靶向UNC5D的表达，但是，UNC5D功能的具体发挥作用尚不清楚。在本发明的前期试验中，通过筛选发现，UNC5D蛋白的一些候选基因与无毛性状以及动物的毛囊发育存在关联。

发明内容

本发明的目的在于提供一种影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因，可应用在猪的基因分型、筛选及辅助育种中。

本发明提供的影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因，该突变基因有7个突变位点，物理位置在猪的第15号染色体的50201782到50441773之间，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示,所述7个突变位点分别是：

SEQ ID NO1：5’非翻译区第25位C>T，第154位T>G,第221位A>G，第487位A>T；

SEQ ID NO2：2号外显子第184位C>T；

SEQ ID NO3：10号外显子第269位G>A；

SEQ ID NO4：17号外显子第217位C>T。

本发明通过以下技术手段实现：

步骤1：通过先期发现的无毛大白猪，对大白猪无毛个体进行扩群，构建大白猪无毛性状实验群体；

步骤2：对猪的毛囊及表皮组织切片观察并鉴定有毛无毛性状型,排除其中一些表型为无毛但是有毛囊组织的有毛猪；

步骤3：通过全基因组关联分析(GWAS)和基因组重测序从DNA水平上挖掘猪无毛性状候选基因区域，全基因组关联分析探寻无毛性状显著SNP位点，GO分析和KEGG分析查找候选基因的相关功能，基因组重测序挖掘猪无毛性状候选基因区域，通过多组学相互验证分析；

步骤4：采集无毛和有毛猪组织，通过定量PCR、HE染色和免疫组化，从RNA和蛋白水平上验证UNC5D基因在不同个体及不同时期的表达差异，验证目标突变基因的功能。

本发明提供的影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因，突变的碱基包括同义突变和错义突变两种类型，包括同义突变和错义突变两种类型，其中错义突变发生在10号外显子上，第269位碱基由C变为T,相对应的氨基酸由V变为M。

本发明的有益效果是：

1、突变基因位点精准，提供了重要的动物模型：本发明利用整合组学策略精准筛选无毛性状候选基因技术手段，将DNA水平多层次的生物信息进行整合利用，精准筛选候选基因，通过对不同时期的RNA和蛋白的水平进行检测，对候选基因进行功能验证，找到了猪无毛性状关键基因，通过对无毛性状的分析研究，为人类遗传性脱发疾病研究提供重要借鉴和动物模型。

2、提供了一种无毛性状的分子标记：可通过本发明提供的分子标记来对无毛猪进行选育纯化，也可对遗传性无毛症进行鉴定。

3、提供了可供研究使用的大白猪无毛试验群体：本发明的试验群体是先期发现的少量大白无毛猪，利用了遗传育种理论，对发现的大白猪无毛个体进行了扩群，为开展毛囊发育和模型动物的研究提供了具有价值的实验材料。

4、集成多学科技术对猪无毛性状进行遗传解析，结果更为准确：本发明整合了多组学思想进行交叉验证分析，涉及多种学科，包括到细胞学、分子生物学、统计基因组学、生物信息学和计算机学等多个领域对猪无毛性状进行遗传解析，得到了更为准确的结果，也减小一些假阳性的存在，在解析无毛性状遗传机理的同时为复杂性状的研究提供新的思路。

附图说明

图1为影响猪毛囊发育的UNC5D基因突变位点混池测序峰形图。

具体实施方式

步骤1：将少量无毛猪按照育种理论进行扩群，建立了12个含有无毛个体的公猪家系。一共收集了120头来自同一场的大白猪，包括无毛个体60头，正常个体60头；为后期表型验证和无毛性状候选基因的筛选做准备。

步骤2：以19日龄仔猪为研究对象(无毛和正常猪毛干和毛囊对比最为明显)，测量单位面积(cm²)毛干数。在背部相同部位检测毛干数，将每平方厘米区域内毛干数小于等于3根(平均数+标准差)的猪判定为无毛猪，多于等于6根(平均数－标准差)的为正常猪。同时将背部组织进行横切和纵切，通过HE染色观察，横切HE用来观察单位面积毛囊数的多少，而纵切则是观察毛囊形态和周期的发育情况。从毛囊发育情况进行辅助无毛性状判定。

步骤3：采集同时含无毛和正常猪个体的家系200头，对所选个体详细记录表型信息和系谱信息，并收集后期性能测定信息，耳静脉采血，提取基因组DNA，采用lluminaPorcine80KSNP芯片测定基因型。采用病例对照家系分析模型对影响猪无毛性状性状进行全基因组关联分析(GWAS)，筛选与目标性状显著关联的SNP位点，进一步寻找与猪胚胎期毛囊发育相关的候选基因。筛选得到UNC5D、UNC5D等基因与动物的毛囊发育有关，可能是大白猪无毛性状的潜在候选基因。GO功能分析发现差异基因在细胞成分，分子功能和生物过程等方面显著富集毛囊形态发育，细胞结构骨架和成纤维细胞分化等毛囊发育过程。KEGG通路分析发现部分差异基因注释在WNT，shh等通路中，存在于这些通路的重要差异基因可作为猪胚胎时期毛囊发生、发育关键的候选基因。

分型后的原始数据经过严格的质控后，分析结果由Bonferroni进行校正，筛选到与无毛性状显著关联的SNP位点125个，对显著SNP位点上下游1MB的基因进行检索，共检索到基因23个，其中13个包含关联SNP位点。

采集含有7个公猪家系的74头猪耳样，包含公猪，母猪及后代仔猪的家系样本进行DNA提取后，利用重测序技术对候选基因进行了精确分析检测，对比有毛和无毛猪的候选基因序列信息，找到了产生性状分离的致因突变。并对产生突变的位点与无毛性状进行了关联分析。发现突变位点与无毛性状有显著相关。，利用氨基酸分析软件与蛋白比对软件，从突变位点中筛选出相关的同义突变和错义突变。并对正常猪、无毛猪以及其他脊椎动物的氨基酸比对，观察突变位点是否位于高保守性区域。

根据以上实验结果筛选出了影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因。该突变基因有7个突变位点，物理位置在猪的第15号染色体的50201782到50441773之间，其核苷酸序列如SEQID NO:1～4所示。

步骤4：根据步骤2的结果发现毛囊在出生后仔猪的皮肤组织已经发育完全，毛囊开始发育的时期是在胚胎时期。根据步骤3结果发现有毛猪和无毛猪的后代均存在有毛和无毛两种性状，随后对亲本分别为有毛和无毛两种性状的不同时期的妊娠母猪进行流产，采取处于毛囊发育不同时期的胚胎，进行定量PCR，验证UNC5D基因在有毛和无毛猪胚胎时期的表达差异情况，以及在不同组织中的表达差异；对不同发育时期胚胎的皮肤组织进行HE染色，通过观察横切和纵切的染色结果，判定有毛和无毛的性状，以及不同时期毛囊所处的发育阶段；对不同发育时期胚胎的皮肤组织的UNC5D基因进行免疫组化，观测UNC5D蛋白的表达情况和作用部位。

表1 UNC5D突变位点的检测引物

实验结果：确定了UNC5D突变基因上的7个突变位点。

在UNC5D基因上共发现影响猪毛囊发育的7个突变位点，物理位置在猪的第15号染色体的50201782到50441773之间，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示,包括同义突变和错义突变两种类型，其中错义突变发生在10号染色体上，第269位碱基由G变为A,相对应的氨基酸由V变为M。所述7个突变位点分别是：

SEQ ID NO1：5’非翻译区第25位C>T，第154位T>G,第221位A>G，第487位A>T；

SEQ ID NO2：2号外显子第184位C>T；

SEQ ID NO3：10号外显子第269位G>A；

SEQ ID NO4：17号外显子第217位C>T。

表2影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因的7个突变位点

通过全基因组关联分析我们发现这7个显著位点都与毛囊的形态发育有着极显著的关系。结果表明这7个位点的突变情况都有可能影响到毛囊发育过程。由于无毛性状并不是一个完全的质量性状，在无毛和正常猪之间通常还存在着一定数量的稀毛猪。这些突变位点对表型的作用是累加的，每个突变的作用是微小的。这些位点的突变导致无毛性状产生的概率大大增加。碱基的改变会导致氨基酸产生错义突变和同义突变。

错义突变会导致氨基酸的改变，从而影响到蛋白空间结构和功能的正常发挥和表达，进而影响表型。同义突变不会造成相对应氨基酸的改变，但是很多单核苷酸替换会改变mRNA的剪切效率或准确性。在大部分的外显子中存在外显子剪切增强子(ESE)及沉默子(ESS)元件。大部分的ESE都与剪切位点距离较远，一些使ESE失活的点突变就会导致部分或完全的外显子步移，这样就会影响表达蛋白产物的结构和数量，进而对表型产生影响。通过定量PCR结果，我们进一步发现了UNC5D基因在不同妊娠时期有毛猪和无毛猪之间存在着显著差异，通过HE染色观测，确定了UNC5D基因特异性高表达的妊娠时期。根据免疫组化的结果，更是进一步确定了UNC5D基因表达和作用的具体部位。综上我们发现UNC5D基因在毛囊形态发育过程中特异性高表达并且在有毛和无毛猪中差异显著，说明UNC5D在毛囊形态发育过程中发挥重要功能。

根据本发明的实施例，该方法通过对待测猪进行前面所述的分子标记的检测，以便确定待测猪的无毛性状。由此利用本发明的位点对猪进行辅助育种，能够有效的选择出能稳定遗传的无毛性状的母猪，进而能够实现短时间、低成本、高准确性的选育品种优良的疾病模型猪，其次也可以作为鉴定导致遗传性无毛症产生的分子标记，进一步还可以应用于哺乳动物的毛发发育研究。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因及其应用

<130> MP1900904Z

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 609

<212> DNA

<213> 猪(Swine)

<400> 1

gtaagaagca atgaagcaga gtcatcgctt ctgctttttt ctttttatcg tgttctctcc 60

actcctcagt tccctaccct taggagagac tcatacctct tttgtttact taggcaaatg 120

taactataag tgttcaacta aaaactcata gctgttagtg atttatttta gttcttagcc 180

ttgaaagtga gatggtatat ggggcaggag ggctggggta gagaatgatg gtcaaagggc 240

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<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> 猪(Swine)

<400> 2

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ctgcttcagc aaaagagagg ggagaggaca gtaagaaacc at 342

<210> 3

<211> 605

<212> DNA

<213> 猪(Swine)

<400> 3

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ggatgtcatg taagattcac ttttaagatg ttgactgtcc ctgtaccaga gcaacaaaca 600

ctggt 605

<210> 4

<211> 478

<212> DNA

<213> 猪(Swine)

<400> 4

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ttcccactgt ggcacagtca gttaagaatc caactgcagc ggctcaggtt actgcaga 478

Claims (2)

1.一种影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因，其特征在于，该突变基因有7个突变位点，物理位置在猪的第15号染色体的50201782到50441773之间，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示,所述7个突变位点分别是：

SEQ ID NO1：5’非翻译区第25位C>T，第154位T>G,第221位A>G，第487位A>T；

SEQ ID NO2：2号外显子第184位C>T；

SEQ ID NO3：10号外显子第269位G>A；

SEQ ID NO4：17号外显子第217位C>T。

2.权利要求1所述影响猪毛囊发育的UNC5D突变基因在猪的基因分型、筛选、鉴定及辅助育种中的应用。

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