CN111419841B - 一种抗白色念珠菌组合药物 - Google Patents

Abstract

一种抗白色念珠菌组合药物，属于抗真菌药物领域，包括双氢青蒿素和氟康唑。经过现有技术的研究，双氢青蒿素作为非抗真菌药物，其在单独使用时几乎没有抗真菌作用，但是本发明在研究中发现将双氢青蒿素与氟康唑联合应用，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，产生协同的抗真菌作用，并通过诱导胞内活性氧的产生而逆转白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为抗真菌新药的开发及传统中药的老药新用提供了方向。

Description

一种抗白色念珠菌组合药物

技术领域

本发明属于抗真菌药物领域，具体地说是一种抗白色念珠菌组合药物，再具体的说是双氢青蒿素和氟康唑联用的抗真菌作用。

背景技术

近些年，随着肿瘤患者、自身免疫性疾病患者的不断增多、激素的广泛应用，真菌感染的发病率逐年升高。在真菌感染中，由念珠菌引起的感染比较常见。念珠菌是条件致病菌，白色念珠菌(C.albicans,CA)是临床分离率最高的念珠菌属，且其耐药性不断增加，由CA引起的深部组织感染死亡率高，给临床抗真菌治疗带来了挑战。G20杭州峰会公报中已提到抗菌药物的耐药性严重威胁公共健康、经济增长和全球经济稳定。

氟康唑(fluconazole,FLC)由于对CA有效，且价格相对便宜、毒副作用小，临床应用非常广泛。但随着FLC临床应用的增多，CA对FLC的耐药性不断增加。临床现有抗真菌药物品种有限。尽管现有的多烯类药物(如两性霉素B)和棘白菌素类药物(如卡波芬净)对唑类耐药的CA有效，但它们昂贵的价格和较大的毒副作用限制了它们的临床应用，这给临床成功治疗高耐药的CA感染带来了挑战。应对真菌耐药性的策略可以概括为两种，一种是通过合理使用现有的抗菌药物从而避免真菌耐药性的产生，另一种为加强研发新的抗真菌制剂。开发一个具有抗真菌作用的全新化学结构的新药耗时耗资巨大，而真菌耐药性的增长速度却是日益增大，新药上市的速度远远赶不上真菌耐药性增长的速度。

我国具有丰富的中药资源，中药副作用小，价格低廉，与现有抗真菌药物不易产生交叉耐药。若能从这些中药中寻找到对FLC抗耐药CA起增敏作用的单体成分，进而构建协同抗CA作用的复方药物制剂或联合用药，这将是克服耐药性的另一有效途径，对于加速中药新药开发、挖掘中药成分新的药用价值、开发新靶点的抗感染药物有一定的理论意义。双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是单环倍半萜类较重要的代表物，其抗疟药效高于青蒿素10倍，是高效、速效、低毒的抗疟药，此外还有抗结核、抗肿瘤等广泛的生物学作用。近期屠呦呦团队公布了DHA在治疗红斑狼疮的研究上取得了重大进展，已完成临床前研究。这说明DHA在扩大适应症方面有很大希望。有关DHA的研究主要集中在DHA治疗疟原虫感染的疗效、DHA抗肿瘤作用与机制等相关研究。经检索国内外文献，尚未检索到DHA与FLC联用抗CA的作用研究和机制研究报道。

发明内容

本发明提供一种抗白色念珠菌组合药物，用以解决现有技术中的缺陷。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种抗白色念珠菌组合药物，包括双氢青蒿素和氟康唑。

如上所述的一种抗白色念珠菌组合药物，所述的双氢青蒿素和氟康唑能够抑制具有氟康唑耐药性的白色念珠菌的生长。

如上所述的一种抗白色念珠菌组合药物，所述的双氢青蒿素和氟康唑的重量比为1：0.0625-2。

如上所述的一种抗白色念珠菌组合药物，所述的双氢青蒿素和氟康唑的重量比为1:0.125-0.5。

如上所述的一种抗白色念珠菌组合药物，所述的双氢青蒿素和氟康唑联合使用时，所述的氟康唑的浓度为1至8μg/ml，所述的双氢青蒿素的浓度为4至16μg/ml。

本发明的优点是：经过现有技术的研究，双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)作为非抗真菌药物，其在单独使用时几乎没有抗真菌作用，但是本发明在研究中发现将双氢青蒿素与氟康唑联合应用，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，产生协同的抗真菌作用，并通过诱导胞内活性氧的产生而逆转白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为抗真菌新药的开发及传统中药的老药新用提供了方向。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的实施例1得出的双氢青蒿素和氟康唑联用抗白色念珠菌CA5(氟康唑耐药菌株)作用的三维效果图，其中X轴表述氟康唑浓度；Y轴表示双氢青蒿素浓度；Z轴表示各种浓度组合下的真菌生长百分数差值(ΔE值)；

图2是本发明的实施例2得出的双氢青蒿素(DHA)和氟康唑(FLC)联用对白色念珠菌CA5(氟康唑耐药菌株)的时间-杀菌曲线，其中使用的FLC浓度为2mg/L，DHA的浓度为1mg/L，并且使用不加药组作为生长对照；

图3是本发明的实施例2得出的双氢青蒿素(DHA)和氟康唑(FLC)联用对白色念珠菌CA6(氟康唑耐药菌株)的时间-杀菌曲线，其中使用的FLC浓度为2mg/L，DHA的浓度为1mg/L，并且使用不加药组作为生长对照；

图4是本发明的实施例3得出的双氢青蒿素(DHA)和氟康唑(FLC)分别单用以及联用对白色念珠菌CA5(氟康唑耐药菌株)胞内活性氧水平的影响，其中使用的FLC浓度为16mg/L，DHA的浓度为64mg/L，并且使用不加药组作为生长对照(以CTR表示)，横坐标FL2-H表示流式细胞仪FL2通道检测得到的荧光强度值，纵坐标Count表示细胞计数值；

图5是本发明是氟康唑和双氢青蒿素对白色念珠菌CA5(氟康唑耐药菌株)静态作用24h后CA5生长情况示意图；

图6是本发明是氟康唑和双氢青蒿素对白色念珠菌CA5(氟康唑耐药菌株)动态作用24h后CA5生长情况示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：双氢青蒿素与氟康唑联合抗白色念珠菌静态作用测定

1.材料

1.1实验菌株

质控标准菌株：近平滑念珠菌(Candida parapsilosis,CP)标准菌株CP(以保藏号ATCC22019获自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))。

实验菌株：临床分离的白色念珠菌，实验所用白色念珠菌均为山东省肿瘤医院检验科临床患者送检的样本，经科玛嘉显色鉴别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养并保存，得到的白色念珠菌菌株分别编号为CA1、CA2、CA5、CA6与CA7，并且根据药敏试验结果，其中的CA5、CA6和CA7为对氟康唑耐药的白色念珠菌，而CA1与CA2为对氟康唑敏感的白色念珠菌。

1.2药品与试剂

氟康唑(FLC)，中国食品药品检定研究院。

双氢青蒿素(DHA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

PBS(磷酸盐缓冲液)粉末，北京索莱宝科技有限公司。

PBS溶液：按说明称取PBS粉末24g，溶于2L纯水中得到pH 7.2的PBS缓冲溶液，然后在121℃高压(103.4kpa)湿热灭菌20min，冷却分装备用。

二甲亚砜(DMSO)，美国VWR公司。

3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)粉末，北京索莱宝科技有限公司。

酵母膏，美国Oxoid公司。

蛋白胨，山东增峰生物科技有限公司。

葡萄糖，美国Sigma公司。

琼脂粉，山东增峰生物科技有限公司。

甲萘醌，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

RPMI 1640粉末，美国GIBCO公司。

XTT粉末，山东增峰生物科技有限公司。

RPMI 1640液体培养基：分别称取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末4.16g、葡萄糖8g、MOPS粉末13.812g，加纯水至接近400ml，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0，用0.22μm微孔滤膜(山东增峰生物科技有限公司)过滤灭菌，4℃冰箱保存备用。

酵母膏-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂培养基：分别称取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g、琼脂粉20g，用1000ml纯水溶解，充分搅拌均匀后在121℃下灭菌20min，冷却后放至4℃冰箱保存备用；

XTT-甲萘醌溶液：分别称取XTT粉末0.050g和甲萘醌粉末0.172g，分别溶解于100ml已灭菌的乳酸林格氏液和10mL丙酮中，然后取10μL甲萘醌溶液与XTT溶液混合，用0.22μm微孔滤膜滤过灭菌，分装到EP管中，-20℃冰箱避光保存。

1.3仪器

2.内容与方法

2.1实验菌液与实验药液的配制

2.1.1菌液的配制

受试菌株在YPD培养基上转种2次，挑取单个较大菌落用PBS缓冲液配成菌悬液，以中国细菌标准浊度管(山东增峰生物科技有限公司)比浊，调整浓度约为5×10⁶CFU/mL，在显微镜(日本OLYMPUS公司)下用血球计数板(山东增峰生物科技有限公司)验证该菌液浓度，然后以RPMI 1640液体培养基将其稀释使96孔平板内工作菌液浓度为2.5×10³CFU/mL。

2.1.2药液的配制

作为药物母液，FLC以灭菌蒸馏水配成2560μg/ml，DHA以DMSO配成102400μg/ml。将各药物母液用RPMI1640液体培养基进行稀释以达到系列工作浓度。

2.2联合药敏测定试验

根据美国临床实验室标准委员会(NCCLS)颁布的抗真菌药敏试验M27-A3方案，采用微量稀释法测定双氢青蒿素与氟康唑联用时的最低抑菌浓度(MIC)值(以抑制80％以上真菌生长的最低药物浓度为MIC值)。各菌株工作菌液浓度为2.5×10³CFU/mL，对于敏感菌，FLC的浓度范围是0.004-2μg/mL，DHA的浓度范围是0.063-4μg/mL；对于耐药菌，FLC的浓度范围是0.125-64μg/mL，DHA的浓度范围是0.25-16μg/mL。H1孔为生长对照孔，第12列作为空白对照列，不足200μl的孔以RPMI1640液体培养基补齐。在35℃恒温培养24h后，加入XTT-甲萘醌溶液避光培养2h，用酶标仪在492nm处测光密度(OD)值。得到OD值后，按以下公式计算真菌生长百分数：真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值×100％。所有实验重复三次。

2.3评价方法与结果判定

Loewe additivity(LA)理论被广泛用于评价联合药物的相互作用，其基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，进而将各药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。基于该理论，分数抑菌浓度指数(fractional inhibitoryconcentration index，FICI)法为广泛采用的评价方法，其计算公式如下：FICI＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B，C_A与C_B分别是药物A与B联合使用时达到相同药效时各自对应的最小抑菌浓度，MIC_A与MIC_B分别是药物A与B单用时的最小抑菌浓度。联合作用效果评价标准为Odds等人在论文“Synergy,antagonism,and what the chequerboard puts between them，J AntimicrobChemother,2003,52(1):1”中提出的评价标准：FICI≤0.5为协同作用，FICI>4为拮抗作用，在0.5与4之间为相加或无关。

3.结果

药物作用24h的评价结果总结如表1所示。

表1 氟康唑与双氢青蒿素单用及联用24h的抗菌作用评价

从表1可以看出，双氢青蒿素(DHA)单用对白色念珠菌几乎没有抗真菌作用(MIC>512μg/ml)，而双氢青蒿素和氟康唑联合使用抗耐药白色念珠菌时，所述双氢青蒿素的MIC降为1-8μg/ml，并且氟康唑的MIC降为1-2μg/ml，FICI值远小于0.5，二者联用呈现出显著的协同作用。

因为联合用药的浓度为一系列不同的配比，为更直观地表现DHA和FLC联用对耐药白色念珠菌的作用程度，以DHA和FLC联用针对CA5为例，将联合药敏所测数据用基于Blicsindependence(BI)理论的ΔE(真菌生长百分数差值)模型分析。E为真菌生长百分数，ΔE＝E_理论-E_实际，其中E_理论为药物A与B联用时在无相互作用的假设下理论上的真菌生长百分数，等于药物A和B单独使用时测得的真菌生长百分数的乘积；E_实际为药物联用时测得的实际生长百分数。每一组药物联用组合均可以得到相应的一个ΔE值，然后用Matlab数据分析软件作图，以联合使用的两种药物的浓度分别为X轴和Y轴，ΔE值为Z轴，生成一个三维图像，0平面上方的峰表示协同作用。

DHA与FLC联合对CA5作用24h时，各联用药物组对应的ΔE值形成的三维图像如图1所示。由图1可以看出DHA与FLC联用对高耐药的CA5呈现出较强的协同作用，图中峰高越大，协同作用效果越好，图中各峰的累计高度值较大，协同作用较强。结合图1和表1数据，在DHA和FLC联用抗CA有效的浓度范围内，DHA与FLC的重量比为1:0.0625-2时，两药可展现出较强的协同作用；DHA与FLC的重量比优选为1:0.125-0.5时，两药联合抗菌作用最强。

4.结论

针对临床上抗真菌药物品种有限、价格贵、副作用大且不断出现耐药的现状，本发明发现通过与DHA配伍来增加耐药白色念珠菌对FLC的敏感性是一种较好的选择。DHA和FLC联用对耐药的白色念珠菌呈现出强大的协同作用，而且要达到此协同作用所优化的各药物浓度在体内可以达到，DHA和FLC联合治疗白色念珠菌感染在临床有较好的前景。

实施例2：双氢青蒿素与氟康唑联合抗白色念珠菌动态作用测定

1.材料

1.1菌株

实验所用菌株为临床分离的对氟康唑耐药的白色念珠菌CA5和CA6，经科玛嘉酵母菌鉴别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养。

1.2药品与试剂

DHA和FLC的原料药；二甲基亚砜DMSO；PBS缓冲液；0.1mol/L NaOH溶液；RPMI1640；XTT-甲萘醌溶液；酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂培养基均与上述实施例1相同。

1.3仪器

恒温培养箱、高温高压灭菌器、超净工作台(均与上述实施例1相同)；恒温振荡器(德国IKA公司)。

2.内容与方法

本实验建立了药物单用与药物联用作用体系，在35℃振荡培养24h。采用XTT法分别在0h、6h、12h、18h和24h从各个作用体系中吸取100μl样品，测定药物的动态抗菌活性大小。本实验采用的各药物浓度在体内均可达到。

2.1体系的建立

2.1.1实验菌液与实验药液的制备

取在YPD培养基上传代两次的CA5和CA6，挑取单个较大菌落，以PBS缓冲液制成菌悬液，采用中国浊度标准进行比浊，初浓度为5×10⁶CFU/mL，用血球计数板(与上述实施例1相同)在显微镜(与上述实施例1相同)下计数验证该菌液浓度，并用RPMI 1640液体培养基适当稀释使工作菌液浓度达到2.5×10³CFU/mL。

取与实施例1同法配制的药物母液，以RPMI 1640进行稀释，参照药物在人体内的可获得浓度以及实施例1中的静态药敏实验结果，配制工作药液，使药物在时间-杀菌曲线工作体系内的浓度分别为：FLC为2μg/mL，DHA为1μg/mL。

2.1.2体系的制备与培养

实验建立4个作用体系：①生长对照组(只加菌液，不加药液)；②DHA单用组；③FLC单用组；④FLC+DHA联用组。各体系均为5mL，每组加入0.5mL菌液，0.5mL各浓度的药液，不足5mL的用RPMI 1640液体培养基补齐。将制备完毕的体系于35℃振荡培养24h。

2.2药物联用时的动态抗菌活性测定

分别在体系建立后的0h、6h、12h、18h和24h从各作用体系中吸取100μl菌液置于一个新的96孔板中，然后加入100μl XTT-甲萘醌溶液，在35℃下避光培养2h。之后，用酶标仪在492nm处测定各孔OD值。实验重复3次取平均值。

3.结果

根据不同时间点的测定结果，分别绘制FLC与DHA联用抗CA5和CA6的时间-杀菌曲线，如图2和图3所示。从图2-3可以看出，DHA单用微弱地抑制了CA5和CA6的生长；FLC对CA5和CA6呈现出一定的抑菌作用，当其作用18h后抑菌效果明显减弱；在DHA和FLC联合作用18h后，药物联用组的时间-杀菌曲线与FLC单用组的时间-杀菌曲线显著分离，在24h时所述药物联用组的协同作用最强，较强地抑制了CA5和CA6的生长。

4.结论

图2-3所示的时间-杀菌曲线法可提供药物单用或联用时对受试菌株影响的动态作用结果，可反映药物的抗菌活性程度与速度、以及抗菌药物联用时的药效关系。由于可提供的信息丰富，时间-杀菌曲线法被广泛用于评价抗菌药物单用及联用时的抗菌效果。动态抗菌实验结果表明DHA和FLC联用对白色念珠菌CA5和CA6呈现出协同作用，这与静态实验结果是一致的，而且DHA和FLC的浓度在体内可以达到。

实施例3：双氢青蒿素与氟康唑联合抗白色念珠菌的作用机制研究

1.材料

1.1实验菌株

临床分离的白色念珠菌CA5,从-20℃冰箱解冻后，置YPD固体培养基上至少传代培养3次复苏后再使用。

1.2药品与试剂

DHA和FLC的原料药，配制方法与上述实施例1相同；

2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)母液：称取0.040g DCFH-DA(山东增峰生物科技有限公司)溶于5mL DMSO中，配成8mg/mL的浓度，用0.22μm的微孔滤膜(与上述实施例1相同)过滤除菌，避光-20℃保存；

YPD液体培养基：分别称取4g酵母膏、8g蛋白胨以及8g葡萄糖，加入适量蒸馏水搅拌使其逐渐溶解，然后加入蒸馏水至400ml，充分搅拌均匀，最后在121℃下高压灭菌20min，待温度降至室温后放至4℃冰箱保存；

YPD固体培养基和PBS缓冲液的配制方法与上述实施例1相同。

1.3仪器

流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)、离心机(美国Thermo Fisher公司)，高压灭菌器(与上述实施例1相同)等。

2.内容与方法

2.1体系的建立

2.1.1实验菌液与实验药液的制备

取于YPD培养基上传代两次的CA5，挑取处于对数生长期的单克隆CA5菌落，以PBS缓冲液制成菌悬液，采用中国浊度标准进行比浊，初浓度约为5×10⁶CFU/mL，用血球计数板(与上述实施例1相同)在显微镜(与上述实施例1相同)下计数验证该菌液浓度，并用YPD液体培养基适当稀释使工作菌液浓度达到1×10⁶CFU/mL。

取与实施例1同法配制的药物母液，以YPD液体培养基进行稀释，配制工作药液，使药物在体系内的终浓度分别为：FLC为16μg/mL，DHA为64μg/mL。

2.1.2体系的制备与培养

实验建立4个作用体系：①生长对照组(只加菌液，不加药液)；②DHA单用组；③FLC单用组；④FLC+DHA联用组。各体系均为5mL，每组加入1mL菌液，0.5mL各浓度的药液，然后用YPD液体培养基补齐5mL。将制备完毕的体系于30℃避光培养6h。

2.2各体系细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的测定

上述培养结束后，在3000rpm下离心10分钟，弃去上清，收集菌细胞，用PBS洗涤3次后，用YPD液体培养基混悬，加入DCFH-DA，使其终浓度为40μg/mL，然后在30℃避光培养30分钟，最后用PBS洗涤3次，以流式细胞仪在FL2通道(发射波长为470-490nm)检测各组真菌细胞内ROS的水平(激发波长为488nm)。实验重复3次。

3.结果

经过不同药物处理后，各体系真菌细胞内ROS的变化趋势如图4所示。与对照组相比，DHA单用组真菌细胞内ROS水平未发生明显变化，处于较低水平；FLC可明显增加CA5细胞内ROS的水平，几何平均荧光强度值约是对照组的20倍；DHA与FLC联用后，胞内ROS水平较FLC单用组和DHA单用组显著增加，几何平均荧光强度值约是FLC单用组的2倍、约是DHA单用组的37倍。

4.结论

与ROS相关的机制研究是近些年生命科学的一个研究热点，ROS与白色念珠菌的氧化应激机制密切相关。本例结果表明DHA和FLC联用诱导念珠菌胞内产生了更多ROS，进而这些ROS通过自身较强的氧化作用对细胞内的DNA、脂质和蛋白质造成严重损害，从而逆转了白色念珠菌对FLC的耐药性，这也说明了白色念珠菌的耐药机制与氧化应激机制很有可能存在关联，这为逆转真菌耐药性、寻找新的抗真菌药物靶点提供了研究思路。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种抗白色念珠菌组合药物，其特征在于：包括双氢青蒿素和氟康唑，所述的双氢青蒿素和氟康唑的重量比为1：0.0625-2。

2.根据权利要求1所述的一种抗白色念珠菌组合药物，其特征在于：所述的双氢青蒿素和氟康唑能够抑制具有氟康唑耐药性的白色念珠菌的生长。

3.根据权利要求1所述的一种抗白色念珠菌组合药物，其特征在于：所述的双氢青蒿素和氟康唑的重量比为1:0.125-0.5。

4.根据权利要求1所述的一种抗白色念珠菌组合药物，其特征在于：所述的双氢青蒿素和氟康唑联合使用时，所述的氟康唑的浓度为1至8μg/ml，所述的双氢青蒿素的浓度为4至16μg/ml。

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