CN111424109A

CN111424109A - 一种鉴定甜瓜抗白粉病性状的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111424109A
Application number: CN202010405868.5A
Authority: CN
Inventors: 曹燕燕; 张永平; 刁倩楠
Original assignee: SHANGHAI CO-ELITE AGRICULTURAL SCI-TECH (GROUP) CO LTD; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: SHANGHAI CO-ELITE AGRICULTURAL SCI-TECH (GROUP) CO LTD; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2040-05-14
Also published as: CN111424109B

Abstract

本本发明公开了一种用于鉴定甜瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用。本发明提供了一个与甜瓜抗白粉病QTL紧密连锁的SNP标记，该标记位于甜瓜第12号染色体第23930811碱基处。本发明利用获得的分子标记及其特异性引物，可用于甜瓜抗白粉病品种或品系的选育，从而减少工作量，降低育种成本，加快育种进程，具有很高的实际应用价值。

Description

一种鉴定甜瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定甜瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis Melo L.)为葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物，是世界范围内种植最广的经济作物之一。白粉病(powdery mildew,PM)作为甜瓜等葫芦科作物上广泛发生的一种世界性真菌病害，在露地栽培和保护地栽培中广泛发生。甜瓜感染白粉病菌后不仅导致其产量下降，同时还影响果实的成熟度和含糖量，从而降低甜瓜的品质和商品性，进而造成巨大的经济损失。

目前白粉病的防治方法主要是化学防治，既费时又费力，而且也不能完全抑制白粉病的发生，另外药剂施用过多不仅使白粉病菌产生抗药性，还会导致农药残留，对生态环境以及食品安全造成严重危害，威胁人类健康。

培育白粉病抗性新品种，是防治甜瓜白粉病最经济、最环保和最有效的措施。传统的抗病育种工作中，每一代都需要采用田间接种病原菌进行性状鉴定的方法，存在表型把控不准、遗传群体需求量大、费时费力、育种周期长、易受环境因素影响等缺陷，因此很难实现材料的遗传改良或是大规模商业化集成育种。随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)技术为育种工作提供了有利工具。该技术是利用与目标基因连锁的分子标记，通过DNA水平的检测即可完成对目标性状的选择，能够提高选择效率，减少工作量，从而加快育种进程。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，可由单个碱基的转换或颠换引起，也可由碱基(片段)的插入或缺失所致。针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的SNP分子标记技术。该技术针对控制目标性状的基因开发功能SNP标记，将性状与基因型相关联，进而实现高效、精准育种。现阶段，适用于SNP标记的检测手段主要包括凝胶电泳、荧光定量PCR和竞争性等位基因PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)。本发明所开发的标记适用于KASP方法检测SNP位点。该方法已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等研究领域，具有成本低、通量高、实验操作简单和安全等优势。

本发明所开发的分子标记可快速、准确地对甜瓜抗白粉病的品种或品系进行选育，从而有效减少工作量，提高工作效率，降低育种成本，加快育种进程，具有很高的实际应用价值。

发明内容

本发明提供了一种鉴定甜瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用。利用该分子标记可以在甜瓜苗期进行DNA水平上的鉴定，从而克服甜瓜传统育种中需要接种病原菌鉴定抗病性的缺点，大大简化甜瓜抗白粉病品种或品系的培育过程。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种与甜瓜抗白粉病性状相关的SNP分子标记CM_KA002188，其序列为：

AATCATGGTGGCCATTATTTCTCTAGTAGGACGAACAACCAAACAAAAAATATTGCAAAAGAGCATCAATGTGCATAAAGCTAAGGACTTATGGTTGATC[T/G]ATCTTCCAACTAAATTTCATTTCAATTGTGTTGACAGGCATGAAAAGCTAGATCATGAGCAATCGAGATACACGAGAGGTAGAACATAATTCTTGTATAC，其中第101nt位点处的碱基为T或G。本发明经群体实验证实，上述分子标记与甜瓜抗白粉病的性状紧密相关。所检测的2个亲本及其F2群体中，亲本材料wm-6在CM_KA002188测试位点处的碱基型为G:G，表现为抗病，亲本材料12D-1在该测试位点处的碱基型为T:T，表现为感病；193个F2群体单株中，有45个单株碱基型为G:G，有45个单株碱基型为T:T，均表现为纯合型；有103个单株碱基型为G:T，表明为杂合型。

本发明提供一种用于检测甜瓜抗白粉病的SNP分子标记的引物及含有该引物的试剂盒，含有上述引物组合的试剂和试剂盒也在本发明的保护范围之内。

表1标记引物序列表

为了实现本发明的目的，根据BSA重测序结果定位的候选区间位于甜瓜第12号染色体上。针对碱基的替换，对替换的序列末尾碱基设计SNP标记，位于第12号染色体第23930811位碱基处，该SNP分子标记多态性为T/G。

本发明所述的SNP分子标记可以通过两条特异性引物和一条通用引物检测得到，所述两条特异性引物序列和通用引物序列见表1。

本发明还提供所述的SNP分子标记在鉴定甜瓜抗白粉病性状中的应用。具体包括如下步骤：

(1)提取待测甜瓜基因组DNA；

(2)以甜瓜基因组DNA为模板，利用所述特异性引物组合进行KASP反应检测；

在两条特异性引物的5’-端分别连接FAM-tail：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’和VIC-tail:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’通用荧光标签序列；

(3)若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则待测甜瓜表现为抗白粉病，若只检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测甜瓜为不抗病材料，若同时检测到两种荧光信号则判断待测甜瓜为抗白粉病的杂合型。

步骤(2)中的KASP检测中PCR条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环。

选择检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号的甜瓜样本进行育种。

所述荧光序列可为本领域常规使用的荧光序列，优选两个荧光颜色差异大的荧光序列。在本发明中的一个具体实施方式中，选择使用FAM和VIC荧光序列分别连接在两条特异性引物的5’端。

优选地，所述步骤(2)中KASP检测中的PCR条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环。

本发明还提供了所述的特异性引物组合用于检测所述SNP分子标记的方法，该方法为：

利用所述特异性引物组合对待检测甜瓜的基因组DNA进行KASP检测，在引物Primer X和引物PrimerY的5’-端分别连接不同的通用荧光标签序列；若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则待测甜瓜为抗白粉病材料；若只检测到引物Primer X所连荧光序列的荧光信号，则判定待测甜瓜为不抗白粉病的材料；若同时检测到两种荧光信号，则判定甜瓜为携带抗白粉病性状的杂合型。

本发明还提供了包含所述的特异性引物组合的试剂盒。

本发明还提供了所述的试剂盒在甜瓜种质资源改良中的应用。

本发明还提供了所述的试剂盒在培育抗白粉病甜瓜中的应用。

上述应用的实质为该分子标记的检测方法。其中，PCR反应程序与体系可采用本领域常规技术，本发明对此不另作限定。

本发明提供了上述SNP分子标记在甜瓜育种中的检测方法。利用该分子标记及检测方法，可对甜瓜白粉病抗病性状进行鉴定及辅助选择育种，对加快甜瓜抗白粉病分子育种进程具有重要意义。

本发明应用KASP技术对所找到的SNP分子标记进行基因分型，可以快速、准确地检测甜瓜对白粉病的抗性，大幅提高遗传转育效率。并且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，便于操作，利于高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染以及EB对环境和人体的危害。

附图说明

图1为应用BSA-seq方法在甜瓜第12号染色体上定位抗白粉病QTL。其中，灰色横线代表定位区间。

图2为本发明与甜瓜抗白粉病性状连锁的SNP标记在群体中的基因分型测试图。其中，GG为抗病纯合基因型，TT为感病纯合基因型，GT为杂合基因型，NTC为无模板对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。实施例中使用的LGC SNPline基因分型平台及其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

实施例1与甜瓜抗白粉病性状连锁的SNP分子标记的开发

利用室内鉴定获得的抗白粉病的甜瓜自交系wm-6为母本，以易感白粉病的甜瓜自交系12D-1为父本，通过杂交、自交得到F2分离群体193个单株，对其进行室内人工接种鉴定。根据植株叶片白粉病病斑的多少，将植株发病等级分为0级(不发病)、1级、3级和5级。F2群体的193个单株的发病情况为：0级26株，1级32株，3级38株和5级97株。将F2群体发病等级为0级(未发病植株)的24个单株构建极端抗病基因池R-pool，发病等级为5级的24个单株构建感病基因池S-pool进行基因组的重测序，然后进行BSA测序定位分析，最终将抗白粉病QTL定位到第12号染色体20.9M-23.6M的区域内。在此目标区域附近根据亲本多态性SNP位点第23930811位碱基处序列进行引物设计。本发明设计的用于检测上述SNP分子标记的引物组合为：

(1)两条特异性引物：

Primer X：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGCTAAGGACTTATGGTTGATCT；

Primer Y：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGCTAAGGACTTATGGTTGATCG。

(2)一条通用引物

Primer C：

TCGTGTATCTCGATTGCTCATGAT

在两条特异性引物5’-端分别连接FAM-tail:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’和VIC-tail:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’通用荧光标签序列；对待测的甜瓜进行KASP反应检测。

实施例2开发的SNP分子标记的KASP反应的检测

1.针对本发明所述的分子标记设计特异性引物，利用KASP反应可高通量的对甜瓜抗白粉病性状进行检测，采用实施例1设计的引物组合进行试验。

2.采用简化CTAB法，从甜瓜叶片中提取基因组DNA，具体方法如下：

(1)取适量甜瓜叶片鲜样或冻样，放入2ml离心管中，加入钢珠，于组织研磨仪中磨碎；

(2)加入750μL CTAB溶液，震荡混匀，65℃温浴0.5-1h；

(3)冷却至室温，在通风橱中加入750μL氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀3-4次；

(4)12000rmp离心10min，取上清液500μL至新的1.5mL离心管中；

(5)加入等体积异丙醇溶液轻轻摇匀，于-20℃沉淀1小时以上后，12000rmp离心3min，弃掉上清液；

(6)加入1mL 70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min后，弃掉上清；

(7)加入300μL ddH2O，溶解备用。

3.KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分析平台上进行。在微孔反应板中加入1.0-1.5μL浓度为20ng/μL的DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

表2抗白粉病的SNP分子标记开发PCR扩增反应体系

实施例3：F2分离群体抗病性鉴定及分子标记与表型相关性分析

对本发明中的标记进行表型验证，具体步骤如下：

1.用悬浮孢子液(浓度1×104～1×106个/ml)在温度25℃白天/20℃夜晚，湿度80％环境下接种甜瓜幼苗叶片。以甜瓜幼苗第2片和第3片真叶为调查对象，根据叶片上病斑面积的大小，对每个单株发病情况进行统计。甜瓜白粉病发病等级的划分依据如下：

0级—未发病，高抗；

1级—病斑占叶片面积约30％；

3级—病斑占叶片面积约70％；

5级—病斑占叶片面积约100％。

2.根据调查的发病等级计算亲本的病情指数(DSI)。亲本及F2群体的发病情况见表3。以自主培育的抗白粉病甜瓜自交系wm-6(DSI＝8.0)为母本，以易感白粉病甜瓜自交系12D-1(DSI＝94.0)为父本进行杂交和自交，得到F2分离群体193个单株。F2群体的193个单株的发病情况为：0级26株，1级32株，3级38株和5级97株。

表3亲本及F2群体的发病情况鉴定

3.参照实施例2中的方法，检测供体抗病亲本wm-6与受体感病亲本12D-1杂交的F2分离群体单株抗感白粉病的表型，具体结果见表4。F2分离群体单株表型鉴定结果与基因分型结果高度对应，在F2群体中与抗病亲本wm-6的纯合基因型G:G一致的有14株0级，10株1级，10株3级，11株5级；与感病亲本12D-1纯合基因型T:T一致的有0株0级，5株1级，4株3级，36株5级；碱基型为G:T的杂合型植株共103株，其中有13株0级，17株1级，24株3级，49株5级。

4.对F2群体的基因型和表型相关性验证结果进行t-test分析，结果为p＝1.42×10-8(p<0.01)，表明CM_KA002188标记与甜瓜白粉病抗性紧密相关。

表4 CM_KA002188标记在F2分离群体中的检测结果

本发明涉及甜瓜抗白粉病材料的SNP分子标记，该标记位于甜瓜第12号染色体第23930811碱基处，该SNP分子标记多态性为T/G。本发明提供了用于检测该SNP位点的特异性引物组合和检测方法，所述特异性引物组合分别如表1所示。本发明的SNP分子标记可用于甜瓜抗白粉病的预测，也可用于筛选和鉴定自然遗传材料是否具有抗白粉病的性状。本发明提供的检测方法准确可靠且操作简便，适用于高通量商业化分子育种，同时为甜瓜抗白粉病品种的选育或改良提供科学依据。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 上海市农业科学院；上海科立特农科(集团)有限公司

<120> 一种鉴定甜瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用

<130> 2020-5-13

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatcatggtg gccattattt ctctagtagg acgaacaacc aaacaaaaaa tattgcaaaa 60

gagcatcaat gtgcataaag ctaaggactt atggttgatc tgatcttcca actaaatttc 120

atttcaattg tgttgacagg catgaaaagc tagatcatga gcaatcgaga tacacgagag 180

gtagaacata attcttgtat ac 202

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc taagctaagg acttatggtt gatct 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat taagctaagg acttatggtt gatcg 45

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgtgtatct cgattgctca tgat 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims

1.一种鉴定甜瓜抗白粉病性状的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于甜瓜第12号染色体第23930811碱基处；该位点碱基为G的甜瓜高抗白粉病，该位点碱基为T的甜瓜高感白粉病。

2.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的特异性引物组合，其特征在于，包括：

(1)两条特异性引物：

Primer X：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGCTAAGGACTTATGGTTGATCT-3’；

Primer Y：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGCTAAGGACTTATGGTTGATG-3’。

(2)一条通用引物

Primer C：

5’-TCGTGTATCTCGATTGCTCATGAT-3’。

3.含有权利要求2所述的特异性引物组合的试剂或是试剂盒。

4.权利要求2所述的特异性引物组合在检测甜瓜品种抗白粉病性状中的应用。

5.根据权利要求4所述的特异性引物组合在检测甜瓜品种抗白粉病性状中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测甜瓜基因组DNA；

(2)以甜瓜基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物组合进行KASP反应检测；

在两条特异性引物的5’-端分别连接FAM-tail：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’和VIC-tail：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’通用荧光标签序列；

(3)若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则表明待测甜瓜抗白粉病，若只检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测甜瓜不抗白粉病，若同时检测到两种荧光信号则判断待测甜瓜为抗白粉病的杂合型；选择检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号的甜瓜样本进行育种。

6.根据权利要求2所述的特异性引物组合在检测甜瓜品种抗白粉病性状中的应用，其特征在于，利用权利要求2所述的特异性引物组合对待检测甜瓜的基因组DNA进行KASP检测，在引物Primer X和Primer Y的5’-端分别连接不同的通用荧光标签序列；若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则待测甜瓜为抗白粉病材料，其基因型为GG；若只检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测甜瓜为不抗白粉病的材料，其基因型为TT；若同时检测到两种荧光信号则判断待测甜瓜为携带抗白粉病性状的杂合型，其基因型为GT。

7.根据权利要求5或6所述的特异性引物组合在检测甜瓜品种抗白粉病性状中的应用，其特征在于，步骤(2)中KASP检测中的PCR条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环。

8.含有权利要求2所述特异性引物组合的辅助鉴定甜瓜抗白粉病性状的试剂盒。

9.权利要求8所述的试剂盒在甜瓜种质资源改良中的应用。

10.权利要求8所述的试剂盒在培育抗白粉病甜瓜中的应用。