CN111394479A - 一种用于细毛羊辅助选育的分子标记及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于细毛羊辅助选育的分子标记及应用方法，所述分子标记为STR标记，核心序列为(CA)n重复，重复数n在5～24之间。用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物，对绵羊个体进行基因组DNA的PCR扩增，PCR产物测序，即可获得(CA)n重复数。当测序结果中(CA)n重复数n为17或者18时，绵羊为细毛羊品种，当n为23或者24时为非细毛羊品种；当CA重复为不连续重复时，即CA重复被两个碱基TA或GA分成两段，数量为12+11或者13+11时，为细毛羊与非细毛羊杂交品种。本发明的技术优势在于可以实现对细毛羊品种的鉴定和个体的早期辅助选择，亦可用于细毛羊杂交品种培育的辅助分子标记，可以从大量群体或细毛羊杂交后代中高效精准选择细毛羊个体，提高育种效率。

Description

一种用于细毛羊辅助选育的分子标记及应用方法
技术领域
本发明涉及家畜分子标记辅助选育技术领域，具体涉及一种细毛羊毛用性状功能基因即角蛋白联合蛋白8(Keratin associated protein 8,KAP8)基因关联STR的筛选与应用方法。
背景技术
羊毛属于天然纤维材料，在畜牧养殖和纺织产业中占据重要地位并在很大程度上影响了绵羊的育种方向。一直以来，细毛羊育种主要依靠表型和后裔测定，选择强度和育种进展缓慢。随着生物技术的发展以及开展的羊毛基因组学和蛋白组学方面的大量研究，世界上已对多个绵羊品种进行了羊毛成分和编码基因以及表达调控方面的分析，结合对其他动物毛发结构成分的研究成果，已在在羊毛的成分与结构、基因结构和发育调控过程方面取得了大量进展，为细毛羊的分子选育提供了基础和可能。
在结构上，羊毛由外向内一般分为毛表皮(即磷片层)、毛皮质(即角质层)和髓质层，细羊毛一般无髓质层。尽管大多数羊毛有三层结构，但是构成羊毛纤维实体成分的主要是角质层，占洁净羊毛纤维重量的90％甚至98％以上。进一步微观分析表明，角质层的细胞又可分为正皮质、副皮质和中间皮质三种类型，均由角蛋白组成。按照羊毛蛋白的结构和成分，构成羊毛纤维骨架结构的为α-螺旋形的角蛋白中间丝蛋白(IFPs)，作为基质填充成分的是角蛋白联合蛋白(KAPs)，前者占羊毛蛋白总量的50％以上且含量稳定，后者则通过二硫键将前者横向联结成微丝束，两种蛋白形成交叉链接，最终形成羊毛纤维。在细度和弯曲不同的羊毛成分差异中，发现角蛋白联合蛋白家族中的高甘氨酸-酪氨酸蛋白(HGTP)是主要差异蛋白之一。高甘氨酸-酪氨酸蛋白家族主要包括KAP6、KAP7和KAP8三个成员，其基因表达水平直接影响了羊毛的细度和弯曲，是研究羊毛生长发育和细毛羊分子育种的重要靶基因，其中KAP8被认定是绒山羊羊绒发育的主要调控基因。因此，筛选与KAP6、KAP7和KAP8基因尤其是KAP8相关的调控序列或直接关联的标记成为细毛羊分子辅助育种的重要研究方向。
微卫星位点(Microsatellite locus)又称为短串联序列重复(short tandemrepeats,STRs)或简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)，其基本构成单位为2～6bp，常见的多为2～4个核苷酸重复序列，广泛分布于真核基因组中且多位于编码区附近。STR标记由于具有种间保守性高、等显性遗传、多态性高以及等位基因符合孟德尔遗传定律等诸多优点，广泛用于动物基因作图、优良性状的连锁分析等方面的研究，已有多个STR位点用于家畜优良性状的辅助育种，大大提高了育种效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细毛羊辅助选育的分子标记及应用方法，以便用于细毛羊个体的早期筛选和分子辅助育种。
本发明首先提供一种用于细毛羊辅助选育的STR分子标记，所述的STR标记为绵羊KAP8基因上游区的CA碱基重复，其重复数在细毛羊与其他品种绵羊之间存在不同，具有明显的物种特异性；
本发明所述的STR标记，其CA碱基重复的重复数在5～24之间；且所述STR标记位于绵羊KAP8基因上游区，最后一个CA重复距离KAP8转录起始点458bp；
本发明所提供的STR标记作为细毛羊选育的DNA分子标记来应用，可以用于细毛羊的品种鉴定，也可用于非细毛羊品种的鉴定以及两个品种的杂交后代的鉴定；
本发明再一个方面提供用于检测上述STR标记的引物对；
其中引物对的一种具体序列信息如下：
5′-ATTTGTTACATAATCTGGTT-3′(SEQ ID NO.1)
5′-CCTGGGTCTTATAAAGTCCT-3′(SEQ ID NO.2)
本发明还提供一种用于细毛羊选育方法，是通过扩增引物检测上述的STR分子标记进行选育的，当PCR扩增产物DNA分子中(CA)n重复数n为17或者18时，待测绵羊为细毛羊品种，当n为23或者24时为非细毛羊品种；当CA重复序列数5≤n≤24且为不连续重复时为细毛羊品种与非细毛羊品种杂交后代。
所述的方法，其一种具体的步骤如下：
1)从待测样品中获得基因组DNA；
2)将步骤1)所得的DNA利用检测STR标记的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增；
3)利用步骤2)所得的PCR扩增产物进行DNA测序，当PCR扩增产物DNA分子中(CA)n重复数n为17或者18时，待测绵羊为细毛羊品种，当n为23或者24时为非细毛羊品种；当CA重复序列数5≤n≤24且为不连续重复时为细毛羊品种与非细毛羊品种杂交后代。
其中步骤2)的PCR扩增体系如下：
总体积设定为20μL，包括：2.0μL的Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl2)，各0.1μL～3μL的特异性引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，浓度均为20μM)，0.2μL～4μL的dNTP mix(浓度2.5mM)，1.0μL～5μL基因组DNA(约40ng DNA)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2～1μL，加ddH2O至20μL；
PCR反应程序为：
95℃变性5min；95℃变性30s，47℃～55℃退火30s～40s，72℃延伸30s～40s为一个循环，共计28～35个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃保存备用。
作为本发明一种用于细毛羊选育的分子标记及应用方法进一步改进：
PCR扩增体系为：
总体积20μL，其中Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl2)2.0μL，特异性引物对(SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示，浓度均为20μM)，各1.0μL，dNTP mix(2.5μM)1.2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2μL(约含40ng DNA)，补水至20.0μL；
PCR反应程序为：
95℃变性5min；95℃变性30s，52.5℃退火30s，72℃延伸35s为一个循环，共计30个循环；然后72℃延伸5min；结束后降温至4℃。
作为本发明一种用于细毛羊选育的分子标记及应用方法的另一种改进：
所述步骤2)中设置阴性对照，以不含任何来源DNA的双蒸水反应体系为阴性对照。
本发明筛选获得了和羊毛发育直接相关KAP8基因的关联STR位点，且位于基因编码区上游，通过其物种特异性差异的关联性，可用于细毛羊品种的鉴定和杂交育种辅助选择，实现品种鉴定和早期选育，从而降低选育成本加速育种进程。本发明的操作方法简单，精准度高，易于实现，成本低，比后裔测定大大缩短了测定时间。
附图说明
图1为实施例2绵羊KAP8基因表达的相对定量标准曲线图，
图2为实施例2内参基因GAPDH引物扩增的熔点曲线(Tm＝84℃)图，
图3为实施例2绵羊KAP8基因引物扩增的熔点曲线(Tm＝87℃)图，
图4为实施例3绵羊KAP8基因的结构示意图，
图5为实施例5中KAP8 Gf1-KAP8 Gr引物对扩增产物图，图中M代表分子量标准，泳道1-3分别为中国美利奴细毛羊、萨福克羊和山羊。
图6为实施例5中国美利奴细毛羊(CA)17测序结果图，
图7为实施例5萨福克羊(CA)24测序结果图，
图8为实施例5中国美利奴细毛羊×湖羊杂交肉用多胎品系(CA)13+11测序结果图。
具体实施方式
本发明所包含的内容如下：
(1)收集细毛羊和对照样品，细毛羊以中国美利奴细毛羊(军垦型)为代表，对照品种的绵羊选用湖羊和萨福克羊以及中国美利奴细毛羊杂交后代，同时还有山羊品种。分别取耳组织和左肩部皮肤为待测样品，提取基因组DNA和总RNA，用于DNA和RNA分析。
(2)对比分析绵羊角蛋白联合蛋白基因8(Keratin associated protein 8,KAP8)在中国美利奴细毛羊和萨福克羊皮肤毛囊组织中基因表达差异，以了解KAP8基因表达在两个品种的差异。
(3)为阐明绵羊KAP8基因结构，用5′-RACE和3′-RACE技术对中国美利奴细毛羊进行了全长cDNA克隆分析。
(4)为阐明中国美利奴细毛羊和萨福克羊以及其他品种KAP8基因上游调控序列差异，分析了多个品种绵羊及杂交后代KAP8基因上游约2500bp序列并分析了基因多态性差异，发现了本发明中的STR标记。
下面结合实例对本发明的方法过程做进一步说明，但实例仅限于说明，并不仅限于实例中的操作。下列实施过程中具体条件和尚未注明的实验方法，通常可按常规条件进行，如《分子克隆实验指南》中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和掌握本发明。但本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例1：绵羊样品材料的收集和处理
用于本发明的绵羊样品包括中国美利奴细毛羊、萨福克羊、湖羊、中国美利奴细毛羊杂交肉用品系、中国美利奴细毛羊×湖羊杂交肉用多胎品系，每种羊采集30份耳组织皮肤样品，低温(冰袋)带回实验室后使用动物组织DNA提取试剂盒(Takara产品)，按照操作说明进行DNA提取。
所有提取的DNA溶解于试剂盒随带的TE缓冲液中，经Nanodrop 2000检测，DNA浓度在20～400ng/μL之间，将纯度A260/A280＝1.8～2.0的样品稀释至20ng/μL放置于4℃冰箱备用，否则重新提取DNA直至达到要求。
本发明中还以山羊DNA为对照，山羊品种为徐淮山羊，山羊DNA为实验室留存样品。
实施例2、KAP8基因在中国美利奴细毛羊和萨福克羊中的表达差异
为了检测绵羊角蛋白联合蛋白KAP8对羊毛发育和特性的影响，选取中国美利奴细毛羊和萨福克羊代表细毛羊和粗毛羊，剪去左侧肩部羊毛，碘酒消毒，剪取皮肤组织并分离毛囊，各取样3只，立刻投入液氮中保存备用。采用Trizol试剂抽提绵羊皮肤组织的总RNA，经质量检测后放于-70℃冰箱中保存备用。
参照绵羊KAP8的GenBank序列X05639设计KAP8荧光定量PCR引物：
上游引物F：5′-CCAGCACCGTCTTCCCAGGTT-3′；
下游引物R：5′-CATAGCCGAAGCCATAGCCCAC-3′；
预期扩增产物长度为114bp，以GAPDH基因为内参，设计内参引物，序列如下：
F:5′CCATCACTGCCACCCAGAAGACT-3；
R:5′GCAGGTCAGATCCACAACGGACA-3′，预期扩增产物长度203bp。
绵羊皮肤组织cDNA采用M-MLV Reverse Transcriptase cDNA synthesis kit(Promega)合成，按照试剂盒说明书进行操作。对cDNA模版进行梯度稀释，每个梯度稀释十倍，共稀释五个梯度，采用已优化的体系进行RQ-PCR，以Ct值为纵坐标，以cDNA的模板数的对数值为横坐标，获得KAP8的相对定量标准曲线(图1)。每个样品重复三次，同时设阴性对照，KAP8基因的相对表达水平以2(Ct内参基因－Ct目的基因)进行计算，数据用SPSS 13.0软件进行统计分析。
结果表明，内参基因与目的基因RQ-PCR引物特异性较强，没有非特异性扩增(图2和图3)。KAP8基因的mRNA表达量和所测羊毛直径呈正相关，相关系数为0.948(P＝0.00)，在萨福克羊皮肤组织中的表达量显著高于在中国美利奴细毛羊皮肤组织中的表达量(P<0.01)，达到5.87倍，显著影响了羊毛的细度。因此，需要对KAP8基因表达调控进一步研究，以探究出现这种表达差异的分子机制，尤其是上游作为启动子区域的调控序列。
实施例3、KAP8基因全长cDNA克隆和转录起始点分析
为进一步研究KAP8基因调控序列，确认转录起始点，我们通过5′-RACE和3′-RACE技术对KAP8基因进行了全长cDNA克隆。
参照RACE试剂盒(GeneRacerTM Kit(Invitrogen)引物和说明书操作，用实施例2中获得的中国美利奴细毛羊的mRNA样品反转录成cDNA。KAP8基因中间片段参考Genbank中序列号X05639序列，采用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，由杭州擎科生物技术有限公司进行合成，引物序列如下表1所示：
表1：KAP8基因全长cDNA克隆引物表
Figure BDA0002470732560000081
按照试剂盒说明书，KAP8基因5′端RACE采用巢式PCR，第一轮PCR以合成的5′RACEcDNA为模板，分别利用试剂盒随带的5′RACE outer primer和设计引物rKAP8-R1为配对引物进行扩增，模板是稀释后的5′RACE cDNA；第二轮PCR以稀释后的首轮PCR产物为模板，利用5′RACE inner引物和其对应的rKAP8-R2引物为配对引物进行扩增。KAP8基因3′-RACE片段的克隆也依据说明书采用巢式PCR完成，过程基本与5′RACE相同。PCR扩增产物采用1.5％琼脂糖电泳检测后均采用载体克隆测序。
测序结果表明，KAP8基因3′端RACE PCR产物条带大小为419bp，5′端RACE PCR产物大小为148bp。拼接后KAP8基因全长cDNA长度为559bp，其中5′UTR和3′UTR长度分别为50bp和305bp，CDS区长度为189bp，包含起始密码子ATG和终止密码子TGA，编码62个氨基酸。转录起始点位于编码区上游50bp，起始点为碱基A。KAP8的RACE克隆获得559bp的序列，其结构如图4所示。
实施例4、KAP8基因上游区克隆和STR位点的发现
在实施例3确定转录起始点后，为了进一步分析转录起始点上游启动子序列及其可能存在的多态性差异，以Genbank中绵羊KAP8(序列号X05639)为参照序列，用GenomeWalking kit试剂盒(TaKaRa)，采用TAIL-PCR(热交错式不对称PCR，thermal asymmetricinterlaced PCR，TAIL-PCR)获得编码区上游序列，以此获得序列为DNA模板，并根据实施例3确定的转录起始点，设计引物(表2所示)，PCR扩增转录起始点(标记为+1)上游约2500bp的序列，直接或克隆测序并对比测序结果。
表2：KAP8上游序列克隆引物序列及位置表
Figure BDA0002470732560000091
Figure BDA0002470732560000101
PCR通用反应体系(20μL)为10xbuffer(含MgSO4)2.0μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，上下游引物各2.0μL(10μM)，Taq酶(5U/μL)0.4μL，去离子水9μL，DNA模版3μL。
优化后的PCR反应程序为：
95℃变性5min；95℃变性30s，(Ef1组退火温度54.5℃，Ff1组47.5，Gf1组52.5℃，Hf1组54.5℃)退火30s，72℃延伸35s为一个循环，共计30个循环；然后72℃延伸5min；结束后降温至4℃。
PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，用4S Red为核酸染料，凝胶成像系统拍照保存，阳性PCR产物送生物公司直接测序，用对应的PCR引物作为测序引物。若测序产物中出现未能识别碱基时则采用克隆测序。
对中国美利奴细毛羊和萨福克羊产物为868bp和720bp两组引物PCR扩增产物测序中，均发现有一段约7个碱基的片段插入-缺失多态性，这段差异为(CA)n重复序列，最后一个CA重复距离转录起始点为458bp。进一步分析发现，中国美利奴细毛羊的(CA)n重复数n为17或18，而萨福克羊的(CA)n重复数n为23或24。
实施例5、多个品种的KAP8基因上游区STR位点的分析
为了更多了解实施例4中发现的KAP8转录起始点上游约458bp处的CA重复序列以及在不同品种绵羊中的差异，参照实施例4，经对比PCR扩增条件和产物测序的结果，筛选了两组引物中的KAP8 Gf1-KAP8 Gr1为最佳引物，对中国美利奴细毛羊、萨福克羊、湖羊、中国美利奴细毛羊杂交肉用品系、中国美利奴细毛羊×湖羊杂交肉用多胎品系和山羊样品进一步分析，对获得的(CA)n重复序列做了更全面的比较。所有绵羊DNA样品获得的PCR产物与预期大小868bp基本吻合，而山羊DNA获得的产物相对绵羊获得产物较小，电泳条带位于绵羊条带下方(部分电泳结果见图5)。测序结果发现中国美利奴细毛羊(CA)n重复数n为17(图6)或18；萨福克羊的(CA)n重复数n为23或24(图7)；湖羊的(CA)n重复数n为24；山羊的(CA)n重复数n为5；鉴于这一重复序列的长度变化，山羊DNA扩增结果中比萨福克羊少了12或13个CA重复，因此PCR产物会更小，与所见电泳结果一致。而中国美利奴细毛羊杂交肉用品系的(CA)n重复数总和为23或24，但是呈现不连续的CA重复，被两个碱基TA或GA分成两段，数量为12+11或者13+11；中国美利奴细毛羊×湖羊杂交肉用多胎品系的(CA)n重复数总和同样为23或24，也是呈现不连续的CA重复，被两个碱基TA或GA分成两段，数量为12+11或者13+11(图8)。
综上实施例不难看出，当PCR扩增产物测序中(CA)n重复数n为17或者18时，待测绵羊为细毛羊品种，当n为23或者24时为非细毛羊品种；当CA重复序列为不连续重复时为细毛羊品种与非细毛羊品种杂交后代。因此，上述结果与细毛羊品种直接相关，(CA)n重复数直接可以用于细毛羊品种的鉴定和辅助选育。
以上实施例说明经过对KAP8的多重分析和筛选，本发明所发现的STR位点具有高度特异性，是细毛羊品种鉴定和杂交育种辅助选育的较佳选择。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 一种用于细毛羊辅助选育的分子标记及应用方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttgttaca taatctggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctgggtctt ataaagtcct 20

Claims (10)

1.一种用于细毛羊辅助选育的STR分子标记，其特征在于，所述的STR标记为绵羊KAP8基因上游区的CA碱基重复，其重复数在细毛羊与其他品种绵羊之间存在不同。
2.如权利要求1所述的STR分子标记，其特征在于，所述的STR标记，其CA碱基重复的重复数在5～24之间。
3.如权利要求1或2所述的STR分子标记，其特征在于，所述的STR标记位于绵羊KAP8基因上游区，最后一个CA重复距离KAP8转录起始点458bp。
4.权利要求1-3任一项所述的STR分子标记作为细毛羊选育，细毛羊、非细毛羊品种鉴定，细毛羊和非细毛羊杂交后代鉴定的DNA分子标记的应用。
5.一种用于检测权利要求1-3任一项所述的STR分子标记的引物对；其特征在于，所述的引物对，其序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1。
6.一种用于细毛羊选育方法，其特征在于，所述的方法是通过扩增引物检测权利要求1-3任一项所述的STR分子标记进行选育的；当PCR扩增产物DNA分子中(CA)n重复数n为17或者18时，待测绵羊为细毛羊品种，当n为23或者24时为非细毛羊品种；当CA重复序列数5≤n≤24且为不连续重复时为细毛羊品种与非细毛羊品种杂交后代。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：
1)从待测样品中获得基因组DNA；
2)将步骤1)所得的DNA利用检测STR标记的引物进行PCR扩增；
3)利用步骤2)所得的PCR扩增产物进行DNA测序，当PCR扩增产物DNA分子中(CA)n重复数n为17或者18时，待测绵羊为细毛羊品种，当n为23或者24时为非细毛羊品种；当CA重复序列数5≤n≤24且为不连续重复时为细毛羊品种与非细毛羊品种杂交后代。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的方法中使用的引物对的序列为SEQID NO.1和SEQ ID NO.1。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的PCR扩增体系如下：
总体积设定为20μL，包括：2.0μL的Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl2)，各0.1μL～3μL的特异性引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，浓度均为20μM)，0.2μL～4μL的dNTPmix(浓度2.5mM)，1.0μL～5μL基因组DNA(约40ng DNA)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2～1μL，加ddH2O至20μL；
PCR反应程序为：
95℃变性5min；95℃变性30s，47℃～55℃退火30s～40s，72℃延伸30s～40s为一个循环，共计28～35个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃保存备用。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的PCR扩增体系如下：
总体积20μL，其中Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl2)2.0μL，特异性引物对(SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，浓度均为20μM)，各1.0μL，dNTP mix(2.5μM)1.2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2μL(约含40ng DNA)，补水至20.0μL；
PCR反应程序为：
95℃变性5min；95℃变性30s，52.5℃退火30s，72℃延伸35s为一个循环，共计30个循环；然后72℃延伸5min；结束后降温至4℃。
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