JP2018516577A - 高感度ｃｇｈ解析のための方法、支持体及びキット - Google Patents

Abstract

検査されるＤＮＡ試料ごとの単一のアレイの使用を含む、ＣＧＨ法により常染色体及び性染色体のゲノムＤＮＡにおける染色体不均衡を評価する新しい方法が記載される。ハイブリダイゼーション反応数の大幅な削減を含むこの方法は、例えばＩＶＦプロトコルの場合等に発生する、事前に性別が不明なＤＮＡ試料中の染色体不均衡の判定に最も有益に適用できる。本発明は更に、バイアスを低減することを目的とした、且つ上記方法で使用される基準ＤＮＡの品質を管理するためのデータ処理を含む。また、上記方法を実行するための支持体及びキットも提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、競合的ゲノムハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐｅｔｉｖｉｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＣＧＨ）を介した染色体不均衡解析の分野に属する。

マイクロアレイは研究中のゲノム全体に亘る多数の顕微鏡的及び超顕微鏡的な染色体異常を検出する可能性を有しているため、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＣＧＨ）の分野では、マイクロアレイの導入によって従来の細胞遺伝学的分析に優る明白な利点が提供されるようになった（文献１参照）。染色体解析は、（末梢血リンパ球又は胎児血液、卵母細胞又は派生した極体及び精子、胚及び任意の関連生検の割球、絨毛膜絨毛、羊水細胞、皮膚、骨髄、胎児組織（例えば肺、肝臓）、固形腫瘍、並びに腹水を含む）多くの供給源に由来する細胞について１つの実験において実行することが可能である。この技術に関連する既存の方法としては、第一に、これらの細胞からの遺伝物質の単離が挙げられる（文献２〜３参照）。

ハイスループットなマイクロアレイ技術は、獣医学においても、診断用検査及び予後検査の開発、並びに新規の治療標的の特定のために、その潜在的な役割を提供している（文献４参照）。

多数の研究により、遺伝性の染色体異常は生殖効率に影響を与え得、長年に亘り動物育種で達成されてきた成果を危うくしていることを示した。過去４０年間に渡り、先天的な染色体異常が概して臨床的障害（主に受精障害）に関連していることを報告する数百の科学出版物が出版されてきた。毎年、世界中で、約８，０００〜１０，０００の染色体解析が主にウシ（文献５〜６参照）、ブタ（文献７参照）、及びウマについて実施されている。例えば、ウマの細胞遺伝学的分析によって先天性異常、胚損失及び不妊症を引き起こす染色体異常が特定されることにより、馬産業は利益を得てきたが、このことは、動物繁殖における染色体の役割の近年における概念を強調するものである（文献８〜９参照）。更に、多くのヒト疾患及び動物疾患は発病原因を共有しているため、動物疾患はヒト疾患に対する良好な比較モデルであり、「ワンメディシン（ｏｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」という概念が提唱されている。特定の相互依存的な研究領域が存在しており、最も近い領域の１つは腫瘍学であるとされる（文献１０〜１１参照）。

染色体の数的異常（異数性）は、培養されたがん幹細胞（ｓｔａｍｉｎａｌ， ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）、並びに、特にヒトの卵母細胞及び胚において非常によく見られるものであり、自然なサイクル(ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｃｌｅ)及び受胎補助技術を用いたサイクル両方に対して種々の負の結果と関連している。誤った数の染色体（異数性）を含む胚は、子宮への移植が上手く行かずに流産したり、重大な医学的問題を抱える新生児をもたらす場合がある。従って、適切な選択のために、医師及び医師を補助する胎生学者に有用な手段として、正常胚と異数性胚とを区別するための信頼できる技術を考えることは、合理的であると思われる。この考え方は、多くはＰＧＳ（着床前遺伝子スクリーニング）と称される体外受精（ＩＶＦ）分野より得られる様々な試料において染色体異常を検出するための様々な方法の開発に繋がった（文献１２〜１３参照）。

ＰＧＳは、子宮移植用に選ばれた胚が正常な染色体を有することを確実にすることにより、ＩＶＦ等の生殖介助処置の結果の改善を模索する方法である。遺伝学の進歩と発生学の進歩の組合せにより、不妊症治療に新時代の到来が告げられる態勢にあるように思われる。特に、異数性試験は、細胞に存在する染色体の数を数えるプロセスの記述に使用される名前であり、ＣＧＨは染色体の存在の検出、及び増幅又は欠失したＤＮＡ配列のゲノム上の位置の特定に使用されている技術である。細胞が正確に４６本の染色体を有していない場合、「異数体」として明確となる（文献１４、１５、１６参照）。

過剰染色体の発生に加えて、胚からの染色体欠失が生じる場合がある（各々の現象はそれぞれ、「重複（ＧＡＩＮ）」又は「欠失（ＬＯＳＳ）」と称される）。ほとんどの場合、染色体における欠失又は重複は、正常に移植又は成長しない胚をもたらす。胚のＣＧＨ試験は、母親の子宮に移植する前に、又は将来的な利用のために凍結する前に、各々の胚における染色体の数を決定することを可能にする。

ＩＶＦを通じて作製された個々の胚を検査し、存在する染色体の数を数えることは可能である。これは、胚発生３日目又は５日目の胚から細胞を取り、それらの細胞に対して検査を実行して、それらの遺伝子状態を解析することにより、行われる。この細胞除去については、胚が数回、細胞分裂することで容易に相殺することができる。有能な者の手によれば、胚生検は、その成長がわずかに遅くなるかもしれないが、その成長にほとんど影響を与えることはない（文献１７、１８参照）。

ＰＧＳと並んで、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）は、遺伝子機能に影響を与える変異又は染色体全体若しくは染色体領域のコピー数に影響を与える異常のいずれかを原因とする遺伝性遺伝子疾患を持たない胚を特定することを目的とする。遺伝的に正常な胚の選択と優先的な移植は、確立した妊娠が健常となる確率を高くし、妊娠中絶の考慮が必要となり得る可能性を減らし、場合によっては、一家から遺伝病を根絶する助けとなる（文献１９参照）。ＰＧＳの手順とＰＧＤの手順は共に、ＩＶＦ技術を用いた胚の作製と、その後の胚性物質の生検及び試験を含む。

染色体異常を有する胚の移植は健常な出生をもたらす可能性は低いことから、正倍数体の胚を特定し優先的に移植するよう努めるべきであるとの提案がなされている。理論的には、これを実践することにより、ＩＶＦ後に達成される着床率及び妊娠率が改善されるはずである。

過去１０年間の間に、生育し得る胚の特定及び移植を補助するために染色体スクリーニング戦略を採用する不妊治療院の数が増えてきている。このアプローチは、ほとんどの場合、異数体の卵母細胞及び／又は胚を生じるリスクが高いとされた患者、特に、反復着床不全（ＲＩＦ）（すなわち反復性の妊娠損失）を経験しているカップル、又は女性パートナーが後期出産可能年齢（ａｄｖａｎｃｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｇｅ：ＡＲＡ）にあり男性要因が存在するカップルを対象としてきた（文献２０、２１、２２参照）。

ＰＧＳはＰＧＤと密接に関連しているが、ＰＧＳの臨床応用にはまだかなりの議論が必要であることが分かっている。過去数年の間に、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いるＰＧＳの診断的価値、胎児生存率に対する１細胞期又は２細胞期割球生検の影響、及び正倍数性／異数性の正確な診断に卵割期のモザイク現象が与える影響に関して、議論が生じた（文献２３、２４参照）。

蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は生検材料中の染色体を検査するのに好まれる方法であり、卵母細胞又は胚あたり５〜１２本の染色体をスコア化する様々なプロトコルが報告されてきた。しかし、２３対全ての染色体対の完全な核型分析の利用には至っていない（文献２５、２６参照）。

一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ技術はＣＧＨアレイとは異なり、ＤＮＡ試料中の細胞コピー数変化（ｃｅｌｌｓ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）の決定に使用することもできる。使われる機構が異なり、競合的比較を必要とせず、ＳＮＰアレイ法は個々の対立遺伝子の定量化とその後の放射量算出に頼っている。ノイズレベルが上昇し、プロトコルが長くなり、データ解釈が複雑となり、二倍体試料に適用が限定されるなどの不都合がある（文献２７参照）。

近年、ＣＧＨ、スペクトル核型決定法、プライムドｉｎ ｓｉｔｕ標識（ＰＲＩＮＳ）法、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）法などのより高度な手法の導入によって、全２３染色体対の核型分析が可能となった。これらの新しい方法論は、時間、科学技術、及びコストについて、むしろ集約的であることが判明した（文献２８参照）。

加えて、ＤＮＡマイクロアレイは、このアッセイに高品質の支持を与えており、大規模解析のための貴重な技術を提供している。２チャネルＤＮＡマイクロアレイアッセイにおいて、被検細胞及び正常基準細胞から単離されたＤＮＡはそれぞれ、２つの異なる蛍光色素で標識された後、マイクロアレイスライド上の固定化されたＤＮＡプローブに同時にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション中、上記２種の蛍光標識ＤＮＡ（被検ＤＮＡ及び基準ＤＮＡ）は、固定化されたＤＮＡプローブ鎖へのハイブリダイゼーションにおいて競合し、繰り返し配列が何らかの手段で除去又は減少される。相補鎖間のハイブリダイゼーション反応は、標識アンチセンス鎖と固定化センス鎖の間でのみ生じる。

２種の蛍光標識ＤＮＡの強度比を用いて、試料中のゲノム領域の相対レベルを定量化する。この方法は、試料中のＣＮＶ（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ：コピー数多型）レベルの対比較に役立つ（文献２９参照）。千を超える異なるＤＮＡプローブがマイクロアレイ上に固定化されているので、試料中の全染色体の相対ＣＮＶレベルを１回のアッセイで得ることが可能である（文献３０、３１、３２参照）。

ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発見、疾患診断、がん、薬理ゲノミクス及び毒性学的研究に応用されてきた。全試料間の比較が望まれている一連の関連試料に、ＤＮＡマイクロアレイの使用が増えている（文献３３、３４参照）。

遺伝子発現において、処理試料と対照試料とを比較することはよくあることであり、ここで、最も自然な基準がしばしば最も豊富である野生型又は生物学的対照である。しかし、各々の試料を他の試料と比較することを目的とした研究の場合、天然の対照は存在しない。信頼のおける代替はプールされた基準ＤＮＡであり、これにより大きな誤差の数は減らされる。研究者の中には、さらに進んで、ほとんどの場合彼ら自身の実験用に、いくつかの標準的な細胞株に由来する「普遍的基準（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」を作製した者もいる。普遍的基準を用いることで、全ての実験の結果を比較することが可能となる（文献３５参照）。

重要度が等しく高い品質を有する多数の試料を比較するために、各試料は２種の異なる色素配向の２種の異なる試料の各々にハイブリダイズされる。この設計により、もう１チップのみのコストで、各試料が１度ではなく２度生じるために、推定あたりの分散が半分となる。欠点は、一方のチップが上手くいかなかった場合、又は品質が悪かった場合に、全ての推定値の誤差分散が２倍になってしまうことである。一方、３つ以上の条件が常にあるため、又は１つのアレイにおいて２つの試料を直接ハイブリダイズするのは人工的なＤＮＡ対合をもたらすことから推奨されないため、実際には、たった２つの条件を各アレイに適用するだけで設計が複雑化する可能性がある。

２色（競合的にハイブリダイズされた斑な）アレイの最も一般的な設計が「基準設計（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｓｉｇｎ）」である。最も簡単な方法では、各実験試料が共通基準試料に対してハイブリダイズされる。

増幅していないゲノムＤＮＡを基準として使用することはアレイＣＧＨではごく一般的なことであるが、対応するＰＧＳ／ＰＧＤでの適用は、２種のＤＮＡ調製物（増幅された試料及び増幅されていない基準）の間でのバランスの欠如により、高いノイズレベルを生じる結果となる。従って、プールされたＤＮＡ基準がこの競合に使用された場合、この不均衡は増大する。

これに関連してしばしば使用される基準物質は、少数の単一細胞としてのＤＮＡ量に大まかに相当する量に希釈された、プールされた正常ＤＮＡ試料である。次に、希釈された基準ＤＮＡの対応する割合が、ＤＮＡ試料の隣に、同時に増幅される。これらの分子生物学的アプローチの使用にもかかわらず、被検及び基準ＤＮＡの特性の一致は必ずしも効率的なものとはならず、しばしば、結果の明確さがあいまいにばらつくことがある。診断的適用における実験が上手く機能していることを示すための最も一般的なアプローチは、内部標準の使用であり、個々のアッセイでは既知のコピー数多型を有する基準試料である（文献３６参照）。

ほとんどの場合、基準試料は性染色体に対しては不一致であり、結果的に、ある程度のダイナミックレンジが保証され得る。このアプローチは多くの場合で手の届くものであるが、残念なことにＰＧＳでは、特にいずれの性別でもあり得る割球又は胚盤胞生検に照会される場合に試料の性別が不明であるために、適用することができない。

さらに、Ｓｖｅｔｌａｎａ Ａ．らは研究において、性別一致基準ＤＮＡを使用したマイクロアレイに基づくＣＧＨが、性別不一致基準ＤＮＡを用いたアレイＣＧＨと比べて、性染色体不均衡のより高い検出感度をもたらすことを示した。アレイＣＧＨ解析における性別不一致基準ＤＮＡの使用は、性染色体特異的プローブにおいて偽陽性結果、偽陰性結果、及び曖昧な結果を生み、潜在的な、病因となるゲノム不均衡を遮蔽する場合がある。従って、既知のコピー数変化を有するＤＮＡ基準の使用は、胚／卵母細胞における同一の変化は不安定であり、その結果かなりのばらつきがあるため、推奨されない（文献３７参照）。

あるいは、非ヒト対照配列(ＣＯＮＴＲＯＬ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)の使用が可能性としてあり、これは、理論的には理想的なアプローチであるが、実際には、正確であるようにヒト配列の挙動を模倣することができるゲノム配列の選択であり、さらに、非ヒト制御配列は同じ所与の増幅バイアスに悩まされる可能性がある。

残りの解決策は、１つは男性基準ＤＮＡに対して、２つ目は女性基準ＤＮＡに対して、２つの従来的なＣＧＨ実験を通じて被検試料を解析することであるが、適用コストの高さに悩まされるアプローチである。

Ｂｕｆｆａｒｔら（文献３８参照）は、この技術の改良として、被検及び試料ＤＮＡが異なるアレイから比較される、「アクロスアレイハイブリダイゼーション（ａｃｒｏｓｓ ａｒｒａｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」と称される改変アレイＣＧＨを提唱した。異なるチャネルアレイ上で解析された基準プールを用いてアレイＣＧＨが実行された。試料アレイ内の第二のチャネルが正常基準ＤＮＡのハイブリダイゼ―ションに使用されなくなるので、第二の試料を同一アレイにハイブリダイズするのにこのチャネルを用いることができる。この方法はコスト面で、及び色素バイアスを除去することからもしかするとデータ品質の面で利点を与えるが、１つのアレイにおいて２つの試料を直接ハイブリダイズすることは、前述のように人工的なＤＮＡ対合が生じることから、推奨されない。

これに関連して適用されるＣＧＨアレイでは、細胞内の利用可能な少量のＤＮＡ（５〜１０ｐｇ）をこの解析に適したレベルにまで増加させるために、ゲノム全体の増幅が必要となる。一般的に使用される増幅法としては、ＤＯＰ−ＰＣＲ（多様なランダムプライマー戦略）、又は、より最近では、Ｇｅｎｏｍｅｐｌｅｘ（ルビコン・ゲノミクス社（Ｒｕｂｉｃｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ））若しくはＰｈｙポリメラーゼキットを用いる分岐鎖ＰＣＲ（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ＰＣＲ）（Ｒｅｐｌｉ−Ｇ、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））などのプレキシソームテクノロジーライブラリーキット（ｐｌｅｘｙｓｏｍｅｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｋｉｔ）が挙げられる。

最良の結果を得るために、アレイＣＧＨにおいては、基準ＤＮＡ及び試料ＤＮＡの両ＤＮＡが質及び濃度に関して平衡化される必要がある。これに関連して、遺伝物質は解析される各細胞を代表するものであるので、遺伝物質があらゆる解析の主要なポイントとなっていることは注目に値する。最近では、極体、割球（卵割期胚）又は栄養外胚葉生検（インビトロでの胚発生段階の５日目〜６日目）からＤＮＡを単離することが可能である。

極体は、卵子のライフサイクルの２つの異なる時期に放出される、卵母細胞の対となる細胞である。極体は細胞分裂を補助することしか機能が知られていない。極体は単なる、卵子分割の「副生成物」である。着床が起こると、極体は分解し、胎児発生の一部とはならない（文献３９参照）。

胚生検は、胚が６〜８細胞期に達した際（胚培養の約７２時間目又は３日目）に、ＩＶＦ法で実行される手法である。１つ又は２つの細胞（すなわち割球）が胚の残りから分離され、発生中の胚を取り囲む被覆物である透明帯から取り出される。上記細胞が取り出されたのち、発生中の蒸気胚が培地中に戻され、恒温器に戻され、そこで、その通常の成長及び発生が再開され得る（文献４０参照）。

栄養膜生検は、遺伝子検査用に発生中の胚から細胞を得るための最も新しい手法である。発生の５日目までに、胚はおよそ１００細胞の、内部細胞塊及び栄養膜細胞に分裂する。栄養膜生検の利点は、胚の発生に重大な影響を与えることなく、いくつかの細胞を得ることができる点である。いくつかの細胞を得ることにより、より多くの遺伝情報が入手可能となる。これにより結果の正確さが上昇する（文献４１参照）。

しかし、ＰＧＳ適用には特有の技術的問題が課され、いくつかの実施形態では、染色体細胞含有量の評価は、受精後の細胞を取り出すことで、又は、極体をアッセイし、胚を生成している卵母細胞を評価することにより、遺伝的内容物を間接的に測定することで、行われ得る。他の実施形態では、本願は卵母細胞を調べる目的のみを有して存在し、胚は必ずしも作製されない。これは、試料が極低温保管庫（ｃｒｙｏ−ｂａｎｋ）に収集された場合の一般的な手順である。

利用可能なＣＧＨアレイ法では、染色体不均衡の検出が目的である場合、特に、試料の性別が事前に判っていない場合（例えば、ＰＧＳに供される胚の場合など）、非常にたくさんのハイブリダイゼーション試験が要求されるが、これは、起こり得る染色体不均衡に関する信頼できる情報を得るために、被検ＤＮＡが男性基準ＤＮＡ及び女性基準ＤＮＡの両方と別々にハイブリダイズされなければならないという事実によるものであり、この検定の重複は解析されるＤＮＡ試料の数によってさらに倍加される。従って、理想的には各被検ＤＮＡあたり単一アレイで作用する、必要なハイブリダイゼーション試験の数を減らすことが可能な新しいＣＧＨアレイ法が、強く求められている。

コピー数多型の特定は、全ゲノム全体に亘ってあらゆるサイズの異常の検出に広範に使用されてきたが、同じプラットフォーム上で測定された場合であっても、反復試料からの様々な不一致コール（ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｉｅｓ ｃａｌｌ）が現在までに報告されている（文献４２参照）。さらに、アルゴリズムが異なると、同じ試料に対して異なるコール（ｃａｌｌ）を得ることができる。従って、アレイ特異的なバイアスを取り除き、ゲノム上の重複及び欠失の領域を自動的に選択し、偽陽性（ＦＰ）及び／又は偽陰性（ＦＮ）に関してのアッセイ失敗のリスクを減少させることが可能な一連の実行アルゴリズムを提供する、ＣＧＨアレイデータの新しい解析経路が、さらに求められている（文献４３、４４参照）。

さらに、ＣＧＨ試験における変動性は、被検ＤＮＡとの競合的ハイブリダイゼーションに使用される基準ＤＮＡの質のばらつきによって生じる。従って、使用中の基準ＤＮＡの内部品質管理を含む新しいＣＨＧ法がさらに求められている。

本発明者らは、被検ＤＮＡ試料における、（着床前の遺伝子スクリーニングを受けている胚を典型例とする）特に性別が不明な被検ＤＮＡ試料（すなわち、被検ＤＮＡのドナーの性別が不明である場合）における染色体不均衡を判定するための新規な方法を考案した。なお、上記方法を用いて、性染色体（ゴノソム（ｇｏｎｏｓｏｍｅ））及び非性染色体（常染色体）の両方の染色体型における不均衡を判定することができるが、ゴノソムにおけるＤＮＡ不均衡の判定に使用される場合に特に有利である。ＣＧＨアレイ技術に基づく本方法の主な特徴は、現在まで必要とされてきた、両方の性別の基準ＤＮＡ（すなわち、男性ドナー由来の基準ＤＮＡ＋女性ドナー由来の基準ＤＮＡ）をと被検ＤＮＡとの二重ハイブリダイゼーションを行う必要性がないことにある。すなわち、本方法は、被検ＤＮＡがただ１つの基準ＤＮＡ（男性ドナー由来のＤＮＡであっても女性ドナー由来のＤＮＡであってもどちらでもよい）に対して競合的にハイブリダイズされる単一のハイブリダイゼーションアレイ（本明細書では「検査」ハイブリダイゼーションアレイと称する）を用いて実施され；この検査ハイブリダイゼーションアレイから得られた結果は次に、２つの相対する性別のドナーから得られた基準ＤＮＡが競合的にハイブリダイズされた「基準」ハイブリダイゼーションアレイから得られた結果と組み合わされる。「検査」及び「基準」ハイブリダイゼーションアレイから得られた結果を組合せることにより、被検ＤＮＡ中の最終的な染色体不均衡数（コピー数多型、本明細書では「ＣＮＶ」）が得られる。なお、ｎ個の被検ＤＮＡ試料が上記方法に供される場合、基準ハイブリダイゼーションがｎ回繰り返されることはなく、代わりに、対応する結果を与えるために１回だけ実行されればよく、さらに、適切に保存されたそのような結果は、ｎ個の被検ＤＮＡ試料によって与えられた各々の結果と組み合わせることができる。従って、解析すべき１つの被検ＤＮＡに対し、ただ１つのハイブリダイゼーションアレイが使用される。

すなわち、本発明の目的は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）技術を介して、被検ＤＮＡを男性（又は女性）ドナー由来の基準ゲノムＤＮＡ（本明細書では「基準ＤＮＡ」）と比較することにより、被検試料（本明細書では「被検ＤＮＡ」）由来の性染色体及び常染色体のゲノムＤＮＡ全体に亘るコピー数多型（本明細書では「ＣＮＶ」）の存在及び数を評価する単一アレイＣＧＨ法である。上記方法は、以下の工程を含む：

（ａ） 上記被検ＤＮＡを第一マーカーで標識して、標識された被検ＤＮＡを得る工程；
（ｂ） 男性（又は女性）基準ＤＮＡを、上記第一マーカーとは異なる第二マーカーで標識して、標識された男性（又は女性）基準ＤＮＡを得る工程；
（ｃ） 工程（ａ）及び工程（ｂ）で得られたＤＮＡを検査ハイブリダイゼーションアレイにハイブリダイズして、対応するハイブリダイズされたＤＮＡ分子に由来する、両マーカーからのシグナル強度の混合パターンを得る工程；
（ｄ） 工程（ｃ）の混合パターンから、上記第一マーカーから生じた単一シグナル強度及び上記第二マーカーから生じた単一シグナル強度を決定する工程；
（ｅ） 工程（ｄ）で得られた２つのシグナル強度を互いに比較することで、上記被検ＤＮＡにおけるコピー数多型（ＣＮＶ）の第一評価を行う工程；
（ｆ） （工程（ｂ）で使用されたものとは性別が逆の）基準ＤＮＡを、上記第一マーカーで標識して、上記第一マーカーで標識された基準ＤＮＡを得る工程；
（ｇ） 工程（ｂ）で使用されたものと性別が逆の基準ＤＮＡを、上記第二マーカーで標識して、上記第二マーカーで標識された基準ＤＮＡを得る工程；
（ｈ） 工程（ｆ）及び工程（ｇ）で得られた両ＤＮＡを基準ハイブリダイゼーションアレイにハイブリダイズして、対応するハイブリダイズされたＤＮＡ分子に由来する、両マーカーからのシグナル強度の混合パターンを得る工程；
（ｉ） 工程（ｈ）の混合パターンから、上記第一マーカーから生じた単一シグナル強度及び上記第二マーカーから生じた単一シグナル強度を決定する工程；
（ｊ） 以下を互いに比較することで、上記被検ＤＮＡにおけるＣＮＶの第二評価を行う工程：
・工程（ｄ）で決定された上記第一マーカーで標識された被検ＤＮＡのシグナル強度と、
・工程（ｉ）で決定された上記第二マーカーで標識された基準ＤＮＡのシグナル強度；
（ｋ） 工程（ｅ）及び工程（ｊ）で得られたＣＮＶ値を組み合わせて、性染色体と常染色体のゲノムＤＮＡに関する最終的なＣＮＶ判定を得て、それにより、解析に供されたゲノムＤＮＡ全体に関する最終的なＣＮＶ値を得る工程。

本方法は、ｎ個のＤＮＡ試料のＣＧＨ試験のための支持体において必要なアレイの数と、その結果として、このような解析に必要な時間を、半分に削減することを可能にする。すなわち、本発明は、本方法の工程（ａ）〜（ｅ）におけるｎ個のＤＮＡ試料の検査のためにｎ個の検査ハイブリダイゼーションアレイを提供し、工程（ｈ）の実行のために１つの基準ハイブリダイゼーションアレイを提供し、それにより、従来技術が必要としてきたアレイの重複を回避する、新規なよりコンパクトなＣＧＨ解析のための支持体も包含する。本発明はまた、このような方法を実行するためのキットも包含する。本発明はさらに、適切なデータ処理を介して、標識されたＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションによって生じるシグナル強度におけるバイアスを低減する可能性も包含する。本発明はさらに、ハイブリダイゼーションに使用される基準ＤＮＡの内部品質管理も包含する。

図１は、本発明に係るＣＮＶ判定のための新規なＣＧＨマイクロアレイ法を説明するフローチャートである。 図２は、本発明に係る、第一のＤＮＡ振幅プロファイルに基づくＣＮＶ判定のための方法を説明するフローチャートである。 図３は、本発明に係る、第二のＤＮＡ振幅プロファイルに基づくＣＮＶ判定のための方法を説明するフローチャートである。 図４は、本発明に係る、第一及び第二のＤＮＡ振幅プロファイルに基づく最終ＣＮＶ判定のための方法を説明するフローチャートである。 図５は、本発明において詳述される、各検査につき１つの領域を使用している第一及び第二のＤＮＡ振幅プロファイルに基づくＣＮＶ判定のための方法を説明する概略図である。 図６は、画像品質管理のための方法を説明するフローチャートである。 図７は、第一のＣＮＶ評価のための画像ノイズ減算及び一連のアルゴリズムの適用のための方法を説明するフローチャートである。 図８は、第二及び最終ＣＮＶ判定の評価のための方法を説明するフローチャートである。 図８Ａは、被検試料と男性又は女性基準試料との間で、染色体の重複(ＧＡＩＮ)／欠失（ＬＯＳＳ）に関する一連のＣＮＶ解析から得られた結果を比較している表である。女性基準試料は、マイクロアレイで直接測定された品質管理試料及び基準試料の両方から得られた。常染色体及び性染色体の重複及び欠失により、ＰＧＳ核型が推定され、対照核型と比較された。女性基準試料（基準試料（ａ）〜（ｅ））の一致が品質管理と比較され、各々の一致率も報告された。 図８Ｂは、性染色体について、正常な男性又は女性の基準試料と比較した様々な正常型及び異常型の可能な遺伝子型のＣＮＶ読み取り（ｒｅａｄｉｎｇ）である。 図９は、様々なマイクロチップ上で測定された女性基準試料の標準偏差の比較である。これらの値の中央値及び標準偏差の評価も報告されている。 図１０は、被検試料解析の標準偏差の比較である。これらの値の中央値及び標準偏差の評価も報告されている。 図１１は、対照試料と比較した被検ＤＮＡ試料の染色体マッピングである。 図１２は、ＩＢＳＡ品質管理試料と比較した、被検ＤＮＡ試料を測定した場合の女性基準試料の傾向である。 図１３は、本発明に係る一領域ＣＮＶ検出の一例である。

本明細書及び特許請求の範囲において、特に明記しない限り、使用される専門用語は当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有するものとする。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて：

「ＣＧＨ」は、競合的（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ゲノムハイブリダイゼーションを意味する。

「被検ＤＮＡ」は、特にコピー数多型の数を決定する必要がある、解析されるＤＮＡを意味する。

「コピー数多型」又は「ＣＮＶ」とは、ＤＮＡの一つ又は複数のセクションの異常なコピー数を有する細胞をもたらす構造的多型、すなわちゲノムＤＮＡの変化、の一形態を意味する。

「重複／欠失」は、正の値（重複）又は負の値（欠失）を占める。「基準ＤＮＡ」は、本方法で使用されるマイクロアレイ上に被検ＤＮＡと競合的にハイブリダイズされるＤＮＡを意味する。「標準ＤＮＡ」は、被検ＤＮＡと基準ＤＮＡの両方が競合的にハイブリダイズする、アレイ上に固定化されたＤＮＡを意味する。

「検査ハイブリダイゼーションアレイ」は、本方法の工程（ｃ）において被検ＤＮＡ試料がハイブリダイズされるアレイを意味する。「基準ハイブリダイゼーションアレイ」は、本方法の工程（ｈ）で基準ＤＮＡがハイブリダイズされるアレイを意味する。「アレイ」（又は「マイクロアレイ」、本明細書において同義的に使用される名称）は、生化学的解析又は遺伝子解析で使用される、通常は一本鎖ＤＮＡ又はタンパク質の既知配列の多数の分子又は断片が規則正しいパターンで付着している、（ガラススライド又はプラスチックスライドとしての）被覆表面支持材料（ｃｏａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）を意味する。本方法において、使用されるアレイは、被検ＤＮＡ又は基準ＤＮＡのいずれのハイブリダイズを目的としているかにかかわらず、同じ構造及び構成を有する。

本方法で使用される被検ＤＮＡは、ＣＮＶの決定が必要であるあらゆる生物、特に男性又は女性ドナー、に由来するＤＮＡである。本発明の方法を実施する場合、被検ＤＮＡのドナーの性別は既知であっても未知であってもよい。被検ＤＮＡは、増加又は減少した数のゲノム断片を保有し得る。被検ＤＮＡが由来する生物は、例えば、卵母細胞由来の一つ又は複数の第一極体及び第二極体（ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ １ ａｎｄ ２）、胚由来の割球、精子、末梢血リンパ球、胎児血液、絨毛膜絨毛、羊水細胞、皮膚、骨髄、胎児組織、肺、肝臓、固形腫瘍、又は腹水のうちの一つ又は複数に由来する細胞などとすることができる。

上記方法は「被検ＤＮＡ」に関連して本明細書で記載されている。しかし、本発明の方法の目的は、単一のＤＮＡを１つずつ試験することに限定されず、適切なＣＧＨ支持体が提供される限り、ｎ個の被検ＤＮＡ（同じ又は異なるドナー由来）に対して同時に実行することができ、このようなＣＧＨ支持体は、本方法に従ってｎ個の被検ＤＮＡの各々が解析されるｎ個の検査ハイブリダイゼーションアレイを含むべきである。この実施形態は、本発明の方法の不可欠の部分である。また、ＤＮＡ試料の試験に好適であるよう発明されたものの、本方法は、デュアルチャネルマイクロアレイが適用され得る全ての場合について機能し得る。

上記方法で使用される「基準ＤＮＡ」は、１人のドナーに由来するＤＮＡであってよいか、又は複数人の男性ドナー若しくは複数人の女性ドナーに由来するＤＮＡであってもよい。複数人のドナーの場合、各々の遺伝子型も異なる濃度で存在してもよい。これらのバリエーションを含む基準ＤＮＡを使用することには、遺伝子型の偏り（バイアス）を低減するという利点がある。上記方法で使用される基準ＤＮＡは、即席で用意してもよいし、市販品を使用してもよい。従って、本願の全体を通じて、「男性基準ＤＮＡ」という用語は、１又は複数の男性ドナーから得られた基準ＤＮＡを意味し；「女性基準ＤＮＡ」という用語は、１又は複数の女性ドナーから得られた基準ＤＮＡを意味する。「〜とは性別が逆の基準ＤＮＡ」という表現（ここで、「〜とは逆の」は更なる基準ＤＮＡに対立して使用されている）は、性別が更なる基準ＤＮＡのドナーの性別と逆であるドナーから得られた基準ＤＮＡを意味する。

実際の診断においては、解析される被検ＤＮＡは、単一のＤＮＡ分子（例えば、単一細胞から得られたもの）であることが多い。このような単一ＤＮＡ分子は、ＣＧＨ解析用に十分な強さのシグナルを生じることができない場合がある。このような場合には、当該技術分野において周知の従来技術を介して、被検ＤＮＡ分子を適切に「増幅」することが可能である。増幅技術の非限定的な例としては、ＤＯＰ−ＰＣＲ（多様なランダムプライマー戦略）、Ｇｅｎｏｍｅｐｌｅｘ（ルビコン・ゲノミクス社）等のプレキシソームテクノロジーライブラリーキット（ｐｌｅｘｙｓｏｍｅｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｋｉｔ）、Ｐｈｙポリメラーゼキットを用いる分岐鎖ＰＣＲ（Ｒｅｐｌｉ−Ｇ、キアゲン社）などが挙げられる。増幅技術の更なる例は、本明細書の実施例セクションで示される。増幅度の目標は、基準ＤＮＡのシグナルレベルと等しいか又は少なくとも同等のシグナルレベルを得ることが可能な増幅度とするべきである。

基準ＤＮＡを増幅する必要はそれほど多くはなく、実際には、これらは通常、ＣＧＨ処理のために十分に高い増幅度を有する多分子試料である。しかし、本発明は、必要とされる場合は常に（被検ＤＮＡと同程度のシグナルを得ることを常に見込んで）基準ＤＮＡを増幅する可能性を排除しない。ＤＮＡ（被検及び／又は基準ＤＮＡ）の増幅は、一工程で実行されてもよいし、別々の増加工程（例えば、第二の増幅工程によって、標識するのに適切な量のＤＮＡがかなり十分に生成される、２つの連続した増幅工程）を介して実行されてもよい。

本方法の種々の工程（ａ）〜（ｋ）の詳細について以下に記載する。

工程（ａ）
被検ＤＮＡの標識に使用されるマーカーは、典型的には、蛍光マーカーである。当該技術分野において周知の適切なマーカーの非限定例としては、ｃｙ３又はｃｙ５修飾ジデオキシヌクレオチド（Ｃｙ３− ｃｙ５−ｄＣＴＰ；ＧＥヘルスケア社又はパーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｈｅｌｍｅｒ））が挙げられる。例えば、有色の非蛍光性マーカー、放射性マーカー等のマーカーも代替として可能である。標識は、公知の手順（例えば、大腸菌（ｅ．Ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いるランダムプライム標識法（Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）、又は当該分野で公知の等価な方法）によって得ることができる。

工程（ｂ）
この工程で使用される基準ＤＮＡは、男性由来のＤＮＡ又は女性由来のＤＮＡのどちらでもよく、本方法の最終結果に影響しない。しかし、この工程で使用される基準ＤＮＡの種類は、後の工程（ｆ）及び工程（ｇ）で使用される基準ＤＮＡの種類を決定する。工程（ｂ）で男性基準ＤＮＡを使用した場合には、工程（ｆ）及び工程（ｇ）では女性基準ＤＮＡ（すなわち性別が逆の基準ＤＮＡ）を使用する必要があり；逆に、工程（ｂ）で女性基準ＤＮＡを使用した場合には、工程（ｆ）及び工程（ｇ）では男性基準ＤＮＡを使用する必要がある。この工程で使用されるマーカーは、工程（ａ）で記載されたものの中から選ぶことができるが、ただし、ＣＧＨではこれらの２つのマーカーが互いに異なることが必要である。典型的には、色／蛍光波長が異なる、異なるフルオロフォアを有するマーカーが使用される。同じ検出装置によって対応する標識ＤＮＡの識別を可能とするために、これらの２つのマーカーは同じマーカーファミリー（例えば「蛍光」又は「放射性」）に属していることが好ましい。これら２つのマーカーは等しい比率で使用されることが好適である。

工程（ｂ）は本明細書において広い意図を含み、標識済みの市販の基準ＤＮＡを使用する可能性も含む。この場合、基準ＤＮＡを物理的に標識する行為は、商業的供給源から標識済みマーカーを入手する行為に置き換えられる。この実施形態は本方法の工程（ｂ）に包含されることが意図されている。

工程（ｃ）
この工程は、本方法の全体を通じて被検ＤＮＡが受ける唯一のハイブリダイゼーション反応である。そのため、本方法は「単一アレイ」の方法として特徴付けられる。この工程では、工程（ａ）及び工程（ｂ）で得られた標識ＤＮＡ（被検ＤＮＡ及び基準ＤＮＡ）が、同一の検査ハイブリダイゼーションアレイ上で競合的にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは当該技術分野において公知の方法によって実行され、典型的には、標識ＤＮＡが適切なハイブリダイゼーション液に溶解され；一本鎖を上記アレイのＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションに利用可能とするために、上記ＤＮＡを変性し；次に、得られた溶液を上記アレイ上に分注すること、により、ハイブリダイゼーション反応を開始する。ＣＧＨにおいて通常である通りに、被検ＤＮＡ及び基準ＤＮＡがは上記アレイ上に存在する種々のＤＮＡクローン（ＢＡＣ／プローブ）のそれぞれに対するハイブリダイゼーションにおいて競合し、あらゆる可能な、単一ＢＡＣにおける被検／基準ＤＮＡによる不均衡なハイブリダイゼーションが、被検ＤＮＡの対応する部分における異常の可能性を発信する。適切なインキュベーション時間の後、上記アレイを洗浄して、未結合のＤＮＡを除去し、乾燥する。

工程（ｄ）
この工程では、上記アレイの各ポイントにおいて、上記アレイに結合した標識ＤＮＡのシグナル強度を評価することにより、被検ＤＮＡ及び基準ＤＮＡのハイブリダイゼーションレベルが測定される。好適なソフトウェア補助読取装置（例えば、レーザースキャナ）によって、上記アレイの各ポイントにおいて、測定されたシグナル強度に対する上記２つのマーカーの寄与を識別及び定量化する。得られたシグナル強度は、本方法で後に使用するために、記録及び保存される。

工程（ｅ）
上記アレイの特定のポイントについて、ハイブリダイゼーションレベルの不均衡を検出することにより、被検ＤＮＡ内のＣＮＶが決定される。ＣＧＨにおいて通常である通り、不均衡は、アレイの特定のポイントにおける蛍光シグナルの欠失／重複（ｌｏｓｓ／ｇａｉｎ）として検出することができる。具体的には、２つのシグナル強度（被検ＤＮＡ及び基準ＤＮＡ）間のｌｏｇ２比が正の値（重複）又は負の値（欠失）を占める場合、ＣＮＶを特定することができる。ＣＮＶの算出は、当該技術分野において周知の技術により、上記シグナルのソフトウェア処理によって実行され、これには、例えば、シグナル強度の定量化、データ正規化、統計解析、バイアス低減、染色体関連性強度の算出、染色体関連性ＤＮＡセグメントの生成等が含まれる。この目的に適したソフトウェアの一例としては、特許出願ＷＯ２０１３／１７１５６５Ａ２に記載されているソフトウェアが挙げられる。この算出のためのソフトウェア及びアルゴリズムの更なる詳細は、本明細書の実施例セクションに示されている。この工程において読み取られる染色体ＣＮＶ値は、非性染色体（常染色体）については最終値であるが、性染色体（ゴノソム）については暫定的なものである。これは、解析された被検ＤＮＡが性別不明（すなわち、被検ＤＮＡのドナーの性別が不明）である場合、単独の（男性又は女性）基準ＤＮＡとのそのハイブリダイゼーションが、正常な性染色体に存在するＣＮＶと、最終的に異常な性染色体に存在するＣＮＶとを最終的に区別するのに十分でないだろうという理由からである。

工程（ｆ）
この工程で使用される基準ＤＮＡは、工程（ｂ）で使用された基準ＤＮＡとは性別が逆である。すなわち、工程（ｂ）において男性／女性基準ＤＮＡが使用されていた場合、女性／男性基準ＤＮＡとなる。このＤＮＡの第一の一定分量を、第一マーカーで標識する。このマーカーは、工程（ａ）及び工程（ｂ）で既に使用された２つのうちの１つであることが好ましい。

工程（ｇ）
この工程では、工程（ｆ）において標識に使用された基準ＤＮＡの第二の一定分量を、第一マーカーとは異なる第二マーカーで標識する。この工程で使用されるマーカーは、工程（ａ）又は工程（ｂ）で使用されたマーカーのうち、工程（ｆ）では選ばれていないものであることが好ましい。

工程（ｈ）
工程（ｃ）で記載したように、通常のＣＧＨ条件下でハイブリダイゼーションを実行する。

工程（ｉ）
アレイの各ＢＡＣに対する２つの基準ＤＮＡのハイブリダイゼーションレベルを、工程（ｄ）で記載された方法によって測定することができる。本方法において後に使用するために、関連するシグナル強度を記録及び保存する。これらの強度がすでに入手済みであり、適切なデータ保存手段上で（例えば、上記方法を既に実行したことから、又はデータベースを集めることから）利用可能であり保存されている場合、「ヒストリカル（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）基準ＤＮＡハイブリダイゼーションデータ」として、この供給源から直接使用することができ、工程（ｆ）〜工程（ｉ）のサブシーケンスの反復実行を回避することができる。

工程（ｊ）
標準的なＣＧＨとは異なり、工程（ｉ）においては、ハイブリダイゼーションの次に、同一のハイブリダイゼーションアレイ上での直接的なＣＮＶの判定は行われない。これは、工程（ｉ）では、同じ基準ＤＮＡがそれ自体と競合し、この段階では有意なＣＮＶが期待されるはずがないので理にかなっている。本工程（ｊ）では代わりに、工程（ｉ）で得られたシグナル強度を工程（ｄ）で得られたシグナル強度と比較し、そこから、被検ＤＮＡ中のＣＮＶの第二の推定値を得る。工程（ｊ）で比較されるシグナル強度は、両タイプの染色体に由来するシグナル強度（特に、性染色体由来のシグナル強度）であり；従って、比較されるシグナル強度に存在するあらゆるＸ−重複及びＹ−欠失（又はその逆）が、特に重要となる。工程（ｊ）では、被検ＤＮＡのハイブリダイゼーションシグナルが男性及び女性基準ＤＮＡの両方のハイブリダイゼーションシグナルと比較されるため、この段階でのＣＮＶ読み取りによって、一方の性別の基準ＤＮＡを介して工程（ｅ）で得られた暫定的なＣＮＶ情報が有益に補完される。

工程（ｋ）
ソフトウェア補助を受けるこの工程では、工程（ｅ）及び工程（ｊ）で得られたＣＮＶを組み合わせることで、解析を受けた被検ＤＮＡ全体の完全且つ最終的なＣＮＶプロファイルが得られる。

上記から明らかなように、工程（ａ）〜（ｅ）のサブシーケンス及び工程（ｆ）〜（ｉ）のサブシーケンスは、２つの別々の独立したハイブリダイゼーションアッセイに関している。上記に示したこれら２つのサブシーケンスの実行の順番は、単なる例示であり、本方法を限定するものではなく：本方法は、これらの順番を逆転させて、すなわち、工程（ｆ）〜（ｉ）をまず実行し、次に工程（ａ）〜（ｅ）を実行し、最後に工程（ｊ）及び工程（ｋ）を行って上記方法を終えることによって、順不同に実行されてもよく；この実施形態は本発明の方法の重要な部分であると意図される。

本発明の方法は、ＣＮＶ推定の精度を更に上昇させることが可能ないくつかの好ましい実施形態を更に含む。

第一の好ましい実施形態によれば、基準ＤＮＡのハイブリダイゼーション手順（上記方法の工程（ｆ）−（ｇ）−（ｈ）−（ｉ））が、対応する数の同じ基準ＤＮＡ試料を用いてより多くの回数繰り返され；そのような反復的ハイブリダイゼーションが様々な製造バッチからのマイクロアレイ上で実行され；次に、生じ得るバイアス及び非特異的シグナルを除去／減少するために、各ハイブリダイゼーションから得られたシグナル強度がソフトウェア処理される。このような処理の例示的説明が、本明細書の実施例セクションで詳述される。このように処理されたシグナル強度はその後、「工程（ｉ）の結果」と見なされ、上記の本発明の方法によって更に処理される。

第二の好ましい実施形態によれば、第一の実施形態から得られたシグナル強度が、本方法で使用される任意の更なる基準ＤＮＡのための「品質管理された標準」として保存及び使用される。この実施形態によれば、使用中の基準ＤＮＡの品質レベルを決定／管理する目的で、使用中の基準ＤＮＡから工程（ｉ）で得られたシグナル強度を、対応する「品質管理された標準」のシグナル強度と比較する。シグナル強度がより「品質管理された標準」のシグナル強度に近いほど、品質が高いということになる。

両方の性別の基準ＤＮＡを用いた被検ＤＮＡのハイブリダイゼーションの重複を避けることで、本方法は、典型的には体外受精（ＩＶＦ）プロトコルの着床前診断等における場合のように、性別が事前に不明な（すなわち、被検ＤＮＡ試料のドナーの性別が不明である場合の）被検ＤＮＡ試料のＣＮＶ判定に重要な単純化を可能とする。この単純化は解析時間の大幅削減に繋がり（特に複数の被検ＤＮＡを解析する必要がある時に明らか）、更に、必要とされるＣＧＨアレイの数の減少にも繋がる。ＣＮＶの判定は、正しい染色体状態について最適な卵母細胞、精子又は正しい胚の選択等を可能にする。

本方法の基礎をなすアレイの減少により、新規なよりコンパクトなＣＨＧ支持体が提供される。この支持体は、好適な支持体上に、一つ又は複数の被検ＤＮＡについて工程（ａ）〜（ｅ）を実行するための一つ又は複数のハイブリダイゼーションアレイ、及び工程（ｈ）を実行するための単一アレイを含むことを特徴とする。上記単一アレイは、支持体自体にプリントされた適切な表示によって、又は、上記単一アレイを支持体の特定の領域に設置して、被検ＤＮＡをハイブリダイズするために必要なアレイを含有する領域と区別可能にすることによって、支持体上で特定することが可能である。これらの新規なよりコンパクトな支持体は、それ自体が本発明の更なる実施形態を形成する。

本発明の更なる対象は、上記方法を実行するためのキットであって、（ａ）一つ又は複数の被検ＤＮＡについて工程（ａ）〜（ｅ）を実行するための一つ又は複数のハイブリダイゼーションアレイ；（ｂ）適切なデータストレージサポート上に記録された工程（ｉ）の基準シグナル強度、又は、その代わりとして、工程（ｈ）を実行するための基準アレイ、並びに、それを実行するために必要な（任意に上記基準ＤＮＡの品質管理に関連していてもよい）標識された男性及び女性基準ＤＮＡ、を含むキットである。

以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。

以下の手順は、異なる標識で標識された複数のヒトプローブＤＮＡ試料を、被覆ガラス製スライド上にプリントされたヒトＢＡＣアレイにハイブリダイズする工程を説明するものである。手順全体が、我々の研究室及び臨床センターにおいて信頼のおけるものであると証明された。

バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）アレイは、数千のスポットからなり、そのそれぞれが、比較的大きな染色体領域（約１５０〜２００ｋｂのサイズ）をカバーするＤＮＡ断片を含み、単一ＢＡＣクローンを代表する。各ＢＡＣ ＤＮＡクローンは異なる染色体領域に特異的であり、クローンの完全な一式がそれぞれの染色体位置にマッピングされている。実験者バイアスを避けるために、各クローンは、マイクロチップスライドの各アレイにおいて、少なくとも２つのレプリカで提示される。

このために、ＢＡＣアレイは、それぞれが個々のプローブで表され、細胞染色体スクリーニングの主要な目的（重複及び／又は欠失した染色体全体の検出）に十分良好であることが分かっている、専用の数のＢＡＣクローンを有する特定のヒトゲノム設計を含む。

染色体の欠失又は重複は、２つの異なるＤＮＡのハイブリダイゼーション後に、各スポットにより採用されたマーカーによって（上記２つの対照的なマーカーの蛍光強度の比等によって）明らかにされる。

マイクロアレイＣＧＨは、単一アレイを用いた全ゲノム増幅（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＷＧＡ）後の単一細胞における異数体の検出に上手く応用されている。例えば、アプローチ全体によって、卵母細胞又は卵割期胚スクリーニングに要する時間枠の中での網羅的な染色体解析が可能になり、更に、細胞株遺伝子解析も上手く達成された。

上記マイクロアレイは、増幅ＤＮＡと共に使用されるよう設計されているが、ゲノムＤＮＡの量が乏しい試料には全ゲノム増幅（ＷＧＡ）が必要であり、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子解析のための充分な材料を得るのには増幅（ＷＧＡ）技術が必要とされる。

＜研究デザイン＞
本研究の目的は、ＩＶＦ法から又は培養細胞株から採取された正倍数体又は異数体試料の少なくとも２種の多様なマトリックスを用いる、本明細書に記載されたＣＮＶ検出法を検証及び確認することであった。第一のマトリックスについては、臨床ＩＶＦセンターの通常業務から一連の試料を集めて遡及研究を行った。これらの試料の正倍数性又は異数性状態は、別の手法を用いて第一極体若しくは第二極体（ｐｏｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ １ ｏｒ ２）又は割球に対して行われた染色体評価により、既に予測済みであった。第二のマトリックスについては、一つ又は複数の既知の染色体異常を保有するヒトリンパ芽球様細胞株を、本研究の目的のために、公共リポジトリから選んだ。

最優先の細胞の異数性状態を評価するために、まず、被検ＤＮＡを男性基準ＤＮＡと比較した。このために、特定の一連の呼び出し（ｃａｌｌｉｎｇ）アルゴリズム（アルゴリズム１〜６）を適用し、第一の染色体ＣＮＶを算出した。ＤＮＡ検査のデジタルファイル内のスポット強度を、本研究に用いた５つのマイクロアレイで測定された基準女性ＤＮＡ及び品質管理からの同じ基準女性ＤＮＡの両方の画像データとの後の比較のために保存した。

第二の染色体ＣＮＶ測定値を、同じ呼び出しアルゴリズムを用いて得た。次に、被検ＤＮＡの全コピー数評価を算出及び入手するために、これら２つの染色体ＣＮＶ測定値を、特定のアルゴリズム（アルゴリズム７）を用いて比較した。

２つの対照的なフルオロフォアで標識した上記５つの基準女性ＤＮＡ（基準試料１〜基準試料５）のそれぞれを、５つの異なるマイクロアレイ上にハイブリダイズした。それぞれのデジタルファイルを保存し、保存されたＤＮＡ検査画像データセットと比較した。

基準女性ＤＮＡ品質管理は、それぞれのマイクロアレイバッチ生産（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）に対し行われるＣＧＨ解析から得られる記憶画像データであり、女性又は男性基準ＤＮＡの最高品質の測定法を代表するものある。

検査結果の評価では、２つのパラメーター（細胞の倍数性状態及び染色体の一致）を用いた。細胞の倍数性状態は正倍数性又は異数性の細胞状態を定める一方、染色体の一致は、既知の染色体ＣＮＶの被検物と対照との間の、調べられた染色体の一致を定める。

基準ＤＮＡを用いる場合、クローンポジションの過半数が正倍数体であり、ｌｏｇ２比の大部分がゼロ付近で変動するものと仮定される。ＤＮＡは、マイクロアレイ研究に適用された場合、測定されたｌｏｇ２比に系統的なアレイ特有のバイアスをもたらす場合があり、このため、アレイＣＧＨ試験における通常のＣＮＶ測定はデータの誤解釈を招くことがある。

本研究においてこの事象を低減するために、基準ＤＮＡアレイの補正のための「包括的正規化（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」、並びに、３つのデータ画像品質管理工程（スポット形態及びシグナル強度の品質管理パラメーター、クローンレプリカ品質管理、クローン品質管理）を採用する。

簡潔に説明すると、品質管理では、基準ＤＮＡが、性別一致及び性別不一致条件で各バッチアレイに供され、以下の特定のパラメーターについて評価される：包含クローンの割合（％ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｅｓ）、実験における標準偏差、信号対雑音比、並びにＸ染色体及びＹ染色体のＣＮＶの可能性。基準ＤＮＡが検査アッセイに供される場合、次の測定の前にその実験的妥当性を評価するために、まず、対応する品質管理基準と比較される。

本研究では、基準ＤＮＡの各々が別々に測定され、基準品質管理と比較され、実験的標準偏差（ＳＤ）が評価パラメーターとして考慮される。

＜被検及び基準ＤＮＡの調製＞
アレイ用に、ＰｉｃｏＰｌｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＷＧＡ Ｋｉｔ（ルビコン・ゲノミクス社）を用いてＤＮＡ−ＷＧＡを得たが、これは、院内の確認研究は全てこのキットを用いて行っていたためである。しかし、ＤＮＡ増幅については、増幅産物の性質は未増幅産物ほど重大な意味を持たないため、任意の他の好適な増幅系を用いることができる。被検ＤＮＡ及び基準ＤＮＡ（男性又は女性）をＷＧＡ増幅し、得られたものを断片化した。増幅産物の品質を評価し、全増幅反応の十分の一（ｏｎｅ out ｏｆ ｔｅｎｔｈ）を標識し、ＣＧＨアレイに好適となるようにした。

＜増幅試料及び基準ＤＮＡの標識＞
大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用するランダムプライムド標識法を用いて、被検及び基準ＤＮＡの両方を２つの異なるマーカーで独立して標識し、更に、得られたものを断片化した。この２つのＤＮＡは、例えばｃｙ３又はｃｙ５修飾ジデオキシヌクレオチドを用いて標識可能であり、ＣＧＨ試験を行うために均等な割合で混合される。これにより、チップスキャニング中のＤＮＡ試料及び対照にそれぞれ関連した２つ又は１つの重ね合わせ像の取得、並びに、スライド上に配置された各スポットにおいての２つのＤＮＡの競合的ハイブリダイゼーションから生じるシグナル強度の測定が可能となる。

＜標識された被検及び基準ＤＮＡの沈殿＞
ＣＮＶ算出に干渉し得る高度繰り返し配列のクロスハイブリダイゼーションから生じるあらゆるバイアスを回避するために、上記標識ＤＮＡをブロッキング溶液を用いて共沈殿させる。次に、特異的ハイブリダイゼーション運搬緩衝液（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）が標識プローブを利用できるようにするために、標識ＤＮＡを乾燥させる。

＜標識された被検及び基準ＤＮＡのハイブリダイゼーション＞
乾燥させたペレットを、キットで利用可能な適量のハイブリダイゼーション液中に溶解させる。ＤＮＡを、ハイブリダイゼーションプロセスで使えるように一本鎖にするために変性させ、マイクロアレイに分注し、整列したプローブと接触させてハイブリダイズする。この系は、水浴を用いて専用カセット内で行われる温度制御フローティングハイブリダイゼーション（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）である。ハイブリダイゼーションの後、シグナル振幅測定に干渉し得るあらゆる未結合の標識ＤＮＡ又は非特異的若しくはより高次のあらゆる核酸複合体を除去するために、ガラス製スライドを特に厳重に洗浄する。

＜シグナル強度抽出＞
ハイブリダイゼーション及び洗浄の後に、マイクロアレイスライドを読み取ることが可能であり、デュアルレーザースキャナ（Ｉｎｎｏｓｃａｎ ７１０Ａ以降のバージョン、イノプシス社（Ｉｎｎｏｐｓｙｓ））を用いてマイクロアレイ情報を取得し、画像として保存する。マイクロアレイの読み取りには、データ品質を向上させる専用の構成がある。レーザーが蛍光タグを励起し、光電子増倍管が専用の値でシグナル強度を増加させることで、特定の比の値が得られる。得られたシグナル強度はアレイ内の各点に結合した標的分子の数に比例する。スキャナーは、各チャネルアレイについて２つのデジタル画像を作成するように構成され、各チャネル毎に各スポットから得られた情報は、保存され、各スポットの強度の抽出及び算出のためにソフトウェア画像を用いて解析された。

＜データ解析＞
一連の６つの試験対男性基準ＤＮＡハイブリダイゼーションのマイクロアレイ生データが得られ、これはチャネル毎のスポット収載強度値からなり、各特徴についてのチャネル間の強度比が算出可能である。両チャネルの強度比は、基準ＤＮＡに対する、各試験上の標的分子の相対的存在量に相当する。データ解釈は、マイクロアレイ解析に採用される専用の統計手法を含み、これらのマイクロアレイ結果を可視化するための専門のソフトウェアが開発された。主な工程の論理シーケンスが図６、図７及び図８に記載されている。

この手順の詳細は以下の通りである。

マイクロアレイの各クローンポジションにおける検査ハイブリダイゼーション及び基準ハイブリダイゼーションの振幅シグナルが測定され、前処理され、ｌｏｇ２比として組み合わされる。このシグナルは、対応するゲノム領域における、被検及び基準のコピー数変化（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ）のｌｏｇ２比に比例すると仮定される。基準ＤＮＡが選ばれた正倍数体である場合、被検試料におけるコピー数変化に関する情報得ることができる。１つのＣＧＨ−アレイ実験から得られる生データは、数千のクローン特異的ｌｏｇ２比からなる。

本発明のアルゴリズム実行は、シングルチップ及びマルチチップ解析を可能とし、関連する統計的調査を支援することができる。図５は全解析工程の模式的な全体像であり、各工程は図２、図３及び図４に詳述されている。

上記方法の感度を更に向上するために、画像品質管理アルゴリズムを適用して、バックグラウンドノイズを算出及び低減することが可能である。この場合、画像強度抽出の後に、３つの異なる工程において形態及びスポット強度の品質管理が実行され（図６）、図７では、２つの異なるアルゴリズム（アルゴリズム１及び２）が適用されることで、より高いノイズが算出及び低減されている。

また、同じコピー数を有する隣接するクローンのセグメントを検出することを目的とするため、且つ各染色体への品質パラメーター値の割当（アルゴリズム３）のための、一連の特定アルゴリズムも実行された。得られたセグメントは、重複、欠失及び正常なコピー数を有するセグメントに分類される。次のアルゴリズム（アルゴリズム４）は、欠失カテゴリー又は重複カテゴリー内での閾値の特定及び区別のために適用される。この技術の範囲中で、アルゴリズム１、２及び３の適用はロバストなノイズ評価を与えることから、全てのアレイに対し固定の閾値がｌｏｇ２比目盛り上に一律に指定される。

セグメントレベルが閾値を越えている場合は重複に分類され、閾値のマイナス値を下回るセグメントは欠失と見なされ、閾値境界上のセグメントは警告症例に分類される。この工程において、アルゴリズム５及び６は、真の染色体異常、及び最終的には境界域の染色体をそれぞれ特定することが可能である（図７）。

第二の基準ＤＮＡ解析は、同じ画像処理、すなわち、３つの画像品質管理工程とその後の１〜６のアルゴリズムの適用を受ける。品質管理の結果は図９でハイライトされており、図中、それぞれのデータラベルを有するそれぞれの女性基準実験のＳＤの間での比較が報告されている。総合ＳＤ値が均一であることが明らかになり、これらの間の差異は非常に小さい（約０．００４のＳＤ）。このデータにより、基準調製の正確さが確認され、この手順を、関連する異常なクローンの割合で被検ＤＮＡのＣＧＨアレイを解釈するために充分なほどにロバストなものにしている。

試験結果が図８Ａの表に示されており、図中、男性及び女性基準ＤＮＡの両方についして解析された対応する重複／欠失染色体が報告されている。被検ＤＮＡの振幅プロファイルが、女性基準ＤＮＡの品質管理試料及び５つの異なるアレイハイブリダイゼーション試料と比較された。各々のＳＤ値が図１０に記載されており、それらの中央値及び総合ＳＤ値（それぞれ０．０３７及び０．０１４）が最後に添えられている。被検ＤＮＡの解析はＳＤ間の多岐にわたる値をもたらしたものの、全データの包括的正規化によって、データ読み取りがエラーが少なく時間のかからないものとなり、ＣＮＶ検出の手順全体が成功した。実際、検出を達成する試みが失敗したのは細胞株解析の５例のうち１例のみであった。

図８Ａに示されるように、被検ＤＮＡ対男性基準ＤＮＡ（基準１ＤＮＡ）のＣＮＶ検出（染色体重複／欠失として報告）を次に、被検ＤＮＡ対「品質管理された」ＤＮＡ女性基準又は標準ＤＮＡ女性基準（基準２ＤＮＡ）のＣＮＶ検出と比較する（この実験では、正規化の目的のために、基準２ＤＮＡを含むハイブリダイゼーションが、５つの別々のハイブリダイゼーションアレイに対して繰り返され、染色体重複／欠失として報告された、得られた対応するＣＮＶは見出し基準試料（ａ）〜（ｅ）の下に示されており；判定は、被検ＤＮＡ１〜被検ＤＮＡ６として図８Ａに示される、異なる起源の６つの被検ＤＮＡに対して同時に行われた）。２つのデータセット（１つ目は被検ＤＮＡに関連したデータ、２つ目は基準２ＤＮＡに関連したデータ）を得るために、この結果は前の工程に適用されるのと同じ画像手順を通じて達成され、特定アルゴリズム（アルゴリズム７）によってこれら２つのデータセットを比較及び正規化する（図８）。一致した染色体異常の測定は、第一の（被検ＤＮＡ対基準ＤＮＡ１）並びに女性品質管理及び第二のＣＧＨアレイ（被検ＤＮＡ対基準ＤＮＡ２）のそれぞれの両方から、暫定的な結果の組合せを通じて得られる。図１３は、単一領域解析の結果を描写している図画による一例を示しており、図中、被検試料が男性基準ＤＮＡと比較されており、同じウィンドウで、女性基準ＤＮＡと比較された被検試料の結果も報告されている。

対照解析から得られるそれぞれの核型を、図８ＢにおけるＣＮＶ読み取りにより、ＰＧＳ核型と比較した。図１１にデザインされたマップ染色体は、研究された染色体全ての完全一致を強調している。

それぞれの一連の女性基準及び品質管理の間でのＣＮＶ検出の一致も評価した。染色体の重複、欠失、正常及び境界の点から測定されたＣＮＶ傾向が図１２に示されている。結果は、被検ＤＮＡ１〜被検ＤＮＡ５については１００％の一致を明らかに示した一方、女性基準試料１は１例（細胞株）でのみ正しいＸ染色体の検出に失敗し、基準試料３は同じケースにおいて境界レベルでのＸ染色体検出を示した。これは通常リンパ芽球様細胞株の性質による事象であるが、全体の一致は約６０％であった。

結論として、３０の実験の実験セット全体の一致は９３％であり、ＩＶＦ試料については一致は１００％であった。

参考文献
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Claims (17)

1. （ａ） 被検ＤＮＡを第一マーカーで標識して、標識された被検ＤＮＡを得る工程；
   （ｂ） 男性（又は女性）基準ＤＮＡを、前記第一マーカーとは異なる第二マーカーで標識して、標識された男性（又は女性）基準ＤＮＡを得る工程；
   （ｃ） 工程（ａ）及び工程（ｂ）で得られたＤＮＡを検査ハイブリダイゼーションアレイにハイブリダイズして、対応するハイブリダイズされたＤＮＡ分子に由来する、両マーカーからのシグナル強度の混合パターンを得る工程；
   （ｄ） 工程（ｃ）の混合パターンから、前記第一マーカーから生じた単一シグナル強度及び前記第二マーカーから生じた単一シグナル強度を決定する工程；
   （ｅ） 工程（ｄ）で得られた２つのシグナル強度を互いに比較することで、前記被検ＤＮＡにおけるコピー数多型（ＣＮＶ）の第一評価を行う工程；
   （ｆ） 工程（ｂ）で使用されたものとは性別が逆の基準ＤＮＡを、前記第一マーカーで標識して、前記第一マーカーで標識された基準ＤＮＡを得る工程；
   （ｇ） 工程（ｂ）で使用されたものとは性別が逆の前記基準ＤＮＡを、前記第一マーカーとは異なる前記第二マーカーで標識して、前記第二マーカーで標識された基準ＤＮＡを得る工程；
   （ｈ） 工程（ｆ）及び工程（ｇ）で得られた両ＤＮＡを基準ハイブリダイゼーションアレイにハイブリダイズして、対応するハイブリダイズされたＤＮＡ分子に由来する、両マーカーからのシグナル強度の混合パターンを得る工程；
   （ｉ） 工程（ｈ）の混合パターンから、前記第一マーカーから生じた単一シグナル強度及び前記第二マーカーから生じた単一シグナル強度を決定する工程；
   （ｊ） 以下を互いに比較することで、前記被検ＤＮＡにおけるＣＮＶの第二評価を行う工程：
   工程（ｄ）で決定された前記第一マーカーで標識された前記被検ＤＮＡのシグナル強度と、
   工程（ｉ）で決定された前記第二マーカーで標識された前記基準ＤＮＡのシグナル強度；
   （ｋ） 工程（ｅ）及び工程（ｊ）で得られたＣＮＶ値を組み合わせて、最終的なＣＮＶ判定を得て、解析に供された被検ＤＮＡ全体に関するＣＮＶ値を得る工程
   を含み、
   前記工程（ｆ）〜（ｉ）を実行する代わりに、工程（ｉ）で記載のシグナル強度を、前記シグナル強度が既に記録されているデータストレージサポートから入手してもよく、
   前記男性基準ＤＮＡは１若しくは複数の男性ドナーから得られたものであり、且つ／又は、前記女性基準ＤＮＡは１若しくは複数の女性ドナーから得られたものである、
   被検ＤＮＡ全体にわたってコピー数多型の存在及び数を評価する単一アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法。
2. 前記被検ＤＮＡ及び／又は基準ＤＮＡが１つのＤＮＡ分子に存在している、請求項１に記載の方法。
3. 前記被検ＤＮＡ及び／又は基準ＤＮＡが２つ以上のＤＮＡ分子に存在している、請求項１に記載の方法。
4. 前記被検ＤＮＡのドナーの性別が不明である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記被検ＤＮＡが単一細胞又は同一個人の細胞混合物から得られたものである、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記基準ＤＮＡが、一つ又は複数の所定のゲノム領域における少なくとも１つのコピー数変化の、段階希釈した、ＤＮＡの混合物である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. 工程（ｊ）において、工程（ｄ）で決定された前記第一マーカーで標識された前記被検ＤＮＡの前記シグナル強度が、Ｘ−重複及びＹ−欠失を示す遺伝子型に由来するものである、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程（ｅ）及び工程（ｊ）において、ＣＮＶの評価が、シグナル強度の定量化、データ正規化、統計解析、バイアス低減、染色体関連性シグナル強度の算出、及び染色体関連性ＤＮＡセグメントの生成を含む、ソフトウェアを利用した手法によって得られる、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記増幅された基準ＤＮＡが第二の増幅を経て対応する標識ＤＮＡを生じ、前記増幅された被検ＤＮＡが同じ第二の増幅を経て対応する標識ＤＮＡを生じる、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記基準ＤＮＡが様々な濃度の様々な遺伝子型の混合物である、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記被検ＤＮＡがヒト又は動物の単一の細胞又は生検材料から得られる、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記コピー数多型の評価が、正しい染色体状態について最適な卵母細胞、精子又は正しい胚の選択を可能にする、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 体外受精（ＩＶＦ）プログラムにおける卵母細胞受精及び胚移植を更に含む、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 工程（ｉ）に記載のシグナル強度が、バイアス及び非特異的シグナルを含まず、以下の手順：
    （Ｉ）工程（ｆ）−（ｇ）−（ｈ）−（ｉ）を２回以上実行し、種々の製造バッチのマイクロアレイ上に各基準ＤＮＡをハイブリダイズする工程、並びに
    （ＩＩ）得られた結果をソフトウェア処理して、バイアス及び非特異的シグナルを含まない前記シグナル強度を得る工程
    によって得られたものである、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 工程（ｉ）に記載のシグナル強度が、請求項１４に記載の工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）によって得られる、バイアス及び非特異的シグナルを含まない対応するシグナル強度との比較によって「品質管理」されたものである、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
16. 好適な支持体上に積層された、
    一つ又は複数の被検ＤＮＡに対して工程（ａ）〜（ｅ）を実行するための一つ又は複数のハイブリダイゼーションアレイ、及び
    工程（ｈ）を実行するための単一アレイ
    を備える、請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の方法を実行するための分析手段。
17. 一つ又は複数の被検ＤＮＡに対して工程（ａ）〜（ｅ）を実行するための一つ又は複数のハイブリダイゼーションアレイ、
    適切なデータストレージサポートに記録された工程（ｉ）の基準シグナル強度、又は、その代わりとして、工程（ｈ）を実行するための基準アレイ並びにそれを実行するために必要な標識された男性及び女性基準ＤＮＡ；これらは前記基準ＤＮＡの品質管理に関連していてもよい、
    を含む、請求項１〜請求項１５に記載の方法を実行するためのキット。