CN111423451B - 14-羟基双氢青蒿素与衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

14-羟基双氢青蒿素与衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及14‑羟基双氢青蒿素与衍生物及其制备方法和应用。14‑羟基双氢青蒿素及其衍生物通过Streptomyces griseus ATCC 13273生物催化获得。本发明所涉及的化合物14‑羟基双氢青蒿素是发明人利用生物转化方法首次在双氢青蒿素C14位引入活性羟基获得，这一羟基的引入为双氢青蒿素结构修饰提供了一个全新的活性位点。我们研究发现相对于双氢青蒿素（C14羟基未取代），14‑羟基双氢青蒿素水溶性提高。药效学研究表明14‑羟基双氢青蒿素及其衍生物具有良好的抗炎功效。

Description

14-羟基双氢青蒿素与衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新化合物14-羟基双氢青蒿素及其衍生物在制备抗炎药中的应用。
背景技术
炎症(inflammation)：是指机体对于物理、化学或生物等外来伤害刺激所产生的一种防御反应，主要表现为红、热、肿、痛甚至功能障碍等临床症状。炎症也是导致许多疾病发生发展的诱因，它与肿瘤、感染性疾、肺部疾病、风湿性关节炎(RA)、慢性支气管炎、炎症性肠病、动脉粥样硬化病、神经退行性疾病、等均存在联系。尽管目前市场上抗炎药物较多,但高效低毒的药物较少,临床迫切需要此类新药。从天然产物中寻找潜在的先导化合物并对其结构进行修饰获得衍生物，从而得到潜在的药物是药物开发的中药手段之一。
青蒿素是一种倍半萜内酯类化合物，是一种治疗疟疾的特效天然产物。近年来药学研究者围绕青蒿素进行了大量的结构改造及适应症研究。大部分研究均表明青蒿素类化合物发挥生物活性均与其结构中的过氧桥结构有关，由于过氧桥结构的不稳定性，目前对青蒿素的结构修饰非常有限，大部分集中在C11位、C12位。本课题组多年致力于青蒿素结构的修饰改造，前期成功在C9位引入羟基并在此基础上获得了一系列高活性的衍生物，已申请专利(专利号：201610294122.5)。
青蒿素类化合物中C-14位孤立惰性甲基C-H键的选择性羟化在有机化学反应中极为困难，因此在现有技术中未有在C-14做修饰的文献报道；Ponnapalli MG，Biotransformation of Artemisinin to14-Hydroxydeoxyartemisinin:C-14Hydroxylation by Aspergillus flavus.J Agric Food Chem.2018Oct 10；66(40):10490-10495.doi:10.1021/acs.jafc.8b03573.报道：其在青蒿素14位通过生物催化的方式增加了羟取代基，但如下反应可知其牺牲了青蒿素的过氧桥结构，由于青蒿素的过氧桥是其药理活性基团，该文献报道事实上是破坏了青蒿素主要结构，同时丧失或减弱了青蒿素的活性。
Figure BDA0002485888280000011
因此寻找青蒿素类化合物的14位羟基取代反应方法，同时保持过氧桥结构不受破坏成了本领域技术难题。
发明内容
本发明目的在于提供一种C14位羟基化修饰的双氢青蒿素及其衍生物，寻找新的具有生物活性成分，提供上述化合物在抗炎药物中的应用。本发明涉及式I所示的14-羟基双氢青蒿素，及式Ⅱ所示衍生物。
Figure BDA0002485888280000021
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，14-羟基双氢青蒿素可通过下面方法制备：
(1)微生物发酵制备：
将斜面保藏的Streptomyces griseus ATCC 13273菌种接种于种子液培养基中，在28℃、转速180r/min下培养48h，获得一级种子液；
将一级种子液以2～4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、转速180r/min，培养24h，再加入双氢青蒿素(丙酮助溶)，浓度为0.5-2.0g/L，继续在28℃、转速180r/min下培养48h，得到发酵液。
(2)提取分离：
用2倍体积的乙酸乙酯萃取上述发酵液，萃取三次，合并萃取液，经减压回收浓缩得到固体残渣，残渣经柱层析分离，得到14-羟基双氢青蒿素。
本发明的第二个方面，提供了14-羟基双氢青蒿素衍生物的制备方法，步骤如下：
(1)取14-羟基双氢青蒿素(1mmol)和邻氯肉桂酸(2.5mmol)加入至干燥三口圆底烧瓶中，然后加入10mL无水二氯甲烷溶解，再加入DMAP(2mmol)和EDCI(2.5mmol)，常温，搅拌反应3h，取样经TLC检测，反应结束后.
(2)加入稀盐酸调pH至7.0左右，振摇后静置分液，收集有机相，水相再用等体积的二氯甲烷萃取一次，合并有机相，再分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液等体积洗涤一次，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，有机相旋干，残渣经硅胶柱层析色谱分离得到目标化合物，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:1。本发明第三个方面，提供了上述14-羟基双氢青蒿素及其衍生物在制备抗炎药物中的应用，首先证明了14-羟基双氢青蒿素具有抗炎作用。体外实验结果表明14-羟基双氢青蒿素及其衍生物均能够抑制LPS诱导巨噬细胞RW264.7产生NO,抑制率为70％与阳性药氨基胍接近。进一步在体内药效学实验中发现，14-羟基双氢青蒿素及其衍生物均能明显抑制二甲苯致诱导的小鼠耳肿胀，对角叉菜胶致大鼠足肿胀具有明显抑制作用。
本发明包括药物组合物，该组合物含有式Ⅰ和通式Ⅱ所示的14-羟基双氢青蒿素及其衍生物或其药学上可接受的盐，或其对应异构体、非对应异构体或外消旋体作为活性成分，以及药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋形剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。本发明化合物及其衍生物可以与其他活性成分组合使用。只要它们不产生其他的不利作用。
有益效果
1、本发明所涉及的化合物14-羟基双氢青蒿素是发明人利用生物转化方法首次在双氢青蒿素C14位引入活性羟基获得，这一羟基的引入为双氢青蒿素结构修饰提供了一个全新的活性位点。具体来说：该方法采用生物催化方式，而非化学合成，其保持了青蒿素的过氧桥结构不受破坏，特异性修饰了C14的活性羟基。科研人员根据需求对其结构做进一步修饰，如酯化，氨基化等结构改造。我们研究发现相对于双氢青蒿素(C14羟基未取代)，14-羟基双氢青蒿素水溶性提高。药效学研究表明14-羟基双氢青蒿素(化合物I)具有良好的抗炎功效，对LPS诱导巨噬细胞NO释放具有明显抑制作用，对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显抑制作用，对角叉菜胶致大鼠足肿胀具有明显抑制作用，对木瓜蛋白酶诱导的骨关节滑膜炎具有明显抑制作用且效果优于双氢青蒿素。
2、本发明首次发现通过Streptomyces griseus(ATCC 13273)催化实现青蒿素14位羟基化，具有简单，快速，成本低，污染小等优点。
3、本发明举例说明通过14位改造可以获得一系列新的化合物，如同时我们还在C14位羟基化基础上做进一步改造，制备获得化合物II，即在化合物I的12位和14位进行肉桂酸修饰。化合物II(D59)相比于14-羟基双氢青蒿素(14-OH-DHA)具有更好的抗炎作用。
附图说明
图1为14-OH-DHA及其衍生物DC59对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NO释放的影响
图2为14-OH-DHA及其衍生物DC59对木瓜蛋白酶诱导的骨关节滑膜炎症影响，其中A为TNF-α，B为IL-β的相对含量测定。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1：14-羟基双氢青蒿素(14-OH-DHA，如结构式I)的制备
Figure BDA0002485888280000031
1.1、菌种斜面培养：
斜面PDA培养基(g/L)：土豆200，磷酸二氢钾3，葡萄糖20，无水硫酸镁0.73，维生素B10.01，琼脂粉20。新鲜土豆去皮后切成小块，加水煮沸20min，8层纱布过滤，滤液加入剩余组分并充分搅拌，冷却至室温后加水定容至1L，分装到锥形瓶中高压蒸汽灭菌，121℃，灭菌15min。趁热将液体培养基分装至试管和培养皿中，试管倾斜放置，培养皿水平放置，自然冷却后备用。
取低温保藏的StreptomycesgriseusATCC 13273菌种，采取稀释涂布法制备斜面PDA菌种：在无菌工作台中刮取5cm2斜面PDA菌苔，溶于5ml无菌水中，用移液枪吸取200uL至加入不同DHA浓度的空白PDA斜面培养基中，用涂布棒在斜面表明涂布均匀，28℃恒温培养7d后转移至4℃冰箱备用。
1.2、一级种子液制备：
一级种子液培养基(g/L)：玉米粉30、豆粕7.6、酵母粉5、葡萄糖1、磷酸氢二钾5、氯化钠5、尿素1，在250ml锥形瓶内装液50ml。
刮取2cm2 StreptomycesgriseusATCC 13273菌丝体接种于50mL种子液培养基，摇瓶规格250mL，28℃、180r/min培养42h，得到种子液。
1.3、双氢青蒿素生物转化：
转化发酵培养基(g/L)：玉米粉30、豆粕7.6、酵母粉5、葡萄糖1.5、磷酸氢二钾5、氯化钠5、尿素1、无水硫酸镁0.05、一水合硫酸锰0.05，0.3‰Tween 80，用稀盐酸调pH＝6.5，在250ml锥形瓶内装液50ml。吸取一级种子液，按2％的接种量转接至50mL转化发酵培养基，28℃、180r/min培养24h，后加入1mL双氢青蒿素的丙酮溶液(浓度40mg/mL)，相同条件继续培养48h。发酵结束后，加两倍量的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压回收乙酸乙酯，残渣加甲醇溶解定容供HPLC-ELSD检测鉴别。14-羟基双氢青蒿素的产率可达0.25g/L
1.4、14-羟基双氢青蒿素(14-OH-DHA)的制备
1)取发酵液，用两倍体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，旋干，得固体残渣。
2)取固体残渣，加甲醇溶解，以100-200目硅胶拌样。干法上样过硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯(v:v)1:1的洗脱剂，等度洗脱。分次收集洗脱液，点板检测，合并含产物的洗脱液，回收干，得到14-羟基双氢青蒿素粗品
3)取14-羟基双氢青蒿素粗品，加甲醇结晶，过滤，收集结晶母液。
4)取结晶母液，减压浓缩，经制备液相制备，色谱柱：Hedera ODS-2(5μm，20×250mm)，洗脱条件：水(A)-乙腈(B)；0-20min，25％B；20-25min，25％-30％B；25-30min，30％-60％B；30-38min，60％B；流速10mL/min；收集产物峰，减压回收，冷冻干燥得14-羟基双氢青蒿素，核磁数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO d-6))δ：6.21(1H,d,J＝3.4Hz,OH-12),5.43(1H,s,H-5),4.97(1H,m,H-12),4.35(1H,t,J＝5.0Hz,OH-14),3.43(1H,m,H-14),3.36(1H,m,H-14),2.33(1H,m,H-11),2.16(1H,m,H-3),1.98(1H,m,H-3),1.81(2H,m,H-2,H-8),1.71(1H,m,H-8),1.64(1H,m,H-9),1.40(2H,m,H-2,H-1),1.33(2H,m,H-7,H-10),1.27(3H,s,H-15),1.03(1H,dd,J＝24.2,11.7Hz,H-9),0.83(3H,d,J＝7.3Hz,H-13).
13C NMR(125MHz,DMSO d-6)δ：103.56(C-4),95.07(C-12),87.21(C-5),81.37(C-6),63.30(C-14),47.12(C-1),44.62(C-7),44.56(C-10),36.60(C-3),31.18(C-11),29.19(C-9),26.18(C-15),24.36(C-8),24.19(C-2),13.82(C-13).
实施例2：14-羟基双氢青蒿素衍生物DC59的合成
合成路线A描述了本发明的通式Ⅱ化合物的制备
Figure BDA0002485888280000041
合成路线A描述了本发明的通式Ⅱ化合物DC59的制备。取1mmol 14-羟基双氢青蒿素(14-OH-DHA)和邻氯肉桂酸(2.5mmol)加入至干燥三口圆底烧瓶中，然后加入10mL无水二氯甲烷溶解，再加入DMAP(2mmol)和EDCI(2.5mmol)，常温，搅拌反应3h，取样经TLC检测，反应结束后，加入稀盐酸调pH至7.0左右，振摇后静置分液，收集有机相，水相再用等体积的二氯甲烷萃取一次，合并有机相，再分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液等体积洗涤一次，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，有机相旋干，残渣经柱层析色谱分离得到目标化合物，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:1。收率：44％,反应催化剂可为DMAP/EDCI，DMAP/DCC，DMAP/DIC等
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝16.0Hz,1H),8.14(d,J＝16.0Hz,1H),7.66(ddd,J＝15.4,7.6,1.7Hz,2H),7.45(td,J＝7.6,1.3Hz,2H),7.33(m,4H),6.50(m,2H),5.94(dd,J＝19.0,9.9Hz,1H),5.56(d,J＝4.6Hz,1H),4.35(dd,J＝11.1,3.0Hz,1H),4.21(dd,J＝11.1,5.5Hz,1H),2.72(m,1H),2.45(m,1H),2.12(m,1H),1.95(m,3H),1.72(m,4H),1.52(dd,J＝13.5,3.2Hz,1H),1.48(s,3H),1.31(ddd,J＝17.3,14.0,3.9Hz,1H),0.95(d,J＝7.1Hz,3H).
13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.45,165.10,141.97,141.02,135.12,135.04,132.59,132.54,131.27,131.23,130.24,130.23,127.78,127.67,127.14,120.31,120.20,104.56,92.15,91.31,80.07,66.35,46.55,45.13,41.71,36.12,31.92,28.77,25.94,24.20,21.64,12.21.
实施例3：14-羟基双氢青蒿素及其衍生物DC59抑制LPS诱导巨噬细胞RW264.7产生NO活性
3.1实验方法：
取对数生长期小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞接种于96孔板(1×105个/mL，每孔200μL)。分别设定空白组、LPS模型组、14-OH-DHA给药组(1，10，30μM)、DC59给药组(1，10，30μM)、阳性药物地塞米松(10μM)组，每组6个复孔。给药组预处理4小时后，除空白组，每组加入1μg/mL的LPS。培养24h后吸取上清，按照试剂盒说明，在540nm测定吸光值，并计算抑制率。
3.2实验结果
14-OH-DHA及其衍生物DC59对炎症因子NO释放的影响。如图1所示，加入LPS后，小鼠RAW264.7细胞中的NO释放显著增加，说明造模成功。14-OH-DHA给药组、DC59给药组均可以显著抑制NO的释放，且具有剂量依赖特征。14-OH-DHA给药组在浓度为30μM时抑制率达到60.8％，DC59给药组在浓度为30μM时抑制率达到70.1％，与阳性给药组相近。以上体外实验证明，14-OH-DHA及其衍生物DC59对炎症因子释放具有显著抑制作用，可用于制备抗炎药物。
实施例4：14-羟基双氢青蒿素及DC59抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀
4.1实验方法：
将3-4周龄的ICR雄性小鼠64只，随机分为8组，每组8只，即空白组，阳性对照组(地塞米松5mg/kg)，14-羟基双氢青蒿素高、中、低剂量组(30\20\10mg/kg),DC59高、中、低剂量组(30\20\10mg/kg)。腹腔给药，连续给药7天，空白对照组给予等体积的生理盐水，末次给药30分后，在小鼠右耳正反面均匀涂抹二甲苯各20μL。1小时后，脱颈处死，立即沿着耳廓基线剪下双耳，用6mm打孔器在每只耳朵相同位置取材，立即称重记录。按照以下公式计算耳肿胀度。
公式一：肿胀度(mg)＝右耳片重-左耳片重；
公式二：肿胀抑制率(％)＝(对照组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度)/对照组平均耳肿胀度×100％
4.2实验结果
14-羟基双氢青蒿素可显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀，其中高剂量组(30mg/kg)对耳肿胀的抑制率达到72.65％，低剂量组(10mg/kg)对耳肿胀的抑制率为45.23％，地塞米松组抑制率74.76％。DC59给药能够显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀,相同给药浓度下抑制效果优于14-羟基双氢青蒿素，其中高剂量组(30mg/kg)对耳肿胀的抑制率达到80.6％。该实验表明14-羟基双氢青蒿素及D59具有明显的抗炎活性。
表1 14-羟基双氢青蒿素及DC59对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用
Figure BDA0002485888280000061
实施例5：14-羟基双氢青蒿素抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀
5.1实验方法
SD大鼠40只，雌雄各半，机分为5组(每组8只)：分别为:模型对照组，阳性药对照组(阿司匹林100mg/kg),14-羟基双氢青蒿素给药组(50、100、200mg/kg)。各组大鼠灌胃给药，模型组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续7天，末次给药后1小时候，在大鼠右后足跖皮下注射100μL浓度为1％角叉菜胶生理氯化钠溶液悬液。并分别在致炎前及致炎后1、2、3、4h测量大鼠右后足容积.
5.2实验结果
由表2可知，角叉菜胶致大鼠足肿胀模型中，模型组大鼠右后爪肿胀率明显增大，说明造模成功，14-羟基双氢青蒿可显著抑制大鼠足肿胀，致炎后4小时后低剂量组(100mg/kg)对足肿胀的最大抑制率为28.58％，高剂量组(200mg/kg)对足肿胀的最大抑制率达到47.62％，和阳性药阿司匹林组(100mg/kg，最大抑制率58.7％)的作用接近。该实验表明14-羟基双氢青蒿素具有明显的抗炎活性。
表2 14-羟基双氢青蒿素对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的抑制作用
Figure BDA0002485888280000062
实施例6：14-羟基双氢青蒿素及其衍生物DC59抑制木瓜蛋白酶诱导的骨关节滑膜炎
6.1实验方法
SD大鼠40只，雌雄各半，机分为5组(每组8只)：分别为:空白组、模型对照组、14-羟基双氢青蒿素给药组、DC59给药组、双氢青蒿素给药组。水合氯醛麻醉大鼠后，向大鼠双膝关节腔内注射0.2mL 4％的木瓜蛋白酶溶液，空白对照组给予等体积生理盐水。每3天注射一次，连续三次，造模2周后分别灌胃给予浓度为25mg/kg的双氢青蒿素、14-羟基双氢青蒿素、DC59，对照及模型组给予等体积溶剂，每天1次，连续给药1周。末次给药后1h处死大鼠，取血，室温静置后3000rpm，离心10min，取血清，按照ELISA试剂盒说明，测定血清中TNF-α及IL-1β含量。
6.2实验结果
如图2所示，给与木瓜蛋白酶后血清中TNF-α及IL-1β含量显著上升，说明造模成功。给予14-羟基双氢青蒿素及其衍生物DC59能够显著降低木瓜蛋白酶诱导关节滑膜炎大鼠血清中TNF-α及IL-1β含量，且效果优于双氢青蒿素。

Claims (5)

1.14-羟基双氢青蒿素及其衍生物，其特征在于所述14-羟基双氢青蒿素结构式为式I，其衍生物为式II；
Figure 936108DEST_PATH_IMAGE001
其中14-羟基双氢青蒿素通过Streptomyces griseus ATCC 13273生物催化获得。
2.根据权利要求1所述的14-羟基双氢青蒿素及其衍生物，其特征在于，所述的14-羟基双氢青蒿素通过Streptomyces griseus ATCC 13273进行生物催化获得化合物I，包括以下步骤：
（1）微生物发酵制备：
将斜面保藏的Streptomyces griseus ATCC 13273菌种接种于种子液培养基中，在28℃、转速180rpm下培养48h，获得一级种子液；
将一级种子液以2~4% v/v的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、转速180rpm，培养24h，再加入浓度为40~100mg/mL的双氢青蒿素-丙酮溶液，摇匀，继续在28℃、转速180rpm下培养48h，得到发酵液；
（2）提取分离
用2倍体积的乙酸乙酯萃取上述发酵液，萃取三次，合并萃取液，经减压回收浓缩得到固体残渣，残渣经柱层析分离，得到14-羟基双氢青蒿素，其结构式为式I。
3.根据权利要求1所述的14-羟基双氢青蒿素及其衍生物在制备抗炎药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述14-羟基双氢青蒿素的剂型为口服给药剂型或非口服给药剂型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的口服给药剂型为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂或糖浆剂；所述的非口服给药剂型是注射剂。
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