CN111432797A - 含有发酵茶提取物的用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤、增强皮肤屏障及抗氧化、抗老化或抗炎的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物，所述组合物含有作为有效成分的发酵茶提取物，该组合物能够将表达量受微尘影响的皮肤细胞中的基因的表达量调节至正常水平，所述表达量受微尘影响的皮肤细胞中的基因为选自IL‑1B(NM_000576)、IL‑36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)中的一种或多种基因。通过使用所述用于护理因微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物，可将因微尘而改变的基因的表达量恢复至正常水平，从而对受损的皮肤细胞进行护理。
Description
技术领域
本发明公开了一种用于增强皮肤屏障的组合物。尤其，本发明公开了一种含有发酵茶提取物的组合物，所述组合物通过显著地改变相比于正常皮肤细胞、因微尘使得表达水平被改变的作为皮肤细胞基因的生物标志物等，来对皮肤细胞损伤进行护理；通过显著地改变相比于正常皮肤细胞、因皮肤屏障减弱使得表达水平被改变的作为皮肤细胞基因的生物标志物等，来增强皮肤屏障；或者通过显著地改变相比于正常皮肤细胞、因老化和炎症使得表达水平被改变的作为皮肤细胞基因的生物标志物等，来降低皮肤细胞的氧化、老化和炎症。
背景技术
皮肤作为直接暴露于外界环境中的身体部位，不仅充当保护我们身体重要器官的保护膜，还具有调节水分蒸发并保护身体免受外界感染的作用。但是，虽然皮肤能够抵御来自外界的病毒侵袭，但皮肤过度地暴露于紫外线或污染物等中时，会引起皮肤刺激，尤其是伴有强风和沙尘的黄沙会使皮肤受损。
黄沙是一种微小沙粒或黄土从中国和蒙古等的内陆沙漠中漂浮，并随着高空风被运送至远方，然后跌落至地面附近的现象。在韩国，也在每年春天周期性地出现黄沙。黄沙是有机物与无机物的复合体，其物理性质和组成成分会随着发生时间和地点而具有极大的差异，并且还含有可以引起生物学效应的金属成分。如黄沙的大粒径颗粒主要停留在起源地或周边区域，而其中粒径小的尘土则一直流入至国内，并且据报道，这些粉尘被吸入后会沉积到下支气管和肺部的换气部位，从而会对呼吸系统造成损害。此外，还从居住在黄沙、尘土较多的区域的人们的皮肤中观察到皮肤细胞的损伤增加。
另一方面，皮肤组成层中的表皮在防止人体内的水分蒸发方面起着重要的作用。表皮从外部依次分为角质层、颗粒层、棘层及基底层。角质层的细胞起到类似于砖块的作用，而角质细胞之间的细胞间脂质起到如砂浆般的作用，从而构成皮肤屏障。此外，健康的人的角质形成细胞中存在高浓度的天然保湿因子(Natural Moisturing Factor,NMF)，从而有助于保持皮肤的水分，例如，由于诸如氨基酸的物质具有水溶性，因此能够通过与水分有效地结合来抑制皮肤干燥。
然而，如今，由于如随着环境或生活方式的改变而对加热/冷却的人工温度调控、社会生活中出现的各种压力和环境污染造成的皮肤压力、化妆习惯所导致的频繁地洗脸，以及随着年龄增长导致的自然皮肤老化等的各种原因，使角质层的水分减少，从而导致皮肤干燥、表面粗糙，并出现因皮肤松弛和失去水润感而气色不佳等的现象，由此，对皮肤保湿剂的需求正持续增加。此外，从外界接收到过度的物理刺激、化学刺激、紫外线、压力及营养缺乏等会导致皮肤的正常功能下降，并促进如丧失弹性、角质化和生成皱纹等现象的产生，尤其紫外线会使表皮真皮的交界受到严重的损伤。此外，从外界接收到过度的物理刺激、化学刺激、紫外线、压力及营养缺乏等会使皮肤的正常功能下降，并促进如丧失弹性、角质化和生成皱纹等的皮肤老化现象的产生，尤其紫外线会使表皮真皮的交界受到严重的损伤。
白介素1被归类为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretoryphenotype,SASP)，尤其，已知作为代表性衰老标志物的白介素1b(IL-1b)参与细胞衰老(Cellular senescence)(参见非专利文献5)。还已知，IL-1b和PTGS2参与皮炎，并且，XDH表示由于长时间暴露于刺激源中而引起的氧化应激(oxidative stress)，因此是外源性皮肤衰老的指标(参见非专利文献1)。此外，关于皮炎，还已知暴露于刺激源中的皮肤细胞中的PTGS2(＝COX-2)的表达量增加(参见非专利文献6)，并且，作为皮肤的氧化应激(oxidativestress)的指标的XDH(黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase))也参与皮肤衰老。
已知，在因皮肤屏障减弱引起的牛皮癣等中，IL-36G是的有用的生物标志物(参见非专利文献2)。并且，已知S100A7是因皮肤屏障功能障碍引起的特应性皮炎和牛皮癣的相关指标(参见非专利文献3)。此外，还已知LCE3D是牛皮癣风险基因的相关指标(参见非专利文献4)。上述文献的全部内容通过引用结合在本申请中。
【现有技术文献】
【非专利文献】
(非专利文献1)Kim，H.J.等人，“大气PM2.5对人角质形成细胞有害影响的转录组分析”，《毒理学快报》，273，26-35，2017年(Kim,H.J.,et al,“Transcriptome analysis ofairborne PM2.5-induced detrimental effects on human keratinocytes”,ToxicologyLetters 273,26-35,2017.)
(非专利文献2)AM D’Erme等人，“IL-36c(IL-1F9)是牛皮癣皮肤病变的生物标志物”，《皮肤病学研究杂志》，第135卷，2015年(AM D’Erme et al,“IL-36c(IL-1F9)Is aBiomarker for Psoriasis Skin Lesions”,Journal of Investigative Dermatology,Volume 135,2015.)
(非专利文献3)Son等人，“S100A7(牛皮癣素)通过IjB/NF-jB信号传导增强IL-6分泌来抑制人表皮分化”，《实验皮肤病学》，约翰·威利父子公司，2016年(Son et al,“S100A7(psoriasin)inhibits human epidermal differentiation by enhanced IL-6secretion through IjB/NF-jB signalling”,Experimental Dermatology,John Wiley&Sons A/S,2016.)
(非专利文献4)Bergboer等人，“与其他LCE组的基因相比，晚期角质化包膜-3组的银屑病风险基因的表达更为显著”，《美国病理学杂志》，第1卷，178，第4号，2011年4月(Bergboer et al,“Psoriasis Risk Genes of the Late Cornified Envelope-3GroupAre Distinctly Expressed Compared with Genes of Other LCE Groups”,TheAmerican Journal of Pathology,Vol.178,No.4,April 2011.)
(非专利文献5)Jean-PhilippeCoppe等人，“衰老相关分泌表型：肿瘤抑制的阴暗面”，《病理学年度回顾：疾病的机制》，第5卷,2010年(Jean-Philippe Coppe,et al,“TheSenescence-Associated Secretory Phenotype:The Dark Side of TumorSuppression”,Annual Review of Pathology:Mechanisms of Disease,volume 5,2010.)
(非专利文献6)Natalia D Magnani等人，“与接触大气中的颗粒物有关的皮肤损伤机制”，《毒理科学》，149(1)，2016年，227-236(Natalia D Magnani,et al,“Skin DamageMechanisms Related to Airborne Particulate Matter Exposure”,toxicologicalsciences,149(1),2016,227-236.)
发明内容
技术问题
基于此，本发明人发现微尘会对皮肤产生有害影响，并且皮肤细胞基因的表达也会因这些影响而受到影响，从而出现皮肤细胞受损等的症状。
因此，在一方面，本发明旨在提供一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物。
技术方案
为了实现上述目的，在一方面，本发明旨在提供一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物，所述组合物含有作为有效成分的发酵茶提取物，该组合物能够将表达量受微尘影响的皮肤细胞中的基因的表达量调节至正常水平，所述表达量受微尘影响的皮肤细胞中的基因为选自IL-1B(NM_000576)、IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)中的一种或多种基因。
有益效果
一方面，通过使用本发明所提供的用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，可将因微尘而改变的基因的表达量恢复至正常水平，从而对受损的皮肤细胞进行护理。
一方面，通过使用本发明所提供的用于增强皮肤屏障的组合物，可将因引起皮肤屏障减弱的刺激源而改变的基因的表达量恢复至正常水平，从而减轻皮肤细胞的损伤。
一方面，通过使用本发明所提供的用于抗氧化、抗老化及抗炎的组合物，可将因炎症或老化刺激而改变的基因的表达量恢复至正常水平，从而减轻皮肤细胞的损伤。
附图说明
图1示出了经刺激源处理后的细胞存活率，其中ADSP代表作为亚洲沙尘暴颗粒(Asian dust storm particle)的黄沙，PM10(颗粒物10(Particulate matter 10))代表粒径为10μm的微尘，PM2.5(颗粒物2.5(Particulate matter 2.5))代表粒径为2.5μm的微尘。
图2a示出了，在被微尘刺激的皮肤细胞中，IL-36G基因的mRNA表达量增加，并通过发酵茶处理而恢复至正常水平。
图2b示出了，在被PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中，IL-1B基因的mRNA表达量增加，并通过发酵茶处理而恢复至正常水平。
图2c示出了，在被PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中，PTGS2基因的mRNA表达量增加，并通过发酵茶处理而恢复至正常水平。
图2d示出了，在被微尘刺激的皮肤细胞中，LCE3D基因的mRNA表达量增加，并通过发酵茶处理而恢复至正常水平。
图2e示出了，在被PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中，XDH基因的mRNA表达量增加，并通过发酵茶处理而恢复至正常水平。
图2f示出了，在被微尘刺激的皮肤细胞中，S100A7基因的mRNA表达量增加，并通过发酵茶处理而恢复至正常水平。
图3a示出了作为通过液相色谱-质谱法(高分辨率LC-MS)分析发酵茶成分的结果的原料TIC的色谱图。
图3b示出了作为通过液相色谱-质谱法(高分辨率LC-MS)分析发酵茶成分的结果的原料中的奎宁酸的色谱图。
图3c示出了作为通过液相色谱-质谱法(高分辨率LC-MS)分析发酵茶成分的结果的奎宁酸标准品的色谱图。
图3d示出了作为通过液相色谱-质谱法(高分辨率LC-MS)分析发酵茶成分的结果的奎宁酸分子量的色谱图。
具体实施方式
以下，将详述本发明。
在本发明的一方面，所述用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物可含有作为有效成分的发酵茶提取物。
在本发明的一方面，所述用于增强皮肤屏障的组合物可含有作为有效成分的发酵茶提取物。
本说明书中所使用的“发酵茶”是指经发酵的茶，具体地，是指后发酵茶(post-fermented tea)。
本说明书中所使用的“后发酵茶”是指在适当的水分和温度等条件下，利用微生物进行发酵和熟化的茶。
一方面，本说明书中所使用的后发酵茶可以包含后发酵茶自身的粉碎物、或后发酵茶的干燥粉碎物，但不限于此。
在本发明的一方面，所述发酵茶可包含奎宁酸(quinic acid)。
在根据本发明的一个实施例的用于增强皮肤屏障的组合物中，所述茶可以是绿茶。在本发明的又另一方面，所述茶可以是发酵绿茶。
在一方面，所述发酵茶可以是经发酵和熟化的茶。
在一方面，所述发酵茶可以是将内部酶失活的茶叶进行自然发酵后的茶。
在本发明的一方面，可通过使用特定的提取溶剂对所述发酵茶进行提取来形成发酵茶提取物。
在本发明的一方面，所述发酵茶提取物可通过用水或有机溶剂对发酵茶进行提取来制备。具体地，可通过使用选自水、C1-C6无水或水合低级醇、丙酮、丁二醇、乙酸乙酯、乙酸二乙酯、二乙醚、苯、氯仿和己烷中的任意一种或多种提取溶剂对发酵茶进行提取来制备所述发酵茶提取物。
在一方面，所述发酵茶提取物可在常温下进行提取。
在一方面，所述发酵茶提取物可以是经所述提取溶剂提取后，进一步经过过滤、浓缩、分离或干燥过程中的一项或多项过程来获得。尤其，所述发酵茶提取物可经过一次或以上的过滤过程，在一个实施例中，所述发酵茶提取物经过两次过滤过程。
在一实个施例中，所述分离过程可包括离心分离过程。
具体地，所述提取可使用选自包括水、C1-C6无水或水合低级醇、丙酮和丁二醇的极性溶剂及包括乙酸乙酯、乙酸二乙酯、二乙醚、苯、氯仿和己烷的低极性溶剂中的任意一种或多种溶剂来进行。
更具体地说，所述溶剂可以是50％至90％的乙醇水溶液、60％至80％或65％至75％的乙醇水溶液。当所述溶剂为50％至90％的乙醇水溶液时，可以有效地从发酵茶中提取有效成分。在一个实施例中，所述溶剂可以是约70％的乙醇水溶液。
在一方面，在提取后，可在安装有冷凝器的蒸馏装置中，以适合的温度对所述提取物进行减压浓缩。
然而，根据本发明的发酵茶提取物可以通过使用本领域的常规方法进行提取来获得，并且不受上述方法的限制。
在本发明的一方面，在组合物中，所述组合物可含有占组合物总重量的0.000001重量％至30重量％的发酵茶提取物。当该含量为0.000001重量％至30重量％时，发酵茶提取物具有优异的护理由微尘引起的皮肤损伤的效果、增强皮肤屏障增的效果、或者抗氧化、抗老化和抗炎的效果。
具体地，可为0.0000001重量％或以上、0.0000005重量％或以上、0.0000007重量％或以上、0.0000009重量％或以上、0.000001重量％或以上、0.000002重量％或以上、0.000004重量％或以上、0.000006重量％或以上、0.000008重量％或以上、0.00001重量％或以上、0.00003重量％或以上、0.00005重量％或以上、0.00007重量％或以上、0.00009重量％或以上、0.0001重量％或以上、0.0003重量％或以上、0.0005重量％或以上、0.0007重量％或以上、0.0009重量％或以上、0.001重量％或以上、0.01重量％或以上、0.1重量％或以上、1重量％或以上、3重量％或以上、5重量％或以上、7重量％或以上、9重量％或以上、10重量％或以上、13重量％或以上、15重量％或以上、17重量％或以上、19重量％或以上、21重量％或以上、23重量％或以上、25重量％或以上、27重量％或以上、29重量％或以上、30重量％或以上、31重量％或以上，且2重量％或以下、31重量％或以下、30重量％或以下、29重量％或以下、28重量％或以下、26重量％或以下、24重量％或以下、22重量％或以下、20重量％或以下、18重量％或以下、16重量％或以下、14重量％或以下、12重量％或以下、10重量％或以下、9重量％或以下、8重量％或以下、6重量％或以下、4重量％或以下、2重量％或以下、1重量％或以下、0.1重量％或以下、0.09重量％或以下、0.04重量％或以下、0.01重量％或以下、0.006重量％或以下、0.001重量％或以下、0.0009重量％或以下、0.0007重量％或以下、0.00005重量％或以下、0.00003重量％或以下、0.00001重量％或以下、0.000009重量％或以下、0.000007重量％或以下、0.000005重量％或以下、0.000003重量％或以下、0.000001重量％或以下、0.0000009重量％或以下、0.0000007重量％或以下、0.0000005重量％或以下、0.0000003重量％或以下、0.0000002重量％或以下、0.0000001重量％或以下、0.00000009重量％或以下，但不限于此。
在另一方面，本发明包括所述组合物的对由微尘引起的皮肤损伤的用途。
本说明书中所使用的“微尘”是指我们眼睛不可见的极其微小的物质，是一种长时间漂浮或飞散在大气中的颗粒状物质，一种粒径为10μm或以下的物质。具体而言，将粒径为2.5μm(PM2.5)或以下的颗粒状物质称为“超细微尘”，在本说明书中，“微尘”也包括“超细微尘”。
在本说明书中所使用的术语“护理”是指有效地保护皮肤细胞免受刺激，并抑制、防止和恢复(复原)由上述刺激所引起的特定基因的表达量的变化。
在一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物通过将因微尘而受损的皮肤细胞中的特定基因的表达量调节至正常水平来抑制由微尘引起的皮肤细胞损伤。
在一方面，所述组合物可作用于角质形成细胞(keratinocyte)。
在一方面，具体地，在本发明中，表达量受微尘影响的皮肤细胞中的基因包括IL-1B(NM_000576)、IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)和XDH(NM_000379)等。由于所述IL-1B(NM_000576)、IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)和XDH(NM_000379)是表达量会因微尘而增加的基因，因此可以通过抑制这些基因的表达量来将表达量调节至正常水平，从而抑制皮肤细胞的损伤。
本发明中所使用的表达量因微尘而增加的基因如【表1】所示。【表1】示出了表达量因微尘而增加的基因，在这些表中，名称(Name)表示NCBI(美国国家生物技术信息中心)的Genebank登录号(genebank accession ID)，基因符号(Gene Symbol)表示官方基因符号，基因全称(Gene title)表示各基因的名称。这些内容可以通过非专利文献1中记载来确认。
【表1】
在另一方面，本发明包括根据本发明的组合物的增强皮肤屏障的用途。
在另一方面，本发明提供一种用于增强受试者的皮肤屏障的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的发酵茶提取物的步骤。
在另一方面，本发明提供一种发酵茶提取物在制备用于增强皮肤屏障的组合物中的用途。
在另一方面，本发明提供一种用于增强皮肤屏障的发酵茶提取物。
在一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物通过在因能够减弱皮肤屏障的刺激而受损的皮肤细胞中将特定基因的表达量调节至正常水平来增强皮肤屏障。
在一方面，所述组合物可作用于角质形成细胞(keratinocyte)。
在一方面，具体地，在本发明中，表达量受使皮肤屏障减弱的刺激所影响的皮肤细胞中的基因包括S100A7(NM_002963)、IL-36G(NM_019618)和LCE3D(NM_032563)等。由于所述S100A7(NM_002963)、IL-36G(NM_019618)和LCE3D(NM_032563)是表达量会因使皮肤屏障减弱的刺激而增加的基因，因此，可以通过抑制这些基因的表达量来将表达量调节至正常水平，从而增强皮肤屏障。
在一方面，本发明中所使用的表达量因使皮肤屏障减弱的刺激而增加的基因如【表2】所示。在表中，名称(Name)表示NCBI(美国国家生物技术信息中心)的Genebank登录号(genebank accession ID)，基因符号(Gene Symbol)表示官方基因符号，基因全称(Genetitle)表示各基因的名称。
【表2】
在另一方面，本发明包括根据本发明的组合物的抗氧化用途、抗老化用途及抗炎用途。
在一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物通过在因氧化、炎症或老化刺激而受损皮肤细胞中将特定基因的表达量调节至正常水平来抑制氧化、炎症或老化。
在一方面，所述组合物可作用于角质形成细胞(keratinocyte)。
在一方面，具体地，在本发明中，表达量受氧化、炎症或老化刺激影响的皮肤细胞中的基因包括IL-1B(NM_000576)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)等。由于所述IL-1B(NM_000576)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)是表达量会因氧化、炎症或老化刺激而增加的基因，因此，可以通过抑制这些基因的表达量来将表达量调节至正常水平，从而抑制皮肤细胞的氧化、炎症或老化。
在一方面，本发明中所使用的表达量因氧化、炎症或老化刺激而增加的基因如【表3】所示。在表中，名称(Name)表示NCBI(美国国家生物技术信息中心)的Genebank登录号(genebank accession ID)，基因符号(Gene Symbol)表示官方基因符号，基因全称(Genetitle)表示各基因的名称。
【表3】
上述基因或蛋白质的表达量分析可使用微阵列、PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)、NGS(Nest Generation Sequencing，二代测序)、蛋白质印迹法、Northern印迹法、ELISA法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、免疫组织化学染色法、免疫沉淀分析法等本领域公知的各种分析方法来进行。
在本发明的一方面，所述组合物可以是化妆品组合物、药物组合物或保健食品组合物。
所述化妆品组合物包括例如各种霜、乳液、爽肤水等的化妆品、以及清洁剂、洗面奶、肥皂和美容液等。
在一方面，添加有含有根据本发明的所述发酵茶提取物的组合物的化妆品组合物可以溶液、乳化物、粘性混合物等的形式使用。
即，在一方面，根据本发明的化妆品在其的剂型上不受特别限制，例如可为乳液、霜、化妆水、精华、面膜、凝胶、粉末、妆前乳、粉底、润肤乳、软膏、贴剂、美容液、清洁泡沫、卸妆霜、卸妆水、身体乳、身体霜、身体油、身体精华、洗发水、护发素、沐浴露、肥皂、染发剂和喷雾剂等剂型。
在各种剂型的化妆品组合物中，除了所述发酵茶提取物之外，本领域技术人员可以毫无困难地根据其他的化妆品剂型或使用目的适当地选择其他成分来进行配制。
此外，在一方面，根据本发明的化妆品可以包含选自水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽，高分子多糖、鞘脂脂质和海藻提取物的组合物。
在一方面，在根据本发明的化妆品中，也可根据需要将通常化妆品中使用的其他成分与上述必需成分一起配制。
除此之外，还可以添加的配合成分例如有有机成分、保湿剂、润肤剂、界面活性剂、有机和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、乙醇、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。
此外，可另外添加的配合成分不限于此，在不损害本发明的目的和效果的范围内，还可配合上述成分中的任何成分。
在一方面，含有根据本发明的发酵茶提取物的药物组合物可进一步包含通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。
作为所述药物提取物的剂型，可以分别按照常规方法，将含有所述发酵茶提取物的药物组合物配制为如片剂、胶囊、散剂或糖浆等的口服剂，或如药膏、凝胶、霜剂、贴剂或喷雾剂等的外用制剂等的适用于药物制剂的任何形式来使用。
应当理解的是，当以所述药物组合物的形式进行施用时，通常应根据如症状的严重程度、所选择的给药途径、受试者的年龄、性别、体重和健康状况等的多种相关因素来确定有效成分的实际给药剂量。通常，有效成分的给药剂量可为0.0001mg/kg/日至3000mg/kg/日，例如，可为10mg/kg/日至500mg/kg/日。
在根据本发明的一方面的保健食品组合物中，保健食品是使用在日常膳食中容易缺乏的营养素，或具有对人体有用的功能的原料或成分(功能性原料)所制备的保健食品，是能够通过维持人体的正常机能或激活生理机能来维持和改善健康的食品，但不限于此。所述保健食品可以被制备、加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸剂等的剂型，但不限于此，可以根据法律制备、加工成任何剂型。
具体地，保健饮料组合物除了以指定比例含有作为必需成分的所述化合物外，对其他成分没有特别限制，并且如通常的饮料一样，可以包含各种调味剂或天然碳水化合物等附加成分。天然碳水化合物例如有单糖、二糖(例如葡萄糖、果糖等)、多糖(例如麦芽糖、蔗糖等)、常见的糖类(例如糊精、环糊精等)以及糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等)等。除上述之外，所述调味剂可使用天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等))和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
应该理解的是，当以所述保健食品组合物的形式进行施用时，通常应根据例如症状的严重程度、所选择的给药途径、受试者的年龄、性别、体重和健康状况等的各种相关因素来确定有效成分的实际给药剂量。通常，有效成分的给药剂量可为0.0001mg/kg/日至1000mg/kg/日，例如，可以为0.02mg/kg/日至6mg/kg/日。
实施例
以下，将通过具体实施例对本发明的构成和效果进行更详细地描述。但是，这些实施例的目的仅在于举例说明本发明，本发明的范围和范畴不受这些实施例的限制。
【实施例1】发酵茶的制备
1-1.发酵步骤
通过将干燥的绿茶叶厚实地堆叠起来以备用，并使绿茶叶在高温高湿的环境中自然发酵，以使绿茶叶的水分含量达到30％至50％来制备发酵茶。在45℃的温度下，将准备好的绿茶叶进行6周的发酵。
1-2.熟化步骤
通过将发酵步骤1-1中的经发酵的发酵茶放入济州陶瓷器中进行50天的熟化来制备发酵茶。
【实施例2】发酵茶的成分分析
通过使用Thermo公司的液相色谱-质谱仪(Q Exactive高分辨率LC-MS)来分析实施例1中制备的发酵茶成分。从图3的色谱图中可以看出，在0.65分钟处检测到奎宁酸标准品，并且，在负离子模式(negative ion mode)下的理论m/z值为191.05556。当在发酵茶的负离子模式TIC(negative ion mode TIC)下，在分子量为191.05400到191.05650的范围内进行离子提取(ion extraction)时，在与标准品相同的RT 0.65分钟处检测到峰值。该峰的m/z值为191.05505，该值与奎宁酸的理论m/z值191.05556的误差在2.6ppm之内，从而可视为小数点后四位相同的分子量。由此，可以将原料中的0.65分钟的峰鉴定为奎宁酸。
【实施例3】发酵茶提取物的制备
在常温下，用将纯净水和乙醇以3：7的比例混合的提取溶剂，即使用70％的乙醇作为提取溶剂对实施例1的发酵茶进行提取。经过常温提取后，通过进行第一次过滤来去除提取物中所含有的固体物质，之后，通过将提取物进行浓缩以去除乙醇后，再对经浓缩的提取物进行分离和纯化。然后，将经分离和纯化的提取物进行离心分离与第二次过滤后，进行干燥以获得发酵茶提取物。
【实施例4】使皮肤屏障减弱的刺激源的制备
使用低容量空气采样器(Sensidyne公司，Gillian，Low Volume Air Sampler，佛罗里达，美国)来采集作为使皮肤屏障减弱的刺激源的微尘。在每个测量日上午的约10时更换过滤组(Filter pack)的过滤器(filter)和扩散管(denuder)，并进行约24小时的取样。每天在首尔的顺风地区(位于京畿道龙仁市处仁区，韩国外国语大学外国语研究中心，生活馆6层的屋顶)采集微尘，为期28天，并且，测量时间通过在打开真空泵的同时启动计器，之后记录关闭真空泵时计时器显示的时间来测量。取样流量设为16.7L/min，并在测量开始时用流量计(型号4143，TSI公司)测量流量，及在测量结束时再次测量流量。在取样前后，均对装载于过滤组(filter pack)内的特氟隆(Teflon)过滤器进行称重。在对特氟龙(Teflon)过滤器进行称重前，将该过滤器置于相对湿度为40％的干燥器(NIKKO公司，日本)中恒重24小时后，用能够显示小数点后五位的电子天平(DVG215CD，奥豪斯(Ohaus)公司)测量两次重量，并记录平均值。取样之后，在测量重量之前，也将过滤器置于干燥器中恒重24小时后再测量两次重量，并通过与取样前测定的重量进行比较来计算质量浓度。通过将特氟隆过滤器浸泡于1mL乙醇中后，再添加14mLDW(蒸馏水)，以在使过滤器的气溶胶取样面与水面相接触的状态下封盖，然后用超声波清洁器发出30分钟的超声波来进行微尘提取。在过滤步骤中，通过将过滤器置于干燥器(decicator)中48小时以完全去除过滤器的水分来最大程度地降低因水分引起的误差后，使用能够测定至0.1mg的超精度天平(梅特勒-托利多公司(MettlerToledo Company))称量过滤器的重量，以称量出对过滤器进行提取前、后的重量。
【实施例5】(正常人)角质形成细胞株的培养
将从龙沙公司(Lonza，Inc.，美国马里兰州沃克斯维尔)购入的(正常人)角质形成细胞(人正常表皮角质形成细(Human normal epidermal keratinocytes))进行继代培养后，在37℃、5％CO2的条件下，在CO2培养基(二氧化碳培养箱(CO2 incubator))中进行培养。根据龙沙公司的操作指南进行培养。在500ml的KBM-2(KBMTM-2，CC-3103)培养基中，使用KGM TM-2Bullet试剂盒CC-3107，KGM TM-2Bullet试剂盒CC-3107中添加有KGM TM-2Bullet试剂盒CC-4152(成分：BPE(牛脑垂体提取物)、人表皮生长因子(hEGF)、胰岛素、氢化可的松(Hydrocortisone)、转铁蛋白(Transferrin)、肾上腺素及硫酸庆大霉素+二性霉素B(Gentamicin Suflate+Amphofericin-B:GA-1000))。
【实施例6】对(正常人)角质形成细胞株的微尘处理及细胞毒性的测定
按照Mossman(J.Immunol.Methods,65,55-63,1983)等人的方法，使用(正常人)角质形成细胞株，通过进行MTT实验来确认微尘处理是否引起细胞毒性。
具体地，使用24孔板，将在上述实施例4中采集到的直径为2.5μm的微尘分散于纯净水中，以制备成微尘分散液后，按照实施例5的细胞培养条件，并在每孔的细胞数为2.5×105的条件下，在经培养的细胞中处理上述微尘分散液，并进行24小时的培养，然后，与5mg/ml的MTT(溴化3-4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑)进行混合，并在37℃下，进一步培养3小时。然后去除培养基，将形成的甲
晶体(formazan crystal)溶解于500μl的DMSO中。将该溶解物转移并等分分配(aliquot)至96孔板中，并在540nm处测量OD值。测量结果如【图1】所示。
如图1所示，在上述细胞株中，对由分散有2.5μm或以下的微尘的分散液引起的细胞毒性显示出80％的存活率的2.5μm或以下的微尘水溶性提取液的浓度(IC20)值为12.5μg/ml。
【实施例7】通过二代测序(Next Generation Sequencing)确认由微尘引起的细胞基因变化
按照Trapnell等人(2012年)所开发的常规分析步骤来对RNA碱基序列数据进行处理和分析。使用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)来确认RNA-seq数据质量，并使用FASTX(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)去除低精确度的碱基和衔接子序列(adapter sequence)。然后，使用Tophat(Trapnell等人，2009年)和人类基因组(hg19)进行比对，并使用重命名为RSeQC的EVER-seq来确认每种样品的数据量(Wang等人，2012年)。此外，使用Cufflinks对转录本(transcript)的表达水平进行定量，并比较经微尘分散液处理的样品和正常样品之间的转录水平(Trapnell等人，2010年)。通过应用FDR校正p值<0.05，且≥2.0倍数变化的严格分界(cut-off)来确定用直径为2.5μm的微尘分散体处理时表达差异显著的基因。测量结果如以下【表4】和【图2a】至【图2f】所示。
【表4】
【实施例8】实时qPCR定量
在1ml细胞培养基内，用12.5μg的从实施例4中提取的直径为2.5μm的微尘处理实施例5中培养的人角质形成细胞，并使用下表5中所示的基因的引物(applied biosystems
引物)来测量相对mRNA表达量。使用实施例3中制备的发酵茶提取物。
【表5】
在培养基中处理20ppm浓度的发酵茶提取物，经过24小时后去除培养液，然后，用2ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞后，用Trizol试剂(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)分离细胞中的RNA。使用QIAGEN公司的RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt，QIAGEN公司，Valencia，加利福利亚)再次纯化所分离的RNA后，使用2100型号生物分析仪(Agilent2100BioAnalyzer，安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies)，圣塔克拉拉，加利福尼亚州，美国)来确认RNA的质量(quality)。然后，使用逆转录试剂盒(Superscript逆转录酶(RT)试剂盒，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福利亚，美国)从RNA合成cDNA，并使用上述【表5】的引物，通过实时逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR)对合成的cDNA进行定量分析。使用TaqMan基因表达系统(TaqMan基因表达检测试剂盒(TaqMan gene expressionassay kit)，Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚)，通过实时PCR来评估细胞的基因表达模式的变化，其结果示于【图2a】至【图2f】中。所用的Q-RT-PCR和实时PCR均按照Life Technologies发布的标准协议进行，具体地，将以下过程进行40次循环，即将在95℃下处理20秒后，在95℃下处理3秒及在60℃下处理30秒。
如图【2a】至【2f】所示，证实了在受微尘刺激的皮肤细胞中，存在有表达量增加或减少的基因，并且，可通过处理发酵茶提取物来减少白介素-1β(IL-1B)、白介素-36γ(IL-36G)、S100钙结合蛋白A7(S100A7)、晚期角质化包膜蛋白3D(LCE3D)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因的表达量。
由此可知，发酵茶提取物可有效地保护皮肤细胞免受微尘的刺激，并通过抑制或防止由所述刺激引起的上述特定基因表达量的改变，从而将表达量调节至正常水平。此外，还可知发酵茶提取物可有效保护皮肤细胞免受由使皮肤屏障减弱的刺激引起的皮肤细胞损伤，并通过抑制或防止因所述使皮肤屏障减弱的刺激引起的上述特定基因表达量的改变来将表达量调节至正常水平。此外，还可知发酵茶提取物可有效保护皮肤细胞免受由氧化、炎症或老化刺激引起的皮肤细胞损伤，并通过抑制或防止因所述氧化、炎症或老化刺激引起的上述特定基因表达量的改变来将表达量调节至正常水平。
下面描述了根据本发明的组合物的剂型实施例，也可以应用各种于化妆品组合物、药物组合物和保健食品组合物的各种剂型，其目的在于详细描述本发明，但并不限制本发明。
【剂型实施例1】片剂
将100mg根据本发明的实施例的发酵茶提取物、400mg乳糖、400mg玉米淀粉和2mg硬脂酸镁进行混合后，再按照常规的片剂制备方法压片成片剂。
【表6】
| 配合成分 | 含量(mg) |
| 发酵茶提取物 | 100 |
| 乳糖 | 400 |
| 玉米淀粉 | 400 |
| 硬脂酸镁 | 2 |
【剂型实施例2】胶囊剂
将100mg根据本发明的实施例的发酵茶提取物、400mg乳糖、400mg玉米淀粉和2mg硬脂酸镁进行混合后，按照常规的胶囊剂的制备方法，将混合物填充于胶囊中，制备成胶囊。
【表7】
| 配合成分 | 含量(mg) |
| 发酵茶提取物 | 100 |
| 乳糖 | 400 |
| 玉米淀粉 | 400 |
| 硬脂酸镁 | 2 |
【剂型实施例3】颗粒剂
将50mg根据本发明的实施例的发酵茶提取物、250mg无水结晶葡萄糖和550mg淀粉进行混合，并使用流化床造粒机制备成颗粒后，填充到小袋中制备成颗粒剂。
【表8】
| 配合成分 | 含量(mg) |
| 发酵茶提取物 | 50 |
| 无水结晶葡萄糖 | 250 |
| 淀粉 | 550 |
【剂型实施例4】肥皂
【表9】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 发酵茶提取物 | 5.00 |
| 油脂 | 适量 |
| 氢氧化钠 | 适量 |
| 氯化钠 | 适量 |
| 香料 | 适量 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例5】乳液(lotion)
【表10】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 发酵茶提取物 | 5.00 |
| L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐 | 1.00 |
| 水溶性胶原蛋白(1％水溶液) | 1.00 |
| 柠檬酸钠 | 0.10 |
| 柠檬酸 | 0.05 |
| 甘草提取物 | 0.20 |
| 1,3-丁二醇 | 3.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例6】霜
【表11】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 发酵茶提取物 | 3.00 |
| 聚乙二醇单硬脂酸酯 | 2.00 |
| 自乳化单硬脂酸甘油酯 | 5.00 |
| 鲸蜡醇 | 4.00 |
| 角鲨烯 | 6.00 |
| 三异辛酸甘油酯 | 6.00 |
| 鞘糖脂(Sphingoglycolipid) | 1.00 |
| 1,3-丁二醇 | 7.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例7】软膏
【表12】
【剂型实施例8】美容液的制备
【表13】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 发酵茶提取物 | 3.00 |
| 羟乙烯纤维素(2％水溶液) | 12.00 |
| 黄原胶(2％水溶液) | 2.00 |
| 1,3-丁二醇 | 6.00 |
| 浓缩甘油 | 4.00 |
| 透明质酸钠(1％水溶液) | 2.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例9】保健食品
【表14】
【剂型实施例10】保健饮料
【表15】
| 配合成分 | 含量 |
| 发酵茶提取物 | 50mg |
| 柠檬酸 | 1000mg |
| 寡醣 | 100g |
| 牛磺酸 | 1g |
| 纯净水 | 余量 |
Claims (16)
1.一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物，其含有作为有效成分的发酵茶提取物。
2.一种用于增强皮肤屏障的组合物，其含有作为有效成分的发酵茶提取物。
3.一种用于抗氧化的组合物，其含有作为有效成分的发酵茶提取物。
4.一种用于抗老化的组合物，其含有作为有效成分的发酵茶提取物。
5.一种用于抗炎的组合物，其含有作为有效成分的发酵茶提取物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述发酵茶是将内部酶被失活的茶叶进行自然发酵后的茶。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述发酵茶提取物的含量占组合物总重量的0.000001重量％至30重量％。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述发酵茶提取物是通过使用选自水、C1-C6无水或水合低级醇、丙酮、丁二醇、乙酸乙酯、乙酸二乙酯、二乙醚、苯、氯仿和己烷中的任意一种或多种提取溶剂进行提取而获得。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物抑制选自IL-1B(NM_000576)、L-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)中的一种或多种基因的表达。
10.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物抑制选自IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)及LCE3D(NM_032563)中的一种或多种物质的表达。
11.根据权利要求3至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物抑制选自IL-1B(NM_000576)、PTGS2(NM_000963)和XDH(NM_000379)中的一种或多种物质的表达。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物作用于角质形成细胞。
13.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述微尘的粒径为2.5μm或以下。
14.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述发酵茶提取物的给药剂量为10mg/kg/日至500mg/kg/日。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为化妆品组合物。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为保健食品组合物。
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